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表 4。由表 3、表 4 可见，根据综合评价标准，A ＞
(B = C)＞ D。因此，最佳提取工艺为 A2B1C2D1。
即 8 倍量的 50%乙醇提取 1 次，每次提取 1. 5 h。
表 4 方差分析结果
指标 方差来源 偏差平方和 自由度 F比 F临界值
综合评价 A 0. 331 2 2. 591 4. 460
B 0. 043 2 0. 337 4. 460
C 0. 096 2 0. 751 4. 460
D 0. 041 0. 321 4. 460
误差 0. 510
注:F0. 1(2，2)= 9. 0
2. 3 验证试验 按照上述优选工艺，提取 3 批药
材，计算柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷含量(见表 5)。
表 5 验证试验结果
序号 柚皮苷 新橙皮苷 橙皮苷
1 2. 333 0. 904 1. 423
2 3. 061 0. 618 2. 754
3 3. 902 0. 723 3. 445
3 讨论
本试验对枳实中 3 种主要有效成分—柚皮
苷、新橙皮苷、橙皮苷的提取工艺进行了优化。采
用正交设计试验的方法，确定了乙醇浓度、提取时
间、提取次数以及乙醇用量 4 个影响因素，确定了
最佳提取工艺为 8 倍量的 50%乙醇提取 1 次，每
次提取时间为 1. 5 h。结果表明，该方法提取枳实中
的 3种二氢黄酮苷类化合物，工艺简单、提取率高、
操作容易，为枳实的工业生产提供了合理的依据。
参考文献:
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收稿日期:2012 － 05 － 16
作者单位:1. 淮海工学院化学工程学院，江苏 连云港 222005;
2. 淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏 连云港
222005;3. 中国矿业大学化学工程学院，江苏 徐州 221116
基金项目:连云港市科技攻关项目(工业) (2009CG0904)
* 通信作者
宝华玉兰种子提取物对 NF － κB及 IκBα表达的抑制作用
宋晓凯1* ，许瑞波1，曹志凌1，郭 雷2，李 靖3，李志华3
［摘 要］ 目的 探讨宝华玉兰种子提取物对核转录因子-κB(NF-κB)、核转录因子-κB 抑制蛋白 α
(IκBα)表达的抑制作用机制。方法 使用宝华玉兰种子提取物处理人肝癌细胞 HepG2 后，用 Western blotting
法检测 NF-κB 及 IκBα蛋白的表达变化情况。结果 宝华玉兰种子提取物对 IκBα的磷酸化及降解有抑制作用。
宝华玉兰种子提取物可有效抑制 NF-κB 介导的基因转录。结论 宝华玉兰种子提取物可能通过抑制 IκBα磷酸
化及降解，阻断 NF-κB 活性，进而抑制 COX-2 而发挥其抗炎和抗肿瘤作用。
［关键词］ 宝华玉兰种子提取物;IκBα;NF-κB;COX-2
Suppressing effect of extract from seeds of Magnolia zenii． on expression of NF-κB
and IκBα SONG Xiao-kai1* ，XU Rui-bo1，CAO Zhi-ling1，GUO Lei2，LI Jing3，LI Zhi-hua3(1. School of Chem-
ical Engineering，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China;2. Jiangsu Key Lab of Marine Biotech-
nology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China;3. School of Chemical Engineering，China Univer-
sity of Mining and Technology，Xuzhou 221116，China)
［Abstract］ Objective To study the suppressing effect molecular mechanism of extract from seeds of Magnolia
zenii．(ESMZ)on NF-κB and IκBα．Methods Human hepatoma cancer cell HepG2 was treated with ESMZ． Western
blot analysis was used to detect phospho-IκBα and NF-κB protein． Results ESMZ had significant suppressing effect
on the phosphorylation and degradation of IκBα，and it could effectively suppress gene transcription mediated by NF-κB
in HepG2 cell． Conclusion ESMZ can play a role of anti-inflammation and anti-carcinogenesis in human hepatoma
cancer HepG cell line，by suppressing the phosphorylation and degradation of IκBα，blocking NF-κB activation and then
restraining COX-2．
Key words:Extract from seeds of Magnolia zenii．;IκBα;NF-κB;COX-2
宝华玉兰(Magnolia zenii Cheng．)为木兰科 (Magnoliaceae)木兰属的落叶小乔木，为中国特有
植物，花、果均可入药。在 2004 年《中国植物红色
名录》中被列为国家级极危种。有关宝华玉兰的
研究相对较少，仅见对其外部形态、花粉特征、自
然分布状况及群落学调查的简要记录［1-3］。近期，
本实验室对宝华玉兰树皮挥发性成分进行了 GC-
·921·实用药物与临床 2013 年第 16 卷第 2 期 Practical Pharmacy And Clinical Remedies，2013，Vol． 16，No． 2
DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.2013.02.010
MS 分析研究，共鉴定出 50 种成分［4］。为系统研
究宝华玉兰的抗炎抗肿瘤作用，本实验室对宝华
玉兰种子总提取物进行了 NF-κB、IκBα 表达的抑
制作用机制的研究。
1 材料和方法
1. 1 试剂 抗磷酸化 IκBα 抗体、NF-κB 抗体及
人肝癌细胞 HepG2，所有实验用试剂等均由南京
凯基生物科技有限公司提供(均为分析纯)。阳性
对照:Taxol(紫杉醇，批号:20090403，太极集团四
川太极制药有限公司生产，含量:10 μg /mL)。宝
华玉兰全株植物于 2010 年 6 月采自江苏省句容市
茅山镇永兴苗木场(系人工种植) ，经淮海工学院
宋晓凯教授鉴定为木兰科木兰属植物宝华玉兰。
1. 2 宝华玉兰种子总提取物(Extract from seeds
of Magnolia zenii．，ESMZ)的制备 将干燥宝华玉
兰种子置不锈钢容器，加相当于药材 8 倍量体积
工业酒精浸泡 4 个月，提取 3 次，合并提取液，过
滤，回收酒精成流浸膏状，60 ℃下水浴上蒸发至无
乙醇味，冷却后得褐色半固体提取物，待用。以少
量 DMSO 溶解 ESMZ，并仍以 DMSO 为溶剂，制成
6. 25、12. 5、25 μg /mL 的溶液(依次为低、中、高浓
度组) ，于 － 20 ℃保存。
1. 3 细胞培养 人肝癌细胞 HepG2 生长在含有
10%牛血清、100 U /mL 青霉素、100 U /mL 链霉素
的 RPMI 1640 中。于 37 ℃、5% CO2 条件下培养。
1. 4 Western blotting 法检测 NF-κB 及 IκBα 溶
解 20 μg 蛋白，使用 10%变性 SDS(十二烷基磺酸
钠)电泳分离。转蛋白到尼龙膜上。使用特异的
抗体和过氧化物酶连接的 IgG 抗体，通过免疫染
色发现磷酸化 IκBα。用增强化学发光法(ECL)
观察 NF-κB 及 IκBα蛋白带。
2 结果
2. 1 ESMZ 能明显抑制 NF-κB 蛋白的表达 在
HepG2 细胞，ESMZ 可抑制 IκBα 的磷酸化和降
解，进而抑制 NF-κB 介导的转录。由图 1(b)可
见，高、中浓度的 ESMZ 对 NF-κB 蛋白表达的抑制
作用均比低浓度 ESMZ 的抑制作用强，表明高、中
浓度的 ESMZ 对 NF-κB 介导的转录活性抑制作用
均强于低浓度 ESMZ 的抑制作用。
2. 2 ESMZ 抑制 IκBα 的磷酸化和降解 NF-κB
移位到核内首先要通过 IκBα 的磷酸化和蛋白降
解。为确定 ESMZ 是否引起 IκBα 降解，使用
Western blotting 法，用不同浓度 ESMZ 处理细胞
后，测量 IκBα的水平。如图 1(c)可见，不同浓度
的ESMZ处理HepG2细胞后，以浓度依赖方式导
致 IκBα 蛋白表达明显降低。用 ESMZ 处理
HepG2 细胞后，明显引起 IκBα磷酸化。
图 1 经 ESMZ 处理后的 NF-κB 及 IκBα的蛋白表达变化情况
注:由左至右为:空白对照、阳性对照、低浓度组、中浓度组、高浓度组
3 讨论
NF-κB 激活在炎症反应和控制细胞增殖的发
病机制中起着重要的作用。故环氧化酶-2(COX-
2)特异抑制剂的抗炎和抗肿瘤作用可能部分通过
抑制 NF-κB 而发挥作用。大部分 NF-κB 活化抑
制剂通过抑制 IκBα 激酶活性，随之抑制 IκBα 的
磷酸化和降解［5-7］。
本实验结果首次证明，ESMZ 可以下调 NF-κB
介导的转录活性，对 IκBα的磷酸化和降解均有作
用，IκBα蛋白的表达水平随 ESMZ 浓度的增加而
逐渐下降。ESMZ 通过阻止 IκBα 的磷酸化和降
解而阻断 NF-κB 信号通路，抑制 NF-κB 介导的转
录。提示 ESMZ 可能是部分通过对 IκBα /NF-κB
通路的阻断，抑制 NF-κB 活化而发挥抗炎和抗肿
瘤作用。
致谢:南京凯基生物科技有限公司协助完成
一部分实验工作，在此致谢。
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·031· 实用药物与临床 2013 年第 16 卷第 2 期 Practical Pharmacy And Clinical Remedies，2013，Vol． 16，No． 2