全 文 ：DOI:10． 3724 /SP． J． 1096． 2013． 30084
基于噬菌体展示抗体的电化学发光免疫传感器检测
相思子毒素研究
刘 冰 童朝阳* 刘 威 郝兰群 穆晞惠 黄启斌
(防化研究院，国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京 102205)
摘 要 以多克隆抗体包被磁性微球制备捕获探针，以表面负载大量三联吡啶钌标记物的噬菌体展示抗体
为发光探针有效放大信号，成功建立了相思子毒素电化学发光免疫传感检测方法。利用本方法检测相思子毒
素，浓度在 0． 005 ～ 100 μg /L范围内与电化学发光强度呈良好的对数线性关系，拟合方程为 lgY = 0． 701lgX
+1． 767(R=0． 9964，N=7，p＜0． 0001) ，检测限达 0． 005 μg /L(S /N = 3)。与采用单克隆抗体制备标记探针相
比，检测灵敏度提高 20 倍，可用于相思子毒素的痕量检测。
关键词 噬菌体展示抗体;相思子毒素;电化学发光;免疫传感器
2013-01-23 收稿;2013-04-17 接受
本文系总装预研课题(No． 404070205)资助项目
* E-mail:billzytong@ 126． com
1 引 言
电化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)免疫传感器检测蛋白类生物大分子多是以传感器表面
固定抗体为捕获探针，以发光标记物如联吡啶钌［Ru(bpy)2+3］标记抗体为发光探针，在靶标存在的情况
下，形成“捕获探针-靶标-发光探针”复合物，在电极表面发生 ECL 反应，以此测定靶标浓度［1 ～ 5］。抗体
活性以及标记物的量将直接影响检测的灵敏度。对于传统抗体，分子表面可供标记的基团有限，而且多
位点标记也可能影响其结合活性，这限制了灵敏度的进一步提高。
噬菌体展示抗体是通过噬菌体展示技术获得的一种可溶性抗体片段或是表面展示有抗体片段的噬
菌体［6］，对于后者，其表面除了展示的抗体片段外就是大量的衣壳蛋白。以展示有单链抗体(Single
chain variable fragments，scFv)的 M13 噬菌体为例，M13 为丝状，长约 900 nm，宽约 8 nm，衣壳约由 2800
拷贝的 5 kDa的主要衣壳蛋白 pⅧ组成［7］，scFv融合表达在位于一端的约 5 拷贝的次要衣壳蛋白 pⅢ中
的 1 个拷贝上。若进行标记，会有更多的标记物连接在数量庞大的衣壳蛋白上［8］，展示抗体仅仅是“躲
在”一端的一个小角落里，从而被标记上较少的标记物，可最大限度避免多位点标记造成的活性降低或
消失。因此，噬菌体展示抗体做标记探针能大大增加标记物数量，而又最小程度影响结合活性，从而起
到放大信号作用。
本研究以剧毒生物毒素相思子毒素(Abrin)为检测目标，以 Abrin多克隆抗体(多抗)包被的磁微球
为捕获探针，以 Ru(bpy)2+3 标记的 Abrin噬菌体展示抗体为发光探针，将磁性微球分离富集与噬菌体展
示抗体大量负载发光标记物放大 ECL信号相结合，建立了一种检测 Abrin的新方法，有效放大了检测信
号，提高了检测灵敏度。
2 实验部分
2． 1 仪器与试剂
磁免疫电化学发光传感检测平台(本实验室与西安瑞迈分析仪器有限责任公司联合研制) ，MPI-E
型电化学发光检测仪(西安瑞迈分析仪器有限责任公司) ;BIOMATE 3S紫外可见分光光度计(美国赛默飞
世尔科技) ;HS-3垂直混合器(宁波新芝生物科技股份有限责任公司) ;磁分离架(美国 Promega公司)。
三联吡啶钌 N-羟基琥珀酰亚胺酯(Ru(bpy)2+3 -NHS ester，美国 Sigma 公司) ，活化生物素(Biotin-
NHS ester，美国 Sigma公司) ;链亲和素包被磁微球(New England BioLabs 公司，直径 2． 0 μm) ，Abrin、
第 41 卷
2013 年 9 月
分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第 9 期
1449 ～ 1453
Abrin多抗、Abrin单抗、Abrin噬菌体展示抗体、蓖麻毒素(Ricin)、葡萄球菌肠毒素 B(SEB，本实验室) ;
发光检测液与 CleanCell清洗液(北京百隆腾科技发展有限公司) ;牛血清白蛋白(BSA，上海国药集团有
限公司) ;磷酸盐缓冲溶液(PBS)用 0． 1 mol /L Na2HPO4，0． 1 mol /L KH2PO4 和 0． 1 mol /L KCl 配制而
成;实验用水均为去离子水，其它所用化学品和试剂均为分析纯。
2． 2 实验方法
2． 2． 1 发光探针制备 按抗体标记方法［9，10］稍有改动，将 1 mL Abrin 噬菌体展示抗体(M13KO7 噬菌
体展示，2． 5 × 10#7 mol /L)加入到 500 μL 碳酸盐缓冲液(0． 05 mol /L，Ph 9． 6)中，加入 300 μL
Ru(bpy)2+3 -NHS ester(8． 76×10#
4 mol /L) ，再加入 200 μL 二甲基亚砜(DMSO) ，37 ℃ 避光振荡孵
育 12 h。超滤除去未结合的 Ru(bpy)2+3 -NHS ester，用 PBS(0． 01 mol /L，Ph 7． 4)重悬至 1 mL备用。
2． 2． 2 捕获探针制备 (1)Abrin多抗生物素化 用 1 mL DMSO 溶解活化生物素 1 mg，向 1 mL Abrin
多抗溶液(1 mg /mL)中加入 120 μL 活化生物素溶液(即含活化生物素 120 μg) ;在室温下持续搅拌，保
温 2 ～ 4 h;加入 9． 6 μL 1 mol /L NH4Cl(每 25 μg 活化生物素加 1 μL) ，在室温下搅拌 10 min;超滤除去
未结合的活化生物素，以 PBS重悬至 1 mL。(2)磁微球捕获探针构建 将生物素化的 abrin多抗 20 μL
加入 1 mL(1 g /L)亲和素包被的磁微球中，室温振荡孵育 1 h，置于磁分离架上用 PBST(含 0． 15%
Tween-20 的 PBS)清洗两次，PBS清洗两次除去未结合的 Abrin 多抗，余下结合了 Abrin 多抗的磁微球，
加 PBS重悬至 1 mL，4 ℃保存备用。
2． 2． 3 ECL检测 将 Abrin多抗包被的磁微球 50 μL与 50 μL样品混合，室温振荡孵育 15 min，置于
磁分离架上用 PBS清洗两次，再加入 50μL 标记探针混合后室温振荡孵育 1 h，结合磁分离用 PBS 清洗
两次，用发光检测液重悬后加入检测池，磁微球复合物磁铁作用下沉积在工作电极表面，在给定工作电
极与参比电极之间恒定电压 1． 4 V 下，标记在噬菌体上的 Ru(bpy)2+3 就和发光检测液中的三丙胺
(TPA)发生 ECL反应，光信号由光电倍增管(PMT)检测。整个检测过程如图 1 所示。ECL 反应结束
后，将磁铁位置移至离电极最远处，先用去离子水、CleanCell清洗液结合电化学阶跃脉冲清洗检测池与
电极，再用去离子水和 ProCell发光检测液冲洗，直至 ECL值恢复至基线水平(空白信号)后进行下一轮
检测。
图 1 基于标记噬菌体的 abrin电化学发光检测示意图
Fig． 1 Model of ECL detection on abrin based on labeled phage
a． 亲和素包被磁微球;b． 生物素化多抗;c．相思子毒素;d． 噬菌体展示抗体;e． 三联吡啶钌。
a． Avidin-coated magnetic microbead;b． Biotinylated poly clonal antibody (pcAb) ;c． Phage-displayed antibod-
y;d． Abrin;e． ［Ru(bpy)2+3 ］．
3 结果与讨论
3． 1 发光探针性质
3． 1． 1 发光探针紫外-可见光谱 如图 2 所示，Abrin 噬菌体展示抗体经标记后其紫外-可见光谱发生
改变，a为 abrin 噬菌体展示抗体光谱图，在 269 nm 处有一个特征吸收峰，因为噬菌体颗粒为衣壳蛋白
0541 分 析 化 学 第 41 卷
内包裹着核酸，269 nm处反映的是 DNA的吸收峰;b 为标记物 Ru(bpy)2+3 -NHS ester 的图谱，联吡啶钌
在 220 ～ 600 nm 之间有 3 个特征吸收峰，其中可见光 457 nm 处的吸收对应于金属 Ru?到 bpy 配
体 dπ→π* 电荷跃迁，紫外区 287 nm处的吸收是以配体为中心的 π→π* 跃迁，紫外区的另一个吸收峰
在 245 nm处，也是金属 Ru?到 bpy配体的 dπ→π* 电荷跃迁［11］;c为 Ru(bpy)2+3 标记 Abrin 噬菌体展
示抗体的光谱图，位于 285 nm吸收峰应对应于联吡啶钌 287 nm 的吸收峰，254 nm 处吸收应对应于联
吡啶钌 245 nm处的吸收，稍红移，457 nm处为联吡啶钌的特征吸收，这表明 Ru(bpy)2+3 -NHS ester 已经
标记到噬菌体展示抗体上。
3． 1． 2 发光探针的电化学发光性质 在发光检测液中，利用循环伏安法对标记探针进行扫描，结果如
图 3 所示。可见，Ru(bpy)2+3 标记在噬菌体展示抗体上，仍然有较强的电化学发光信号，峰电位保持不
变，仍在 1． 4 V 附近，保持了 Ru(bpy)2+3 的电化学发光特性，标记 Abrin 噬菌体展示可以用作电化学发
光标记探针。
图 2 标记探针的紫外-可见(UV-Vis)光谱
Fig． 2 UV-Vis spectra of labeled probe
图 3 标记探针的电化学发光性质
Fig． 3 ECL profile of labeled probe
3． 2 孵育时间的确定
因 Abrin单链抗体展示于 M13 噬菌体表面，且 M13 较大，且为长丝状，其运动相对抗体来说非常缓
慢，又因 scFv位于一端，这降低了 M13 与 Abrin 接触的几率，有必要对孵育时间进行考察。Abrin 浓度
为 50 μg /L时，在加入 Ru(bpy)2+3 标记的 Abrin噬菌体展示抗体后分别孵育 10，20，30，40，50，60，70
和 80 min，随孵育时间增加，电化学发光强度的变化见图 4。孵育时间小于 60 min 时，随孵育时间增加
发光强度逐渐增强;孵育时间大于 60 min时，发光强度趋于平稳。说明室温下的 M13 参与的结合反应
在 60 min后基本达到饱和。因此，加入标记探针后孵育时间定位 60 min。
3． 3 传感器性能
3． 3． 1 线性范围与检测限 图 5 为 ECL 强度(3 次重复平均值，扣除基线值)随 Abrin 浓度变化的情
况，可见，随 Abrin 浓度增加，ECL 值逐渐增加，在 Abrin 浓度达 100 μg /L 时趋于饱和。在 0． 005
～ 100 μg /L 范围内电化学发光强度(Y)的对数与 Abrin 浓度(X)的对数呈线性关系，拟合方程
为 lgY=0． 701lgX+1． 767(R=0． 9964，n = 7， p ＜ 0． 0001)。传感器对 Abrin 检测的线性范围
是 0． 005 ～ 100 μg /L，当 Abrin浓度低于 0． 005 μg /L 时，电化学发光强度基本处于基线水平，因此检出
限为 0． 005 μg /L(S /N=3)。
以标记 Abrin单克隆抗体(单抗)为发光探针，对 Abrin 进行检测，线性范围为 0． 1 ～ 1000 μg /L，检
出限为 0． 1 μg /L。可见相对于标记 Abrin 单抗作为发光探针来说，以 Abrin 噬菌体展示抗体作为发光
探针检测灵敏度提高 20 倍，这主要是因为 M13 噬菌体表面大量的衣壳蛋白提供了大量标记物的修饰
位点，这样每个夹心免疫复合物携带的 Ru(bpy)2+3 要比用传统抗体做发光探针形成的复合物多，在
Abrin浓度相同的情况下，发光活性更强，这与实验结果相符。线性范围上限(100 μg /L)比以单抗作为
发光探针低，可能因为 M13 自身造成的空间位阻，虽然 scFv 展示于 M13 的一端，但由于磁微球上包被
的是多抗，结合 Abrin以后，M13 的结合位点趋向并不一致，又因为 M13 为长丝状，已经结合在磁微球表
1541第 9 期 刘 冰等:基于噬菌体展示抗体的电化学发光免疫传感器检测相思子毒素研究
图 4 孵育时间对电化学发光强度的影响
Fig． 4 Effect of binding time on ECL intensity
图 5 电化学发光强度与 Abrin浓度的关系
Fig． 5 Relationship between ECL intensity and concentra-
tion of Abrin面的 M13 可能会覆盖其它结合位点，从而使结合量
有所下降。本方法的检测灵敏度方面远高于已报道的 ELISA法［12 ～ 15］、压电免疫传感器［16］、胶体金免疫
层析［17］、银增强显色免疫层析［18］及 Garber等［13］建立的固相平板 ECL 等检测方法，可用于 Abrin 的痕
量检测。
3． 3． 2 重现性 重现性是评价传感器性能的重要指标。在线性范围内，Abrin 浓度由低到高 7 个点
(0． 005，0． 1，1，10，50 和 100 μg /L)的 ECL 值对应的 RSD 分别为 11． 0%，9． 7%，9． 5%，9． 3%，
9． 0%，8． 8%和 7． 9%(n=3) ，除检出限浓度(0． 005 μg /L)ECL值 RSD为 11%外，其余均在 10%以内。
传感器不仅灵敏度高而且具有较好的重现性。
3． 3． 3 特异性 传感器对空白样品缓冲液(PBS) ，100 μg /L牛血清白蛋白(BSA)、100 μg /L葡萄球菌
肠毒素 B(SEB)与 100 μg /L的蓖麻毒素(Ricin)的 ECL 响应值都在基线水平，对包括空间结构极其类
似的毒素 Ricin在内的非目标蛋白均不响应，说明此传感器对 Abrin检测有很强的特异性。磁微球表面
固定化多抗作为捕获探针与噬菌体展示抗体作为发光探针对Abrin的夹心双重特异性识别，以及磁性
表 1 Abrin模拟样品测定(n=3)
Table 1 Determination results of recovery(n=3)
样品
Sample
加入量
Added
(mg /L)
测定值
Found
(mg /L)
回收率
Recoverya
(%)
水样 Water 50 48． 5 97． 0±7． 2
土壤 Soil 50 47． 3 94． 6±6． 5
尿液 Urine 50 46． 5 93． 0±6． 7
a平均值±标准偏差(n=3) (mean±SD，n=3)。
微球的分离富集作用保证了传感检测的高度特
异性。
3． 4 对 Abrin模拟样品的测定
研究了传感器的实际应用性能，采用本方
法对水样、土样、尿液等模拟样品进行了检测
(表 1)。结果表明，对于模拟样品检测，本方法
具有较好的回收率和重现性。
4 结 论
利用展示有 Abrin单链抗体的 M13 噬菌体作为载体构建发光标记探针，在 M13 噬菌体表面固载大
量的三联吡啶钌信号分子，有效放大了发光信号，成功建立了高灵敏、高特异性的夹心式新型电化学发
光免疫传感检测方法。本方法较使用单抗作标记探针在灵敏度上提高 20 倍，又由于噬菌体展示抗体相对
传统抗体的高度稳定性，可依此为基础发展生物毒素的现场痕量检测方法以及开发性能稳定的试剂盒。
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Determination of Abrin by Electrochemiluminescence
Immunosensor Based on Phage-displayed Antibody
LIU Bing，TONG Zhao-Yang* ，LIU Wei，HAO Lan-Qun，MU Xi-Hui，HUANG Qi-Bin
(Research Institute of Chemical Defense，State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian，Beijing 102205，China)
Abstract A new efficient immunoassay strategy for the determination of Abrin was developed． The assay
consisted of a double antibody sandwich format in which immobilized polyclonal antibody (pcAb)was used for
capture probe，and Ru(bpy)32+ labeled phage-displayed antibody for electrochemiluminescence(ECL)probe
to amplify the ECL signal． A linear relationship between ECL intensity and the concentration of Abrin in the
range of 0． 005-100 μg /L was obtained． The linear regression equation was lgY = 0． 701lgX
+1． 767 (R=0． 9964，n= 7，p＜0． 0001)with a detection limit of 0． 005 μg /L (S /N = 3)． In comparison
with the ECL probe based on monoclonal antibody (mcAb) ，this method gave a 20-fold better sensitivity in
Abrin detection． Due to the low detection limit，this method holds great promise in toxin trace detection．
Keywords Phage-displayed antibody;Abrin;Electrochemiluminescence;Immunosensor
(Received 23 January 2013;accepted 17 April 2013)
3541第 9 期 刘 冰等:基于噬菌体展示抗体的电化学发光免疫传感器检测相思子毒素研究