全 文 ：doi:10．3969 / j．issn．1000-484X．2016．10．030
主动免疫:预防蓖麻毒素、相思子毒素中毒①
王俊虹② 徐忠伟 魏茂提② (武警后勤学院，天津 300309)
中图分类号 Ｒ392 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2016)10-1547-04
①本文受武警后勤学院开放基金(WHKF201503)和军事预防医学
“2110”三期工程建设项目资助。
②同时供职于天津市职业与环境危害防制重点实验室，天
津 300309。
作者简介:王俊虹(1977年－)，女，博士，讲师，主要从事生物战剂的
侦检和防治的研究，E-mail:wangjunhong110 07@ 163. com。
蓖麻毒素(Ｒicin toxin，ＲT)和相思子毒素
(Abrin toxin，AT)都属于大分子植物来源的蛋白毒
素，属于Ⅱ型核糖体失活蛋白(Ｒibosome-inactivating
proteins，ＲIP)，能够抑制细胞蛋白合成而具有极强
的细胞毒性。由于来源广、毒性强等特点，二者均被
认为是重要的致死性生物毒素战剂，美国疾病控制
中心(CDC)定义为 B级生物威胁［1］。因此，开展对
ＲT和 AT的生防疫苗的研究，对提高军队和国家应
对生物战和生物恐怖的能力和水平，增强生防能力
和保障国家安全，具有非常重要的军事意义和社会
意义。
1 毒素的基本特性
ＲT和 AT 在毒素来源与制备、分子结构和作用
机制方面非常相似，分子量约为 60 ～ 65 kD，由 A、B
两条多肽链通过二硫键相连接。毒素 A 链的分子
量约为 29 kD，具有 ＲNA N-糖苷酶活性，能够使核
糖体失活而抑制蛋白质合成，是效应链;毒素 B 链
的分子量约为 32 kD，帮助 A链发挥毒性作用，为结
合链［2］。
其中，ＲT是从蓖麻籽(Ｒicinus communis)中提
取的植物糖蛋白。ＲTA 由 263 个氨基酸残基组成，
第 10个残基 Asn已糖基化，只有两个 Ly残基，对 A
链的毒性作用至关重要。ＲTB则由 259个氨基酸残
基组成，含两个寡糖链。ＲT的毒性强，LD50 依据暴
露途径不同而异，全毒素在小鼠、兔、猴子的致死剂
量为 5 ～ 25 μg /kg，吸入方式的 LD50 为 3 ～ 17 μg /
kg，摄入方式的 LD50 为 20 mg /kg。估计的人类致
死剂量为吸入或注射方式 1～25 μg /kg，摄入方式 20
mg /kg。当单独的 ＲTA 肠道外给药小鼠时，毒性大
大降低，仅为全毒素的 1 /1 000［2］。
AT来源于植物相思子(Abrus precatorius)的种
子，是一种剧毒性高分子植物蛋白毒素，是毒性最强
的植物毒素［3］。全毒素经二巯基乙醇处理后 A、B
两条链分离开，其中 A链(ATA)与 ＲTA链存在 102
个相同的氨基酸残基。B 链(ATB)由 267 个或 268
个氨基酸残基组成，在一级结构上的位置为 Asn51
和 Asn260，毒素所含的糖基主要存在于 B 链上。天
然 AT有 a、b、c、d 四种亚型，a 亚型的细胞毒性最
强，而 b、c较弱，推测可能是由于其 B链凝集活性低
导致。虽然 AT在结构特性方面与 ＲT非常相似，但
毒性比 ＲT高出 70 多倍，小鼠腹腔 LD50 约为 0. 04
μg /kg，成年人的致死剂量为 5. 0 ～ 7. 0 μg /kg，因此
一旦被恐怖分子所利用，其造成的危害必将更加
严重。
2 疫苗的研究进展
ＲT和 AT 作为潜在的生物恐怖战剂之一，发展
有效的防治手段已成为各国生防领域的重要研究任
务，也取得了一定的进展。美军传染病医学研究所
(USAMＲIID)一直致力于毒素预防措施的研究，从
19世纪 80年代就提出应基于不同人群需要建立相
应的预防方法，即民用方式和军用方式［4］。在民用
方面，个体暴露的危险虽低但却极易造成骚乱，因此
以暴露后的治疗为主。在军用方面情况则不同，由
于毒素攻击以群体形式存在，临床症状又依赖于暴
露途径(主要经污染的食物、水和空气，以气溶胶状
态的毒素暴露最为严重)，因此应采用各种预防措
施，包括物理防护、化学解毒剂和免疫接种［5］，其中
又以疫苗的研制为主。理想的疫苗应该能保护个体
免受各种途径的 ＲT 和 AT 攻击，特别是黏膜途径，
因为这是毒素攻击的最佳途径。同时疫苗应保存时
间较长且在 1或 2次接种后即有较长时间的保护效
力。根据 ＲT和 AT的分子结构特点，我们将疫苗研
制分为全毒素疫苗，基于 A 链蛋白的疫苗和基于 B
链蛋白的疫苗。
2. 1 全毒素疫苗
2. 1. 1 类毒素 由于 ＲT和 AT的免疫反应主要由
抗体介导，因此最简单直接的方法是采用亚致死剂
·7451·王俊虹等 主动免疫:预防蓖麻毒素、相思子毒素中毒 第 10期
量的毒素免疫小鼠，诱导出高效价的 IgG抗体，以抵
挡经静脉、皮下、腹膜方式的致死剂量天然毒素攻
毒。或通过加热或化学方法使毒素不可逆地失去毒
性，同时保留毒性的关键表位以保持免疫原性。其
中 ＲT类毒素以啮齿类动物为模型进行了大量的研
究［6］，接种方式包括经皮下、鼻内、气管内、口服注
射以及以各种脂质体的形式进行黏膜免疫等。早在
18世纪 90年代，研究人员就通过口服类毒素免疫
小鼠以抵抗皮下注射方式的致死剂量天然毒素攻
击。到了 19世纪 40 年代，美军采用福尔马林失活
的全毒素免疫动物，但是这种疫苗没有进行到临床
前研究阶段［3，6］。由于吸入方式为毒素的主要生物
恐怖方式，疫苗免疫的重点应集中在呼吸系统的保
护。动物实验表明鼻内或气管内注射类毒素能有效
地诱发全身免疫，保护致死剂量的气溶胶毒素攻毒，
然而该类疫苗虽然具有免疫原性，但却不能有效刺
激局部免疫反应，从而不能阻挡毒素经气溶胶或气
管内暴露途径所造成的肺损伤。实验结果表明分泌
性抗体对保护气溶胶状毒素导致的肺损伤很重要，
可以通过被动免疫气溶胶化的多种多抗血清的鸡尾
酒疗法，或通过黏膜免疫刺激分泌性抗体，但保护时
间会相对缩短，从而并不可行。
由此可见，虽然 ＲT 类毒素单独口服给药能刺
激长期的体液免疫并最终保护动物免受致死剂量的
毒素攻击(至少在啮齿类动物模型上得到证实)，而
且由于它包含了 ＲTA 和 ＲTB 两个亚单位，均能刺
激相应的中和抗体。但是它仅能对吸入性暴露给予
最低的保护，类毒素还残存部分毒性，技术上很难完
全失活，在一定条件下还能恢复至活性毒素，因此不
太可能作为安全的候选疫苗。此外，完全失活的类
毒素也几乎没有免疫原性(至少在啮齿类动物)，这
就需要佐剂或脂质体等载体。为了增进局部呼吸道
的免疫性，类毒素以脂质体微囊化的方式进行传递，
结果表明可以同时减少抗原使用量和接种次数。这
类疫苗通过气管途径免疫接种兔，可保护其免受 ＲT
致死剂量的攻击［4，6］。脂质体包裹的类毒素可诱导
分泌型 IgA(sIgA)高达 28. 7%，可有效地减轻肺部
损害。同样的，这种单一剂量的类毒素也可通过鼻
内接种，能提供至少 1年的全身免疫和局部免疫，因
此不必进行复杂的接种，也减少了引发有效免疫所
需的时间。以上实验结果说明胶囊化的类毒素可作
为候选口服疫苗。
同样的，经甲醛化处理形成的 AT 类毒素，虽然
能有效保护动物而对抗相应的毒素中毒［7］，但与 ＲT
类毒素一样，无法避免残留毒性这一缺点而未有进
一步的发展。4，6 由此可见，针对类毒素的疫苗研
制近年来主要集中以脂质体微囊化的方式传递类毒
素。同时，研究者发现，作为疫苗，A 链亚单位并不
如类毒素的效果好［3，6，7］，至于原因，作者并不清楚
是否因为类毒素比 A 链具有更为宽广的免疫应答
反应(例如可抗 B链亚单位)。
2. 1. 2 抗独特型抗体(AB2β)［8］ AB2β 可以识别
抗体上与抗原互补的决定簇从而完全抑制抗原与独
特型的结合，具有类似抗原的结构，是外界抗原的内
影像，能诱导不同种属个体产生特异性免疫应答。
抗 ＲT单克隆抗体可被动保护同系小鼠抵抗蓖麻毒
素的袭击，用此单抗免疫家兔制备抗独特型抗体，并
加氢氧化铝佐剂免疫的小鼠可抵抗致死剂量 ＲT 的
攻毒。
2. 1. 3 ＲT-MPP 这种疫苗的研制基于植物中发现
的同源性蛋白前体，由于有一个氨基酸插入其中而
干扰了活性位点，翻译后切除掉这段序列后才表现
活性。ＲT-MPP 则是在 ＲT序列中插入一个 25 个氨
基酸残基的多肽以消除酶活性位点，可大大降低其
催化活性，如直接切割肽的插入则可有效恢复 A 链
的催化活性。该疫苗对培养的哺乳动物细胞没有毒
性，免疫大鼠可完全抵抗致死剂量天然毒素的攻击，
免疫兔后可以抵挡气管途径的毒素攻击。但是，疫
苗残存的催化活性使其不可能成为适合于人类的候
选疫苗［4］。
2. 2 基于 A链蛋白的疫苗
2. 2. 1 去糖基化后的 ＲTA(deglycosylated ＲTA，
dgＲTA)［3，6］ dgＲTA 的设计思路是使 ＲTA 在保持
免疫原性表位的同时消除细胞毒活性以便诱导保护
性中和抗体，从而阻止肝脏的吸收而减少肝损伤。
实验结果表明该疫苗可以诱导良好的黏膜免疫，特
别是提供黏膜途径(即气溶胶化 ＲT)攻毒的保护。
但是，其引起的全身系统的免疫却并不如类毒素。
为此，研究者以微囊脂质体的形式使 dgＲTA 进入呼
吸系统。但是在安全性方面，dgＲTA 虽然比类毒素
的毒性小，但仍可引起局部甚至全身的血管渗透综
合征(Vascular leak syndrome，VLS)，原因是在体外
实验中虽然比天然毒素毒性小，但它在血液中的半
衰期延长而导致在体内致死性大大提高。此外，
dgＲNA生产较难并造价昂贵，并不适合大规模生
产，目前 dgＲTA的方法已被放弃。
2. 2. 2 ＲVEc(ＲTA1-33 /44-198)［9，10］ 虽然单独的
ＲTA可以保护动物抵抗 ＲT 的攻击，但是 ＲTA 的
ＲIP 活性具有毒性且在缺失 ＲTB 时，暴露出的 ＲTA
疏水表面很容易聚集的趋势而限制了疫苗方面的使
·8451· 中国免疫学杂志 2016年第 32卷
用，而活性位点的置换被认为是一种可以失活 ＲTA
并能安全作为疫苗的手段，因此研究者以 ＲTA结构
为基础，通过逆向进化选择，采用基因工程方法消除
ＲTA的整个疏水基团，获得了一个非功能性的单域
结合框架(ＲTA1-198)，使其将 ＲTA 特异性保护表
位(ＲTA环 95-110)呈现到框架表面，以这种模建方
式构建了蛋白质 ＲVEc(ＲTA1-33 /44-198)。ＲVEc
虽然保留了肺血管渗透综合征(VLP)序列，但并不
会引起免疫动物的体重减轻或其他血管渗漏综
合征。
虽然被切除的部分可能包含有目前尚未发现的
重要保护性表位，但疫苗分子仍保有已知的重要免
疫原性多肽。无论是否添加佐剂，该疫苗均可抵抗
(5～10)×LD50注射或气溶胶状态天然毒素的攻击，
小剂量如 1. 25 μg /小鼠能保护 5×LD50 气溶胶 ＲT
攻击，而 20 μg /小鼠再联合佐剂则能保护 30×LD50
气溶胶 ＲT攻击。用兔进行临床前的毒理学试验中
表现良好的免疫性和无毒性，在非人类的灵长类动
物中也同样有效。该疫苗很稳定，毒性与 ＲTA 相比
至少降低了 3个数量级，在没有稳定剂的情况下可
以反复冻融。当配方由磷酸盐缓冲液再融于琥珀酸
盐缓冲液则能够提高与氢氧化铝佐剂的结合力，在
小鼠模型中可以提高抗原性 3倍。该疫苗的研制已
进展到临床前研究，包括在新西兰白兔进行毒性试
验，结果证明未检测到 VLS 症状或 ＲIP 活性。2011
年开始Ⅰ期临床试验，已经进行多剂量连续给药和
单中心研究。只是到目前为止，疫苗保护气溶胶毒
素攻击导致的肺功能数据未见报道。
2. 2. 3 ＲiVaX［5，11］ ＲiVax 的研究思路与 ＲVEc 相
似，均是基于 ＲTA分子进行基因改造以减轻或消除
酶活性而成为候选疫苗。据文献报道，A 链中的
Y80、Y123、E177、Ｒ180、N209、W211 构成了酶活性，
L74、D75和 V76 可引起在重度复合性免疫缺陷病
等。因此考虑以上两种因素后经筛选构建的突变体
疫苗 Y80A /V76M即 ＲiVax，晶体结构非常接近野生
型 ＲTA，主要的构象决定簇完整。在不使用佐剂的
情况下，可以抵抗经腹腔摄入的 10×LD50 的天然毒
素的攻击，显现出良好的免疫效果。肌肉注射小鼠
可以保护口服、注射、吸入性途径的毒素攻击。与肌
肉注射相比，经真皮免疫能提高保护性抗体的效价。
当大规模人群需要免疫时，该免疫途径是最佳选择。
在气溶胶模式，暴露后的周期肺功能试验和组织学
实验表明该疫苗能保护小鼠的肺组织免受损伤。以
上的实验结果很重要，因为合格的疫苗应该保护机
体免受各种微小损害(即使是可逆性的)，这也是
ＲiVax区别于其他疫苗的最大优点。在志愿者进行
了一系列的临床试验，实验结果良好，第二批使用佐
剂的试验还在进行中。同时，该疫苗性质稳定，储存
方便，可以在－20℃或冻干保存在 4℃或 25℃以供临
床应用。这一优点使 ＲiVax 同样适用于军队，目前
该疫苗已经授权给 Soligenix公司进行进一步的临床
试验以期最终成为 FDA批准的军用罕见药。
基于 ATA研制的生防疫苗较少，2008 年 Suren-
dranath等［12］应用抗 ATA的 IgG 单抗(D6F10)免疫
小鼠，同样能保护其免受致死剂量的 AT 攻击。
2011年 Han等［7］采用定点突变技术获得 ATA 突变
体(mABＲAE164AＲ167L)，其毒性降低为天然 AT
的 1 /8 000，重组未突变的 A链蛋白的 1 /1 350，用该
疫苗免疫后的小鼠能抵抗 10×LD50 剂量的天然毒
素攻毒，显示出良好的免疫原性。
2. 3 基于 B链蛋白的疫苗 关于 ＲT和 AT的疫苗
研制，重点大多基于 A 链亚单位，而关于 B 链亚单
位的研究很少，这是因为很多研究者认为 B 链的免
疫原性远不如 A 链［5，7，9-12］，所以不适合做疫苗候
选。研究人员采用一系列单抗(ＲTA、ＲTB、全毒素)
进行小鼠体内保护实验，通过分型、相关亲和力和表
位特异性进行评价，实验结果表明无论是主动免疫
还是被动免疫，免疫 A链比 B 链能诱导出更好的保
护性。但也有研究者认为 B 链亚单位同样具有很
好的免疫原性［13，14］。以 ＲT 为例，理由主要包括:
ＲTB在缺少 ＲTA 的情况下无毒;抗 ＲTB 抗体可以
静脉保护小鼠，就像抗 ＲTA抗体可以保护静脉或皮
下的 ＲT攻击;基于 B 亚单位的疫苗已被其他的 A-
B家族的毒素证明是有效的，如白喉、破伤风、霍乱
和志贺毒素。最后，ＲTB 已成功地在哺乳动物细胞
中表达［15］。而且由于 ＲTB 能刺激抗体阻断呼吸道
和肠道的上皮细胞，如研究发现抗 ＲTB 的 IgA 抗体
(不是 ＲTA)能阻断毒素结合人类肠道上皮细胞(具
体数据未公开)，因此可能是对诱导体液免疫特别
有效。早在 1987 年，研究者就应用 D 型 ＲT 的抗
ＲTB单抗 IgG Fab片段(75 /3B12)免疫动物，能在体
外抵抗 30～100 倍 ＲT 毒性。Mantis 等［15］应用灌胃
法免疫类毒素的 BALB /c小鼠的派式集合淋巴结和
肠系膜淋巴结获得 4 株抗 IgA 单抗(IgA MAbs)，2
株针对 ＲTB，2株针对 ＲTA。通过 Vero 细胞毒性实
验、Caco-2和 MDCKⅡ细胞毒性实验等一系列结果
说明 4株均能中和 ＲT。抗 ＲTA、ＲTB的 IgA均能保
护 ＲT 中毒的黏膜上皮细胞。Prigent 等［16］联合 3
种单抗(2个抗 ＲTB 和 1 个抗 ＲTA)，在 5×LD50 鼻
内注射 ＲT后 7. 5 h后静脉给药，表明可以有效地抵
·9451·王俊虹等 主动免疫:预防蓖麻毒素、相思子毒素中毒 第 10期
挡暴露后预防鼻内 ＲT 的攻击。此外，包括 ＲT 和
AT在内的几种植物凝集素由于具有特异结合细胞
表面 M细胞(M-cells)的特性而被认为是一种潜在
的疫苗佐剂或载体［7］。如 ＲTB 和绿色荧光蛋白
(GFP)在烟叶中成功地进行融合表达，该融合蛋白
既有 GFP 荧光特性，又有半乳糖 /半乳糖氨结合活
性。鼻腔免疫结果显示结合 ＲTB 免疫的 GFP 出现
IgGs，与单独使用 GFP 相比，这种强体液免疫和用
霍乱毒素作为佐剂的效果相同;由于激发了 Th2 反
应，导致与 IgG2a 相比，可以诱导出更高水平的
IgG1;血液和排泄物的抗 GFP IgA 也能被融合蛋白
诱发。数据显示 ＲTB 可以作为佐剂和抗原载体运
输到黏膜并有效诱发体液和黏膜免疫反应。以上实
验结果表明关于 ＲT 和 AT 的 B 链亚单位是否适合
成为安全的候选疫苗依然存在争议。
3 其他
选择性小分子抑制剂-Ｒetro-2［8］。Ｒetro-2 虽不
能作用于毒素本身，但能逆转毒素的运输，从而影响
宿主细胞和毒素的相互作用，而且实验表明 Ｒetro-2
对 Hela细胞无毒。使用该抑制剂在毒素攻击前 1 h
静脉给药可以保护小鼠免受毒素鼻内致死剂量的攻
击。这为 ＲT和 AT 的疫苗研制提供了另一种暴露
前主动免疫的思路。
4 结语
针对 ＲT和 AT 引起的生物战和生物恐怖事件
的最有效的预防方法之一，就是研制适合人类接种
的、安全有效的生防疫苗。目前国内外研制工作主
要集中在 ＲT，而针对 AT 则相对较少，但由于后者
的毒性更强，一旦被恐怖分子所利用造成的危害更
大，因此发展 AT的疫苗研制同样重要。同时，针对
毒素的研制也主要集中在基于 A 链亚单位的各种
重组疫苗或以脂质体微囊化的方式传递类毒素，B
链亚单位的研制则由于免疫原性的争议而研究较
少，更不要说针对两种毒素中毒的预防疫苗。目前
我们分别将原核表达单独毒素的 B链亚单位(ＲTB、
ATB)、两毒素 B 链嵌合体(ＲTB-ATB)蛋白［6］为免
疫原进行免疫接种，并与相应的 A 链亚单位及嵌合
体蛋白进行比较，评价其免疫原性，为发展和研制蓖
麻、相思子毒素疫苗提供另一条途径。
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［收稿 2016-04-18］
(编辑 张晓舟)
·0551· 中国免疫学杂志 2016年第 32卷