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观光木SSR-PCR反应体系优化及引物筛选



全 文 :Vol. 35 No. 10
Oct. 2015
第 35卷 第 10期
2015年 10月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.025 http: //qks.csuft.edu.cn
收稿日期:2015-06-23
基金项目:国家林业公益性行业科研专项(201104033)
作者简介:黄芳芳,硕士研究生 通讯作者:徐刚标,教授,博导;E-mail:gangbiaoxu@163.com
引文格式:黄芳芳,何长青,闫丽君,等 . 观光木 SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 [J].中南林业科技大学学报 ,2015,35(10):142-146.
观光木 Tsoongiodendron odorum Chun,属木兰
科Magnoliaceae植物,为古老的孑遗树种,是著
名的观赏树种,被列为我国二级珍稀濒危重点保护
植物。观光木零星分布我国福建、海南、广东、广西、
江西南部、贵州南部、云南东南部、湖南南部以及
越南等地海拔 300~ 1 100 m山地常绿阔叶林中、
林缘以及村旁、房前屋后 [1-2]。目前,观光木的研
究主要集中在生物量循环、种群生态生理、生殖生
物学及系统发育等基础生物学等方面 [3-5],近期开
展的观光木种群遗传多样性研究主要采用RAPD、
ISSR[5-8]标记。由于RAPD和 ISSR标记为显性标记,
估算的种群遗传学参数是基于种群遗传平衡假说,
与真实情况存在偏差。共显性 SSR标记是揭示濒
危植物遗传多样性、基因流模式及小尺度空间遗
传结构首选分子标记 [9],因此,为了探讨观光木种
群进化机制,预期其小种群未来命运,开展 SSR
标记分析显得尤为迫切。
本研究拟通过单因素试验和正交试验,旨在
建立出一套适合观光木种群遗传多样性分析 SSR-
PCR扩增反应优化体系,利用优化体系对近期开
发的 12对观光木特异 SSR引物 [10]进行筛选,以
期为进一步基于 SSR标记开展观光木种群遗传多
样性研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
观光木新鲜叶片置于密封袋中硅胶干燥处理
后,-4℃冰箱保存。参考文献 [10]中 SSR特异引
物 TOD8(F:CCCCATTGAAGTCATTTGAAG,R:
观光木 SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选
黄芳芳,何长青,闫丽君,汪灵丹,徐刚标
(中南林业科技大学 林学院 林木遗传育种实验室,湖南 长沙 410004)
摘 要:在单因素试验基础上,采用正交试验优化影响观光木 SSR-PCR扩增的 5种主要影响因素,获得最佳反
应体系(10 μL)为:Mg2+ 1.0 mmol,dNTP 0.20 mmol,引物 0.25 μmol,Taq DNA聚合酶 0.75 U,模板 DNA 60
ng。利用优化 SSR-PCR扩增体系,从 12对引物中筛选出 5对多态性高、重复性好的引物。这为进一步开展观
光木种群遗传多样性研究奠定了前期实验基础。
关键词:观光木;SSR;体系优化;引物筛选
中图分类号:S718.46 文献标志码:A 文章编号:1673-923X(2015)10-0142-05
Optimization of SSR-PCR Reaction System and Prime Screening for
Tsoongiodendron odorum
HUANG Fang-fang , HE Chang-qing, YAN Li-jun, WANG Líng-dan, XU Gang-biao
(College of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)
Abstract: In this paper, the main factors affecting SSR-PCR system of Tsoongiodendron odorum were optimized through orthogonal
design with the samples of T. odorum, which is based on single factor experiments. SSR-PCR amplytications were performed in a
final volume of 10 μL containing 1.0 mmol Mg2+, 0.20 mmol dNTP, 0.25 μmol of each primers, 0.75 U Taq DNA polymerase, 60 ng of
genomic DNA. Using the optimized SSR-PCR system 5 primes with high polymorphism and reproducible properties were selected from
12 primes. This paper establishs the foundation for further study of population genetic diversity in T. odorum.
Key words: Tsoongiodendron odorum; SSR; Reaction system optimization; Prime screening
143第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
ATCCCATGCGATAACCGATA) 进 行 SSR-PCR 反
应体系优化。
1.2 方 法
1.2.1 基因组 DNA提取与检测
观光木基因组 DNA提取、检测参考文献 [11]。
1.2.2 SSR-PCR扩增
参照文献 [9],SSR-PCR扩增初始反应体系
(10 μL):50 ng DNA,1 μL 10×PCR buffer,
0.2 μmol引物,1.5 mmol MgCl2,0.2 mmol dNTP,
1 U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序:94℃预变
性 5 min,94℃变性 45 s,57℃退火 50 s,72℃延
伸 90 s,35个循环;72℃延伸 5 min,4℃保存。
1.2.3 单因素试验设计
以 SSR-PCR扩增初始反应体系为基础,对影
响 PCR扩增反应的Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA
聚合酶、模板 DNA 5个主要因素分别进行优化。
其中,Mg2+浓度范围为 0.5~ 3.0 mmol,梯度为
0.5 mmol; dNTP浓度范围为 0.05~ 0.30 mmol,梯
度为 0.05 mmol;引物浓度范围为 0.10~ 0.35 μmol
梯度为 0.05 μmol;Taq酶用量为 0.25~ 1.50 U,
梯度为 0.25 U;模板 DNA用量为 15~ 90 ng,梯
度为 15 ng。
1.2.4 正交试验设计
在单因素试验确定的各因素最适浓度范围基
础上,利用 L16(44)正交试验设计(表 1),确定
适合观光木 SSR-PCR扩增的最优反应体系。
表 1 观光木SSR-PCR 正交试验设计
Table 1 Orthogonal design for SSR-PCR of
Tsoongiodendron odorum
处理号 因素
Mg2+ /mmol dNTPs /mmol 引物 /μmol Taq酶 /U
1 1.00 0.10 0.15 0.25
2 1.00 0.15 0.20 0.50
3 1.00 0.20 0.25 0.75
4 1.00 0.25 0.30 1.00
5 1.50 0.10 0.20 0.75
6 1.50 0.15 0.15 1.00
7 1.50 0.20 0.30 0.25
8 1.50 0.25 0.25 0.50
9 2.00 0.10 0.25 1.00
10 2.00 0.15 0.30 0.75
11 2.00 0.20 0.15 0.50
12 2.00 0.25 0.20 0.25
13 2.50 0.10 0.30 0.50
14 2.50 0.15 0.25 0.25
15 2.50 0.20 0.20 1.00
16 2.50 0.25 0.15 0.75
1.2.5 退火温度确定
以由 Tm 值计算出的理论退火温度 57℃为
标准,进行梯度为 1℃的 6个退火温度(55℃,
56℃,57℃,58℃,59℃,60℃)试验,确定最
适退火温度。
1.2.6 扩增产物检测
参考文献 [12]。
1.2.7 引物筛选
基于优化的观光木 SSR-PCR反应体系,对文
献 [10]中 12对引物进行筛选。
1.2.8 最佳反应体系验证
利用已优化的 SSR-PCR反应体系,对 17株
样本进行扩增反应,验证该体系的稳定性。
2 结果与分析
2.1 SSR-PCR反应体系单因素试验
影响 PCR反应体系的 5个主要因子的 6个梯
度扩增结果见图 1。Mg2+:第 1到第 3条带随着
Mg2+浓度的升高,条带逐渐变亮且数量增多,但
是 Mg2+浓度再升高条带亮度反而变弱,Mg2+在
1.0 mmol时条带清晰明亮且特异性高。dNTP:
6个浓度下的 dNTP均扩增出产物,浓度越高条带
越亮,浓度在 0.15 mmol之后亮度基本无变化,故
dNTP浓度在 0.15~ 0.20 mmol之间均可。引物:
引物浓度在很低时,扩增的条带不清晰,随引物
浓度升高,条带逐渐变清晰,浓度达到 0.25 μmol
时最清晰。Taq DNA聚合酶:不同浓度的 Taq酶
均可扩增出条带,浓度为 0.75U时,扩增条带最
清晰。模板 DNA:不同模板用量对 SSR-PCR扩
增影响不明显,当模板 DNA用量为 60 ng时,条
带最清晰。
2.2 SSR-PCR反应体系正交试验
如图 2正交试验结果所示,16个不同处理均
可扩增出条带,其中第 3个处理组合条件下扩增
出的条带比较清晰明亮,最终确定为本试验的最
优组合,即 10 μL体系中含Mg2+ 1.0 mmol,dNTP
0.20 mmol,引物0.25 μmol,Taq DNA聚合酶0.75 U。
2.3 退火温度
不同退火温度扩增条带见图 3,6个温度均能
扩增出清晰的条带,条带由亮变暗然后又变亮。
其中,58℃时条带最暗,56℃时最亮,据此把引
物 TOD8最适退火温度确定为 56℃。
黄芳芳,等:观光木 SSR-PCR反应体系优化及引物筛选144 第 10期
2.4 引物筛选
利用确立的优化体系,筛选出 5对条带清晰、
重复性好、多态性高的 SSR引物,见表 2。
2.5 最佳反应体系验证
5对 SSR引物对 17株观光木样本进行最佳反
应体系的验证结果,如图 4所示。从图 4可以看
出,5对引物都能扩增出清晰的条带,说明优化的图 3 退火温度对 SSR-PCR 的影响Fig.3 Effects of annealing temperature on SSR-PCR
表 2 筛选的5对引物
Table 2 Screened 5 paris of primes
引物名称 引物序列(5′-3′) 重复基序 退火温度 /℃ 片段大小范围 /bp
TOD3 F: AATGGATGCGATCTCCTCTGR: TCGGTTCCGAGTCAAGAAGT (AC)15 58 185
TOD4 F: ACACCACCACCACTCAAACAR:GGAGGATCTGAATCCCGTCT (GT)16 48 275-279
TOD5 F:CACTGTTTCCTGTGGTGTGGR:TTGGAGATTCTGAGGGTTGG (GA)19 57 288-300
TOD10 F: ATAAGCATGGTGGGCAAAAAR: TGTGGCCATATCACACACCT (AGA)9...(AAG)5 59 171-174
TOD11 F: GGACACAACTTGCAAGGCTAR: CCCATCCTCCATTTTTCCTT (AG)7...(AG)5 57 166-170
SSR-PCR反应体系比较稳定,可以满足对观光木
SSR遗传多样性研究的需要。
3 讨 论
SSR分子标记广泛存在于各种真核生物的基
因组中,呈共显性遗传,具有丰富的多态性和信
息量。SSR标记具有物种特异性强、模板 DNA用
量少、重复性和稳定性好、操作简单等优点,是
目前植物种群遗传学分析和植物辅助育种最理想
标记,已广泛应用于种群遗传多样性、分子辅助
Mg2+、dNTP单位为 mmol,引物单位为 μmol,Taq酶用量为 U,模板用量为 ng
图 1 单因素对 SSR-PCR 扩增的影响
Fig.1 Effects of each factor on SSR-PCR
图 2 观光木 SSR-PCR 正交试验扩增结果
Fig.2 Results of SSR-PCR by orthogonal design of T. odorum
145第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
图 4 优化的反应体系对 17株观光木样本的 SSR-PCR扩增结果
Fig.4 SSR-PCR amplifi cation results of 17 T. odorum samples by the optimal reaction system
育种、基因定位、种质资源鉴定、遗传连锁图谱
绘制等研究中 [13-16]。
稳定的 SSR-PCR扩增反应优化体系,是进
一步开展基因分型分析的前提条件 [17]。PCR扩
增反应受到 Mg2+、dNTP、引物浓度,以及模板
DNA、Taq DNA聚合酶用量等因素的交互作用影
响 [18]。PCR扩增反应中,Mg2+是 Taq DNA聚合
酶的激活剂,浓度过低降低 Taq酶活力,过高导
致 Taq酶催化非特异扩增;dNTP是 PCR扩增反
应的底物,浓度过低影响扩增效率,过高降低 Taq
酶活性;引物是 PCR特异性反应的关键,浓度过
低扩增产物量少,过高促进非特异性扩增并增加
引物二聚体的形成;模板是待扩增序列的核酸,
浓度过低减少目的序列的扩增量,过高增加非特
异性扩增产物;Taq酶是 PCR反应中的催化剂,
用量过少靶序列产量将降低,过多导致非特异产
物增加 [19]。
退火温度是影响SSR引物与模板特异性结合,
不同引物因其碱基序列不同,退火温度不同。退
火温度太低,导致非特异的 DNA片段扩增,特异
性差;退火温度太高,引物不能与模板很好地结合,
扩增产物很低 [20]。本研究通过设计几个不同温度
梯度,重复试验,获得了各 SSR引物的适宜退火
温度。
正交试验设计是针对多因素、多水平的试验
设计,从中挑选出部分有代表性的点进行试验,
具有高效率、快速、经济特点,能分析各因素水
平组合的交互作用,使试验结果简便、科学。本
研究在单因素试验基础上,通过正交试验设计优
化影响观光木 SSR-PCR反应体系各因素水平,建
立了一套适用于观光木的最佳 SSR-PCR扩增反应
体系。利用优化的 SSR-PCR反应体系,对来自不
同种群的 17株观光木样本经过重复试验,从 12
对引物中筛选出 5对条带清晰、多态性丰富、重
复性好的引物,为后期观光木遗传多样性、小尺
度空间遗传结构、交配系统及基因流分析,以及
进一步探讨观光木种群进化历史及预测其片断化
小种群的未来命运,奠定了前期实验基础。
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