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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
IκBα缺失突变体真核表达载体的构建、
表达及其生物活性检测
黄思超 1 杜军 2 邱胜红 1 徐俊 1 傅刘鹏 1 马锦珊 1 蔡绍晖 1
(1暨南大学药学院 ,广州 , 510632; 2中山大学药学院 ,广州 510006)
　　摘 　要 : 　旨在构建缺失 N端前 36个氨基酸的 IκBα突变体真核表达载体 ,并对其表达及生物学活性进行检测。从人源
子宫颈癌细胞 HeLa中提取总 RNA,利用 RT2PCR的方法获得 IκBα缺失突变体的 cDNA,将其克隆至真核表达载体 pcDNA3.
1 /myc2H is A中 ,构建重组载体 pcDNA3. 12IκBαΔN。通过 PCR方法、N coⅠ酶切以及核酸测序分析对其进行鉴定 ;采用 W estern
B lot检测 IκBα缺失突变体蛋白在 HeLa细胞中的表达。将 pcDNA3. 12IκBαΔN和 pNF2κB2Luc共转染 HeLa细胞 ,经 TNF2α诱
导后 ,利用萤光素酶报告系统来检测重组载体对 NF2αB的抑制活性。结果表明 ,经 PCR方法、N coⅠ酶切鉴定及核酸测序分析
后 ,证实成功构建了重组载体 pcDNA3. 12IκBαΔN; IκBα缺失突变体蛋白在 HeLa细胞中高效表达 ,并对 NF2κB有显著的抑制
活性 ( P < 0. 01)。因此 ,真核表达载体 pcDNA3. 12IκBαΔN构建成功 ,为一步研究 NF2κB信号传导通路及其相关疾病提供有效
的分子工具。
关键词 : 　 IκBα 缺失突变体 载体构建 NF2κB
Construction and Expression of Deletion
M utant of IκBαand Its Bioactiv ity
Huang Sichao1 Du Jun2 Q iu Shenghong1 Xu Jun1 Fu L iupeng1 Ma J inshan1 Cai Shaohui1
(1 College of Pharm acy, J inan University, Guangzhou 510632;
2 School of Pharm aceutical Science, Sun Yat2sen University, Guangzhou 510006)
　　Abs trac t: 　 It was to construct a eukaryotic exp ression vector of IκBα mutant deleted N2term inal am inos from 1 to 36, and to i2
dentify its exp ression and bioactivity. Total RNA was extracted from human cervical cancer HeLa cells, and cDNA of IκBα deletion
mutant was obtained by RT2PCR method. The mutant gene was cloned into the eukaryotic exp ression p lasm id pcDNA3. 1 / myc2H is
(A ) to construct the recombinant vector pcDNA3. 12IκBαΔN. PCR method, N coⅠdigestion and DNA sequencing analysis were 2
emp loyed to identify the recombinant vector. The exp ression of IκBα deletion mutant was detected byW estern B lot. HeLa cells were
co2transfected with pcDNA3. 12IκBαΔN and pNF2κB2Luc. Then, after the induction of TNF2α, its inhibitory effect on NF2κB was test2
ed by Luciferase A ssay System. Result indicated that the recombinant vector pcDNA3. 12IκBαΔN was confirmed by PCR method,
N coⅠdigestion and DNA sequencing analysis. The IκBαΔN gene was exp ressed in HeLa cells and the deletion mutant p rotein had
disp layed obvious inhibitory effect on NF2κB ( P < 0. 01) . Therefore, the pcDNA3. 12IκBαΔN , a eukaryotic exp ression vector of IκBα
deletion mutant, was constructed successfully. It p rovides a potent molecular tool for further study of NF2κB signal transduction path2
way and related diseases.
Key wo rds: 　 IκBα Deletion mutant Vector construction NF2κB
收稿日期 : 2009207227
基金项目 :国家自然科学基金 (30672510) ,广东省科技计划重点资助项目 (7112208000694)
作者简介 :黄思超 (19852) ,广东汕尾人 ,硕士在读 ,研究方向 :药理学专业 ; E2mail: sichao85@126. com
通讯作者 :蔡绍辉 , E2mail: csh5689@ sina. com　　NF2κB ( nuclear factor kappa B )是广泛存在于真核细胞内的核转录因子 ,能与多种细胞基因启动子 或增强子序列κB位点特异性结合而促进靶基因转录和表达。从 1986年发现 NF2κB 至今 ,已有许多
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证据表明 NF2κB在人类许多肿瘤的发生和发展中
起着重要作用 [ 1, 2 ]。在大多数细胞中 , NF2κB 与其
抑制蛋白 IκB ( Inhibitor of NF2κB )家族的成员结合 ,
以无活性的复合物形式存在于胞浆中。当细胞受到
TNF2α、IL21等多种刺激因子作用时 , IκB s迅速发生
磷酸化 ,经泛素化修饰后 ,随即被 26S蛋白酶体降
解。此过程导致了 NF2κB向细胞核转移 ,并与靶序
列结合 ,从而调节相关基因的表达 [ 3 ]。由此可见 ,
IκB s的降解是激活 NF2κB信号传导通路的关键步
骤。现已发现 , IκB家族有 IκBα、IκBα、IκBα、Bcl23
等 8 个成员 ,其中 IκBα为 NF2κB 主要的抑制因
子 [ 4 ]。 IκBα分子结构由 3部分组成 : (1) N端是介
导 IκBα降解的区域 ,存在信号诱导的磷酸化位点
( Ser32和 Ser36)及泛素化位点 (Lys21和 Lys22) ;
(2)中央结构域含有 5个锚蛋白重复序列 ,能与 NF2
κB的 Rel同源结构域作用 ,掩盖其核定位序列 ,以
抑制 NF2κB 的核定位 ; ( 3 ) C2端富含 Pro2Glu2A sp2
Ser2Thr多肽结构 ,也称为 PEST结构域 [ 5, 6 ]。当细
胞受到刺激时 , IκBα N端的 Ser32和 Ser36被磷酸
化 ,并进一步在 Lys21和 Lys22位点发生泛素化 ,终
究导致κBα降解。
目前 ,常用的 NF2κB 抑制剂主要为抗氧化剂
PDTC[ 7, 8 ] ,然而它并非靶向抑制 NF2κB ,多伴有其他
非特异影响。由于 IκBα能特异性抑制 NF2κB ,可利
用 IκBα作为 NF2κB的特异抑制剂。但仅增加胞内
IκBα的数量 ,仍无法避免 TNF2α等刺激因子所诱导
的 IκBα降解。鉴于 IκBα的 N端前 36个氨基酸仅
参与介导 IκBα降解 ,而并非是维持其功能的必需
区域 [ 9, 10 ]。所以 ,缺失 N端前 36个氨基酸的 IκBα
突变体即可保留其抑制 NF2κB的功能 ,而又不会被
降解。据此 ,本研究构建了 IκBα突变体 (缺失 N端
首 36位氨基酸 )的真核表达载体 ,并检测其抑制
NF2κB的活性 ,为一步研究 NF2κB信号传导通路及
其相关疾病提供有用的分子工具。
1 材料
1. 1 质粒、细菌和细胞
真核表达载体 pcDNA3. 1 /myc2H is A购自美国
Invitrogen公司 ; pNF2κB 2Luc、pTAL2Luc和 pEGFP2
N3均购自美国 ClonTech公司 ;大肠杆菌 DH5α由
本实验室保存 ;人子宫颈癌细胞 HeLa,由中山大学
药学院微生物与生化药学实验室保存。
1. 2 试剂、酶和抗体
RPM I21640培养基购自 Gibco公司 ;胎牛血清
购自杭州四季青公司 ; Trizol Reagent和细胞转染试
剂 L ipofectam ineTM 2000购自 Invitrogen公司 ;质粒
提取试剂盒子购自 Omega公司 ;凝胶回收纯化试剂
盒购自 Promega;限制性内切酶 H indⅢ、EcoR Ⅰ和
N coⅠ, rTaq DNA聚合酶 , T4连接酶以及 M 2MLV逆
转录酶 ,均购自 TaKaRa公司 ;兔抗 IκBα抗体和兔
抗β2actin抗体购自 Cell Signaling Technology公司 ,
羊抗兔 IgG2HRP购自博士德生物工程有限公司 ;
Recombinant Human TNF2α购自 Pep rotech公司 ; Lu2
ciferase A ssay System购自 Promega公司。
2 方法
2. 1　 IκBα突变体真核表达载体 pcDNA3. 12IκBαΔN
的构建
2. 1. 1　HeLa细胞培养 用完全培养基 RPM I21640
(含有 10%胎牛血清、100 U /m l青霉素和 100 U /m l
链霉素 ) ,于 37℃和 5% CO2的条件下培养 ,常规培
养 HeLa细胞。
2. 1. 2　 IκBα突变体真核表达载体的构建 Trizol
法从 HeLa细胞抽提总 RNA,溶于 DEPC水。根据
IκBα突变体核酸序列 ,设计引物扩增 IκBα突变体
的引物。
上游引物 F: 5′2GGGAAGCTTATGAAAGACGAG2
GAGTACGAG23′(带有 H indⅢ酶切位点 )
下游引物 R (5′2TAGAATTCTCATAACGTCAGAC2
GCTGG23′(带有 EcoRⅠ酶切位点 )
以总 RNA为模板 ,采用 M 2MLV逆转酶进行逆
转录 ,获得 IκBαΔN cDNA。以逆转录产物为模板进
行 PCR反应。反应程序 : 95℃预变性温度 5 m in,
94℃变性 30 s, 55～64℃退火 30 s, 72℃延伸 45 s, 30
个循环后 , 72℃延伸 10 m in。按照凝胶回收试剂盒
说明书 ,对 RT2PCR产物进行胶回收试验 ,回收目的
基因片段。回收产物与 pcDNA3. 1 /myc2H is A载体
分别用 H indⅢ和 EcoRⅠ进行双酶切反应 ,随后采用
T4连接酶进行连接反应 ,将 IκBαΔN 克隆至 pcD2
NA3. 1中。
2. 1. 3 　载体扩增 　分别将重组载体 pcDNA3. 12
IκBαΔN和空载体 pcDNA3. 1转化 DH5α感受态细
48
2009年第 11期 　 　　黄思超等 : IκBα缺失突变体真核表达载体的构建、表达及其生物活性检测
菌。转化后 ,分别将其涂布含 50μg/m l氨苄霉素的
固体 LB板上 ,在 37℃倒置培养箱培养 16 h。挑取
阳性单克隆 ,扩大培养 ,根据 Omega公司的质粒提
取试剂盒说明书提取质粒。
2. 2 重组载体 pcDNA3. 12 IκBαΔN的鉴定
2. 2. 1　N coⅠ酶切鉴定 通过软件 Primer Prem ier
5. 0 分析 ,限制酶 N coⅠ对重组载体 pcDNA3. 12
IκBαΔN有 5个识别位点 ,而对未插入目的片段的
空载质粒仅有 3个 N coⅠ酶切位点。据此 ,在 37℃
水浴条件下 ,用 N coⅠ酶将载体酶切 6 h,对酶切产物
进行琼脂糖凝胶电泳。
2. 2. 2　PCR鉴定 以 pcDNA3. 12IκBαΔN为模板 ,
利用引物 F和 R,通过 PCR方法从重组载体中扩增
IκBαΔN基因 ,对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳
分析。
2. 2. 3　核酸测序 将构建的重组载体 pcDNA3. 12
IκBαΔN,送往上海英骏生物技术有限公司进行测
序 ,测序结果与人源 IκBα基因进行分析比较。
2. 3　W estern B lot检测 IκBαΔN突变体蛋白的表达
将 HeLa细胞扩大培养 ,按每孔 3 ×105个接种
于 6孔板中。采用脂质体转染法 ,按照 L ipofectam i2
ne
TM 2000转染试剂说明书进行操作。转染分 3个
组 :依次转入空载体 pcDNA3. 1 (空载组 )、转入重组
载体 pcDNA3. 12 IκBαΔN (试验组 )和无转入 DNA
的空白对照。转染 6 h后 ,换为完全培养基继续培
养至 48 h。用三去污细胞裂解液来裂解细胞 ,提取
总蛋白。经蛋白定量后 , 30 μg蛋白作 10% SDS2
PAGE凝胶电泳 ,随即将蛋白转至 PVDF 膜。经
TBS2T洗膜后 5% BSA 封闭液于室温封闭 2 h后 ,
PVDF膜孵育一抗 (兔抗 IκBα和兔抗β2actin,比例
为 1∶1 000) ,洗膜后孵育二抗 (羊抗兔 IgG2HRP,比
例为 1∶3 000) ,随即用 ECL试剂室温孵育 1 m in,立
即曝光显影。
2. 4 IκBαΔN蛋白抑制 NF2κB的生物活性检测
2. 4. 1　NF2κB 活化的细胞模型建立 将 HeLa细
胞按每孔 5 ×104个细胞接种于 24孔板中。采用脂
质体转染法 ,按照 L ipofectam ineTM 2000转染试剂说
明书进行。转染分为 4个组 : A、B、C和 D (表 1) ,每
组设置 3个复孔。其中 , pEGFP2N3作为内参。转
染 6 h后 ,换为完全培养基继续培养。4 h后 , A组
和 B组各孔均加入 20 ng/m l的 TNF2α,而 C和 D组
各孔加入等体积的 PBS,再培养 4 h。使用 Promega
公司的 Luciferase A ssay System 试剂盒和 Berthold
LB9507发光仪来检测各组细胞的萤光素酶活性 ,并
将 A组 /B组的与 C组 /D组的读数比值进行比较 ,
分析 TNF2α对 NF2κB的作用。同时 ,以 pEGFP2N3
表达的绿色荧光蛋白作为内参对照 ,分析各组间是
否存在转染效率差异。
表 1 转染设计与细胞处理
组别
重组载体 ( g)
pNF2κB2Luc pTAL2Luc pEGFP2N3 L ipofectam ine (μl) TNF2κ( ng/m l)
A 0. 4 — 0. 4 0. 8 20
B — 0. 4 0. 4 0. 8 20
C 0. 4 — 0. 4 0. 8 —
D — 0. 4 0. 4 0. 8 —
2. 4. 2　 IκBαΔN 蛋白对 NF2ΔB 的抑制作用 将
HeLa细胞按每孔 5 ×104个细胞接种于 24孔板中。
采用脂质体转染法 ,按照 L ipofectam ineTM 2000转染
试剂说明书进行。转染设计分为 4个组 (表 2) ,其
中共转染 pcDNA3. 12IκBαΔN和 pNF2κB 2Luc为试
验组 (第 3组 ) ,同时设置为 3个对照组 ,每组设置
3个复孔。转染 6 h后 ,换为完全培养基继续培
养。44 h后 ,每孔均加入 20 ng /m l的 TNF2α以继 续培养 4 h。检测各组的萤光读数 ,并且每组萤光值均除以 1组的读数 ,计算萤光值增加的倍数。2. 5 统计学方法所有数据均以均数 ±标准差 ( x ±s)表示 ,采用SPSS14. 0统计软件进行统计学分析 ,应用 t检验进行两组间的差异性分析 , P≤0. 05为差异有显著的统计学意义。
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表 2 转染设计与细胞处理
组别
重组载体 (μg)
pNF2κB2Luc pTAL2Luc pcDNA3. 12IκBΔN pcDNA3. 1 L ipofectam ine(μl) TNF2α( ng/m l)
1 — 0. 4 — 0. 4 0. 8 20
2 — 0. 4 0. 4 — 0. 8 20
3 0. 4 — 0. 4 — 0. 8 20
4 0. 4 — — 0. 4 0. 8 20
3 结果
3. 1　重组载体 pcDNA3. 12IκBαΔN的鉴定
3. 1. 1　N coⅠ酶切与 PCR鉴定 重组载体经 N coⅠ酶
切后 ,得到 5个片段 : 3 347 bp、1 457 bp、735 bp、458
bp和 307 bp (图 1)。N coⅠ将空载体 pcDNA3. 1酶
切成 3个片段 : 735 bp、1 411 bp和 3 347 bp (图 2) ,
此结果与预期分析一致。同时 ,正确插入 IκBαΔN
片段的重组载体经过 PCR扩增后 ,将可扩增出 846
bp条带。PCR产物电泳分析的结果与预期结果相
符合。这些结果初步证实了 IκBαΔN基因成功克隆
至 pcDNA3. 1质粒中。
3. 1. 2 　核酸序列测定 　对重组载体 pcDNA3. 12
IκBαΔN进行测序 ,结果显示 :在 H ind Ⅲ和 EcoRⅠ
两个酶切点间插入了 843 bp的目的基因片段 ,与突
变体 IκBαΔN的核苷酸序列完全一致 ,读码框架正
确 ,无碱基的错配及移码突变 (图 3)。进一步证实了
带有 IκBαΔN 基因的重组载体 pcDNA3. 12IκBαΔN
构建成功。
3. 2 W estern B lot检测 IκBαΔN突变体蛋白的表达
在 W estern B lot检测中 ,采用了 Cell Signaling
Technology公司生产的特异性识别 IκBαC端的单克
隆抗体 ,所以亦可识别 IκBαΔN突变体蛋白。W est2
ern B lot结果显示 ,转染重组载体 pcDNA3. 12IκBαΔN
的试验组有阳性条带出现 ,而空白组和转染空载体对
照组都只见内源性 IκBα条带 (37 kD)而未见其他特
异条带 (图 4)。这表明突变体 IκBαΔN蛋白在 HeLa
细胞中成功表达。
3. 3　TNF2α诱导 NF2κB活化的细胞模型建立
转染 48 h后 ,用荧光显微镜观察各组绿色荧光
蛋白的表达情况 (图 5) ,结果显示各组绿色荧光蛋
白表达均接近 50% ～60% ,没有明显表达差异 ,表
明各组间无明显的转染效率差异。A组与 B组均经
TNF2α处理过 , A组 /B组的萤光读数比值为 273. 3
±33. 3,而 C组与 D组未加 TNF2α处理 , C组 /D组
的比值仅为 32. 8 ±7. 8,两比值之间有显著性差异
( P < 0. 01,图 6)。该结果说明 TNF2α可激活 NF2
κB ,导致使 pNF2κB 2Luc萤光素酶的表达增高。因
此 ,利用 TNF2α诱导可以建立 NF2κB 活化的 HeLa
细胞模型。
3. 4　 IκBαΔN突变体蛋白对 NF2ΔB的抑制作用
利用 TNF2α诱导 NF2κB活化的 HeLa细胞模型
来观察 IκBα缺失突变体蛋白对 NF2κB 的抑制作
用。每组萤光值均除以 1组的读数 ,获得萤光增加
倍数 ,其中 2组为 0. 88 ±0. 16, 3组为 9. 18 ±1. 99, 4
组为 125. 72 ±17. 90 (图 7)。结果显示 3组与 4组有
显著性的差异 ( P < 0. 01 )。这说明 pcDNA3. 12
IκBαΔN表达的 IκBαΔN突变体蛋白对 HeLa细胞内
NF2κB有显著的抑制作用 ,阻滞了 NF2κB与 pNF2κB2
Luc质粒上的κB 位点结合 ,从而下调了 Luciferase
表达。
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4 讨论与结论
依据 IκBα的结构与功能 ,成功构建了 IκBα缺
失型突变体 (缺失 N端前 36个氨基酸 )的真核表达
载体。该突变体不仅保留了抑制 NF2κB的活性 ,而
且缺失了磷酸化和泛素化的区域。目前 ,国内外已
有不少研究者成功构建了 IκBα定点突变体 ,如以
其他氨基酸取代 Ser32和 Ser36的真核表达载体 ,也
显示了一定的生物活性 [ 11～13 ]。当前 ,定点突变较为
简易的方法可采用 Stratagene公司开发的定点突变
试剂盒 ,但定点突变需建立在构建野生型基因的重
组载体前提下方可进行定点突变 ;而且 ,定点突变的
成功率亦不尽如人意。若利用定点突变的方法构建
IκBα突变体 ,至少需进行两次突变以取代 Ser32和
Ser36。总体而言 , IκBα缺失型突变体的载体构建
比定点突变体更为简易 ,耗时更短 ,且成功率更高。
另外 ,由于 IκBα缺失突变体保留特异性抑制 NF2κB
的功能 ,因而利用 IκBα缺失突变体将可靶向性抑
制 NF2κB,有利于克服 PDTC等 NF2κB抑制剂特异
性不强的缺陷。
研究证明 ,许多细胞外刺激可引起细胞内一系列
级联反应 ,通过激活 IKK并最终导致 NF2κB的活化 ,
IκBα的降解是 NF2κB信号传导通路激活的关键步
骤。NF2κB、IκBα以及 IKK构成了 NF2κB典型的信
号转导途径。TNF2α、IL21、LPS等刺激因素子 ,可激
活该经典的通路 [ 14 ]。在本研究中 ,利用 TNF2α作为
诱导因素 ,建立 NF2κB经典的活化模型 ,为研究 IκBα
突变体蛋白的生物活性打下基础。TNF2α通过 TN2
FR12TRADD2R IP通路激活 NF2κB, TNF2α与Ⅰ型 TNF
受体 (TNF2R1)结合后 , TNF2R1的胞内区域通过死亡
结构域同 TRADD ( TNFR12associated death domain
p rotein)相结合。 TRADD 再通过死亡结构结合
TRAF2 (TNF recep tor2associated factor 2)和丝氨酸 /苏
氨酸蛋白激酶 R IP ( recep tor2interacting p rotein) ,由此
激活 IKK复合体 ,随即 IκBα被 IKK磷酸化继而发生
泛素化 ,最终被 26S蛋白酶体降解 ,从而使 NF2κB得
以释放 ,迅速向核易位 ,通过其核定位信号与靶基因
上游的 κB 序列结合 ,从而启动或增强靶基因的
转录 [ 15, 16 ]。
NF2κB与肿瘤细胞的生长、粘附、侵袭、转移以
及血管生成等方面密切相关 [ 17 ]。目前 , NF2κB已被
视为肿瘤治疗的靶点 ,寻求抑制 NF2κB活化的方法
成为了肿瘤治疗研究的重要方面。本试验所构建的
重组载体 pcDNA3. 12IκBαΔN在体外条件下对 NF2
κB有显著的抑制活性 ,这将为研究如何阻遏 NF2κB
过度活化提供了一种新的方案。尽管 NF2κB在多
数肿瘤的发生和发展中起着重要作用 ,但 NF2κB信
号传导通路在肿瘤恶化机制中具体扮演何等角色还
有待进一步探讨。故特异性抑制 NF2κB ,将有助于
研究内源性蛋白或潜在活性药物等物质与 NF2κB
信号传导通路的相关性。因此 ,可将 IκBα缺失突
变体作为分子靶工具 ,拟用于阻断 NF2κB信号传导
通路以研究肿瘤恶化的相关机制或药物的作用
靶点。
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