全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-12
作者简介:李巍(1983-),女,硕士在读,研究方向:植物生长物质及化学调控
通讯作者:萧浪涛,教授,研究生导师
快速、准确地测定植物内源激素的含量对于深入理解植物生长发育机制、改善植物产量和质量等是非
常重要的。脱落酸(ABA)在植物衰老、细胞死亡和组织器官的脱落,体细胞胚的发生和发育、种子发育与休
眠、细胞分裂、组织器官的分化与形成等方面具有重要的调控作用。很多生物学基础研究领域,如基因表达
调控、生长发育与信号转导研究以及组织培养和遗传转化再生体系建立等都需要对 ABA含量进行高灵敏
测定。传统的植物激素测定方法如:生物试法[1,2]、气相色谱法(gas chromatography,GC)[3]、高效液相色谱法
(high performance liquid chromatography,HPLC)[4]、气-质联用(gas chromatography / mass spectrometry,GC/MS)
或液-质(liquid chromatography / mass spectrometry,LC/MS)联用 [5]、酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent
assay,ELISA)[6]和放射免疫(radioimmunoassay,RIA)[7]等方法。这些方法各有优点,也都存在明显的局限性,
其中,生物试法不能排除植物激素类似物和拮抗物的影响,专一性和灵敏度均较低;色谱法对样品纯化要
求高、样品需要量大且需要昂贵的仪器设备和较高的使用维护费用;酶联免疫法和放射免疫法抗体制备纯
化较为困难、测定周期长且很难排除植物激素前体物、结构类似物引起的交叉反应。此外,酶联免疫法重现
一种新型电流型免疫传感器的ABA最优测定条件研究
李巍 萧浪涛
(湖南农业大学湖南省植物激素与生长发育重点实验室,长沙 410128)
摘 要: 研究了一种基于纳米金/硫堇修饰金电极的ABA电流型免疫传感器的最优条件。该传感器利用硫堇是
HRP与电极之间电子传递媒介体的原理,将硫堇和酶标抗体共价吸附于电聚合纳米金的金电极上,用BSA封闭可能存
在的活性位点以避免非特异性吸附,最后加入ABA与一部分抗体结合降低电化学信号,用循环伏安法测得加入不同浓度
ABA前后电化学信号差值,从而测得ABA的含量。主要对使用此传感器测定ABA时的最优化条件进行了研究。
关键词: 电流型免疫传感器 纳米金 硫堇 辣根过氧化物酶 最优条件
Research of Optimization of ABA Determination Conditions of a
New Amperometric Immunosensor
Li Wei Xiao Langtao
(Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Development,Hunan Agricultur l Uni rsity,Changsha 410128)
Abstract: The optimization of ABA determination conditions of an amperometric immunosensor based on gold
nanoparticle(nano-Au)/thionine modified gold electrode for the determination of abscisic acid(ABA)was res arched. The
sensor was prepared by the principle of the oxidation reaction of thionine by H2O2 which c alyzed by horserad sh
peroxidase(HRP) ,and thionine and ABA antibody labeled with HRP was adsorbed on electrode surface by covalence.
Bovine serum albumin(BSA)was employed to block the possible remaining active sites of the thionine monolayer to
avoid the non-specific adsorption,and the electrical signal determinated by cyclic voltammetry(CV).Ass y conditions were
optimized including the proportion of HRP lableled ABA antibody and thionine,the incubation time,the pH of working
buffer,the concentration of the H2O2.
Keywords: Amperometric immunosensor Gold nanoparticle(nano-Au) Thionine(Thi) Horseradish peroxidase
(HRP) Optimization determination conditions
2008年第3期
性较差,放射免疫法还存在放射性废物处理等问题。因而研究出快速、精确和廉价的方法测定 ABA含量是
国内外同行共同关注的焦点。
近年来,很多国内外研究者对传感器这种非常有发展前景的分析仪器越来越表现出浓厚的兴趣[8,9]。
很多免疫传感方法已经越来越广泛地被运用,但是带来了一系列的严重问题:辐射危害、错综复杂的操作
步骤和昂贵的仪器费用等[10,11]。因而,集操作简单、快速、精确、高灵敏、廉价和轻巧等众多优点于一身的电
化学安培免疫传感器受到了极高的关注[12,13]。
目前,以无机毫微型颗粒为代表的一批先进的材料成为材料学界研究的重要领域。这种高科技材料在
光学、点化学、传感器研究领域表现出很高的科研和经济价值[14,15]。此外,基于纳米金内在强有力的吸附特
性和生物相溶性,它已经被成功地运用于电化学免疫传感测定和 DNA分析[21~23]。
聚合纳米金这种静电吸附相反电荷物质的特性最早被 Decher和 Hong[24]发现,他们利用这种纳米金得
这种特性制备了一种电流型免疫传感器。这种方法于是成为了构建电流型免疫传感器的最简单、方便、广
泛的方法,并且为电流型免疫传感器的构建在理论和实践上打开了非常广阔的前景。主要对运用这种原理
制备的一种新型传感器的最优化条件进行了研究。以期为运用此新型免疫传感器测定植物内源激素奠定
更坚实的基础。
1 材料和方法
1.1 试剂
ABA购于 Sigma-Aldrich公司;ABA抗体(南京农业大学提供);硫堇、H2O2等分析纯试剂购于上海生化
试剂公司;HRP;醋酸铅购于哈尔滨化学试剂公司;BSA购于北京鼎国生物试剂公司;所有其他试剂均为分
析纯试剂;实验用水均为二次去离子水。
1.2 仪器
CHI760C型电化学工作站(上海辰华仪器公司),MP230酸度计(瑞士 MeterToledo公司),AB204-S电
子天平(瑞士 MeterToledo公司),BRANSONIC200超声清洗仪(德国 BRANSONULTRASCHALL公司),CS
501-SP型超级数显恒温器(重庆四达实验仪器厂制造).
1.3 传感器制备
将金电极首先在 6号金相砂纸上抛光,再分别在浸有 1.0、0.3和 0.05μmAl203悬浊液(Buehler)的鹿皮
上抛光成镜面。用二次水冲洗干净后,再分别在乙醇和二次水中超声 3min。将干净的裸电极(工作电极)、
饱和甘汞电极和铂丝对电极通过三电极系统在纳米金溶液中进行安培循环扫描,将纳米金电聚合于金电
极表面。洗净,吹干。然后在电极表面加 16μl酶标抗体和硫堇混合物,37℃封闭温育 1h,洗净,吹干。此时
硫堇和酶标抗体就通过纳米金的静电吸附作用固定在了修饰电极表面。随后在电极表面加 16μlBSA,37℃
封闭温育 30min,以封闭电极上非特异性吸附位点。先在 5ml0.1mol/LpH7.0PBS缓冲液中用循环伏安法
(cyclicvoltammetry)进行测定,然后在含有 H2O2,0.1mol/LpH7.0PBS缓冲液中在同样条件下进行测定,最
后在电极表面加 16μl抗原 ABA37℃封闭温育 40min后,在同样条件下进行 2次循环伏安法扫描。
2 实验结果
用此传感器测定 ABA最关键的影响因素包括混合物中硫堇与酶标抗体的比例、混合物培育时间和底
液 pH值、底液中 H2O2的浓度等,对此研究如下。
2.1 混合物中硫堇与酶标抗体的比例对传感器的影响
依次对不同比例的硫堇与酶标抗体混合物进行循环伏安扫描,对电极的响应性能做了研究。图 1是不
同比例的硫堇与酶标抗体与响应电流的关系图。当硫堇在混合物中比例小于 75%时,随着硫堇比例增大响
应电流逐渐增大,当硫堇大于 75%时,随着硫堇比例增大响应电流趋于平缓。说明在混合物中硫堇与酶标
抗体比例为 3:1最适合混合物的吸附固定。因此选择此比例。
李巍等:一种新型电流型免疫传感器的ABA最优测定条件研究 187
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
2.2 混合物培育时间对传感器的影响
图 2所示为不同混合物培育时间对传感器的影响。研究了混合物培育时间从 0.25h到 2h,发现随着培
育时间的增加,电流响应逐渐增大,到 1h时电流响应达到最大。1h后随着培育时间的增加电流响应趋于
稳定。因此,选择 1h为最佳混合物培育时间。
图 1 混合物中硫堇与酶标抗体的比例对传感器的影响 图 2 混合物培育时间对传感器的影响
2.3 底液 pH值对传感器的影响
对底液最适合 pH值也进行了研究。如图 3所示,随着底液 pH值从 6.2到 8.2变化,峰电流值不断增
大,直到 pH值增加到 7.0,峰电流值达到最大,随后峰电流值逐渐减小。这可能是由于硫堇的质子化效应
所引起,同时酶在高 pH值环境中容易变性,抗原抗体复合物在低 pH值环境中容易分解[25],因此底液最适
合 pH值为 7.0。
2.4 底液中 H2O2浓度对传感器的影响
图 4所示为底液中 H2O2浓度从 0.2mol/L~1.6mol/L对传感器电流响应的影响。电流响应一直增大直到
底液 H2O2浓度达到 1.2mol/L电流响应最大,随后逐渐降低。可能是由于在底液 H2O2浓度为 1.2mol/L时固
定在电极表面的 HRP酶活达到最高。因此,选择 1.2mol/L为底液最适 H2O2浓度。
图 3 底液 pH值对传感器的影响 图 4 底液中 H2O2浓度对传感器的影响
3 讨论
从混合物中硫堇与酶标抗体的比例、混合物培育时间、底液 pH值和底液中 H2O2的浓度等几个影响新
型传感器性能的重要方面进行了探索,获得了新型传感器的最优化实验条件。研究表明,混合物中硫堇与
酶标抗体比例为 3:1最适合混合物的吸附固定,1h为最佳混合物培育时间,底液最适合 pH值为 7.0,底液
最适 H2O2浓度为 1.2mol/L。该传感器表现出高灵敏性、良好的重现性和稳定性,并避免在溶液中加入电子
传递媒介体,是相对于传统方法来说更简便更廉价的好方法。研究出最适条件将为更进一步研究新型电流
型免疫传感器的电化学特性、制备标准曲线和测定植物实样中植物激素含量等提供最有力的保证。
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