全 文 ：第24卷第9期
2015年9月
武警后勤学院学报（医学版）
Journal of Logistics University of PAP（Medical Sciences）
vol.24 No.9
Sep. 2015
重组蓖麻毒素与相思子毒素B链嵌合体蛋白的制备与分析
王俊虹1,2，杨 帆3，魏茂提1,2，徐忠伟4（1.武警后勤学院救援医学系部队卫生统计和流行病学教研室，天津
300309；2.天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津 300309；3.武警后勤学院基础部军事心理学教研室，天津 300309；
4.武警后勤学院科研部中心实验室，天津 300309）
摘 要：【目的】观察蓖麻毒素（ricin toxin，RT）、相思子毒素（abrin toxin，AT）B链的嵌合体蛋白原核表达并分析其抗原性和毒
性。【方法】利用柔性linker-(G4S)3连接两个毒素B链基因（RTB和ATB），优化嵌合体基因RTB-ATB后构建表达质粒pQE80L-
RTB/ATB，转化至E. coli M15获得表达工程菌株，并对诱导表达条件和纯化条件进行优化；通过Western印迹检测RTB-ATB的
抗原性；采用人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1进行嵌合体蛋白的细胞毒性实验。【结果】RTB-ATB全长1 647
bp，编码549个氨基酸残基；E. coli M15在诱导条件为30℃、1 mmol/L IPTG，3 h后获得包涵体形式表达的目的蛋白，相对分子量
约为60×103 Da，经Ni柱纯化后纯度达98.9%；Western blotting印迹结果表明嵌合体蛋白保持RTB和ATB原有各自的抗原性；
MTS实验结果表明目的蛋白无毒性。【结论】嵌合体蛋白RTB-ATB实现高表达，具有良好的抗原性，为研制针对RT和AT的双
价疫苗奠定基础。
关键词：蓖麻毒素；相思子毒素；B链；嵌合体；抗原性
【文章编号】2095-3720（2015）09-0696-04 【中图分类号】R994.2 【文献标志码】A
Preparation and analysis of a recombinant chimeric protein containing B chains of ricin
and abrin
WANG Jun- hong, YANG Fan, WEI Mao- ti, XU Zhong- wei（Military Epidemiology and Statistics Section, Logistics
University of PAP, Tianjin 300309, China)
Abstract:【Objective】To observe the prokaryotic expression of the chimeric protein RTB-ATB and analyze its antigenicity and toxici-
ty.【Methods】RTB and ATB were connected via a flexible linker (G4S)3. The expression vector pQE80L-RTB/ATB was constructed af-
ter optimizing chimeric RTB-ATB, then transformed into E. coli M15 for expression. The expression and purification conditions were
optimized. The antigenicity of RTB-ATB was determined by Western blotting. Beas-2B and GES-1 were used to test the toxicity of the
recombinant protein.【Results】RTB-ATB was 1 647 bp long and encoded 549 amino acid residues. After 3 h, E. coli M15 was in-
duced to produce the target protein with MW 60×103 Da in a condition of 30℃ and 1 mmol/L IPTG. The target protein was purified by
Ni column and its purity was up to 98.9%. The results of Western blot showed that RTB-ATB was recognized by the rabbit pAb against
native RT or AT, respectively. MTS showed that RTB-ATB was non-toxic.【Conclusion】RTB-ATB is characterized by high expres-
sion and good antigenicity. It could be an effective vaccine candidate that can protect against ricin and abrin simultaneously.
Key words: Ricin toxin; Abrin toxin; B chain; Chimeric protein; Antigenicity
蓖麻毒素（ricin toxin，RT）和相思子毒素（abrin
toxin，AT）均是植物来源的蛋白毒素，属于Ⅱ型核糖
体失活蛋白（ribosome- inactivating proteins，RIP）。
两种毒素在来源与制备、分子结构和作用机制方面
非常相似，由A、B两条多肽链通过二硫键相连接。
毒素A链具有RNA N-糖苷酶活性，是效应链；毒素
B链的帮助A链发挥毒性作用，为结合链[1，2]。其中，
[基金项目]武警后勤学院开放基金项目（WHKF201503）
[收稿日期]2015-06-10; [修回日期]2015-08-17
[作者简介]王俊虹，博士，讲师，主要从事生物战剂的侦检和防治
的研究。
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论 著
696
DOI:10.16548/j.2095-3720.2015.09.005
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RT的小鼠腹腔LD50为3.0 μg/kg，而AT的毒性更强，
是前者的75倍，即小鼠腹腔LD50为0.04 μg/kg[3]。由
于来源广、毒性强等特点，二者均被认为是重要的
致死性生物毒素战剂[4]，因此发展和研制毒素的双
价疫苗对提高国家应对生物恐怖袭击，具有重要的
军事意义和社会意义。
目前，针对毒素中毒免疫预防措施主要包括疫
苗主动免疫接种[3，5-9]和应用抗体进行治疗[1，2]两方
面。然而，无论是甲醛化处理的RT类毒素还是基
于A链蛋白的疫苗，均由于安全性问题限制了使
用。与基于A链蛋白的疫苗相比，文献报道B链亚
单位同样具有很好的免疫原性[4，10]，如RTB的无毒性
和佐剂活性，因此作为疫苗应用于人体就不存在毒
性的问题。未来疫苗研制的发展方向之一是多亚
单位疫苗。本研究旨在利用柔性linker连接两个毒
素的B链基因，形成嵌合体，分析RTB-ATB嵌合体
蛋白的抗原性和毒性，为下一步筛选安全有效的RT
和AT双价疫苗候选抗原奠定基础。
1 材料和方法
1.1 一般材料
1.1.1 菌株、质粒与细胞 以（G4S）3连接的目的基因
质粒pUC-RTB/ATB由生物公司合成；pMD18-T载
体（TaKaRa）；原核表达载体pQE-80L（Qiangen）；宿
主菌E.coli M15、人正常肺上皮细胞Beas-2B和胃黏
膜细胞GES-1均为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂 2×KOD PCR反应试剂（KOD DNA
聚合酶、PCR Buffer、dNTP 混合物）、DL2000 核酸
Marker、限制性内切酶 BamHⅠ、Hind Ⅲ（大连
TaKaRa）；质粒提取试剂盒（北京天根生物）；异丙
基-β-D巯基半乳糖苷（IPTG）（Promega）；5 ml镍预
装柱（GE healthcare）；HRP标记的山羊抗兔IgG（美
国Santa Cruz）；抗天然RT及AT毒素的兔多克隆抗
体均由本实验室制备；细胞毒性试验检测试剂盒
（Sigma）；其它化学试剂为国产分析纯。
1.2 方 法
1.2.1 编码序列的优化与合成 RTB 基因根据
GenBank检索所得序列（登录号：X52908），ATB基因
根 据 GenBank 所 得 氨 基 酸 序 列（登 录 号 ：
1908235A），以柔性linker-(G4S)3连接，并替换低频密
码子为高频密码子，在上、下游分别含BamH I、Hind
Ⅲ酶切位点，由南京金斯瑞公司合成，获得pUC-
RTB/ATB/E.coliTop10 F。
1.2.2 pQE80L- RTB/ATB 的构建 克隆测序载体
pUC-RTB/ATB和表达载体pQE-80L均经BamH I和
HindⅢ双酶切，并在16℃、T4 DNA连接酶作用下过
夜连接以构建pQE80L-RTB/ATB，连接产物转化至
E.coli M15感受态细胞中获得重组表达菌株，依次进
行PCR鉴定和酶切鉴定。
1.2.3 RTB-ATB的诱导表达 经PCR和酶切鉴定正
确的 M15/pQE80L-ATB 转接于 10 ml LB 培养基
（Amp，100 μg/ml）并在37℃条件下过夜培养。次日
再次按1:100比例转接于10 ml同样条件的LB培养
基，37℃，200 r/min振摇培养3~4 h至OD600为0.6~0.8
时，加 IPTG 至终浓度 1 mmol/L，30℃诱导 5 h。
12 000 r/min，4℃离心 5 min 集菌，并用 0.01 mol/L
PBS重悬，冰上超声破碎后分别收集上清及沉淀，经
SDS-PAGE鉴定。
1.2.4 RTB-ATB的纯化和定量 按 1.2.3 方法进行
500 ml E. coli M15/pQE80L-RTB/ATB诱导表达，收
集沉淀后经0.01 mol/L PBS洗涤2次，再分别用2%
Tritox-X100、2% Tween-20、1 mol/L NaCl、2 mol/L尿
素各洗涤 3次，然后加入Buffer A（20 mmol/L PB、
500 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑，8 mol/L尿素，pH
8.0），上清加入Ni柱中，咪唑洗脱得目的蛋白。将
RTB-ATB进行梯度透析复性，分别经4 mol/L尿素、
2 mol/L尿素、1 mol/L尿素、0.5 mol/L尿素和PBS缓
冲液，4℃条件下搅拌48 h以上，并用PEG20 000浓
缩。行SDS-PAGE电泳分析纯度和BCA法定量。
1.2.5 Western blotting印迹分析 SDS-PAGE电泳嵌
合体和M15/pQE80L空质粒表达的菌体蛋白，并转
移至硝酸纤维素薄膜，3% BSA封闭液中37℃温育
1 h后洗涤液洗膜3次（3 min/次），然后分别1:1 000
加入抗天然RT、天然AT兔多克隆抗体，室温孵育1
h后洗膜3次。再以1:50 000的二抗（HRP标记羊抗
兔IgG）室温孵育1 h，洗膜3次后经化学发光成像系
统成像。
1.2.6 RTB-ATB的毒性分析 采用MTS试剂盒测定
RTB-ATB和两种天然毒素对人正常肺上皮细胞
Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1的杀伤作用。1640培
养基培养人正常肺上皮细胞Beas-2B并计数为1×
104~2×104/孔，DMEM培养基胃黏膜细胞GES-1并计
数，分别以100 μl/孔加入96孔板中。空白孔只加细
胞培养基。37℃，5%CO2培养箱中生长24 h；分别用
2种培养基对测定蛋白（分别为RTB-ATB/天然AT，
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RTB-ATB/天然RT）进行5倍稀释后加入100 μl/孔
（RTB-ATB的初始浓度为1 mg/ml；AT的初始浓度
为20 ng/ml；RT的初始浓度为200 ng/ml），阴性对照
孔不加毒素；96孔板至5% CO2细胞培养箱中37℃，
培养 72 h；PBS洗板 3遍后 96孔板依次先后加入
100 μl培养基和20 μl试剂盒自带的MTS，并在37℃
条件下培养 2 h；Multiskan Mk3酶标仪上读取A490
值，并计算细胞生存率。
2 结 果
2.1 重组质粒的构建和鉴定
经优化共272个大肠杆菌稀有密码子被替换成
高频密码子，RTB-ATB全长1 647 bp，编码549个氨
基酸残基。图1显示PCR鉴定和酶切鉴定均正确。
M：DL2000 DNA marker；1：pQE80L-RTB/ATB的PCR扩增产物；
2：pQE80L-RTB/ATB酶切结果
图1 质粒pQE80L-RTB/ATB的鉴定
2.2 重组蛋白的诱导表达
目的蛋白以包涵体形式存在，相对分子质量为
60× 103 Da（图 2A），表达量约占全菌蛋白的
73.43%，纯化后蛋白纯度为98.9%（图 2B）。经复
性、浓缩后蛋白浓度约为0.58 mg/ml。
A：SDS-PAGE电泳图；B：RTB-ATB纯化曲线图；M：低分子量蛋白
marker；1：M15/pET80L-RTB/ATB诱导前产物；2：M15/pET80L-RTB/
ATB诱导后产物；3：细胞上清；4：细胞沉淀；5：RTB-ATB纯化后产物
图2 RTB/ATB纯化产物SDS-PAGE分析和纯化
2.3 重组蛋白的抗原性分析
图3显示，纯化后的嵌合体蛋白能分别与抗天
然AT、抗天然RT兔多抗体发生特异性反应，即嵌合
体保有RTB和ATB固有的抗原性。
M：低分子量蛋白marker；1：RTB-ATB与抗RT的兔多抗反应；
2：RTB-ATB与抗AT的兔多抗反应
图3 RTB-ATB的Western印迹分析
2.4 重组蛋白的毒性分析
细胞存活曲线说明RTB-ATB对正常肺上皮细
胞Beas-2B和胃黏膜细胞GES-1无毒性作用（图4、
5），说明重组蛋白RTB-ATB保留了RTB和ATB蛋
白的特性，即在缺乏A链的情况下，RTB和ATB均是
无毒性的蛋白。
A：相思子毒素和RTB-ATB的细胞杀伤作用曲线；
B：蓖麻毒素和RTB-ATB的细胞杀伤作用曲线
图4 人正常肺上皮细胞Beas-2B的杀伤作用曲线
A：相思子毒素和RTB-ATB的细胞杀伤作用曲线；
B：蓖麻毒素和RTB-ATB的细胞杀伤作用曲线
图5 人正常胃黏膜细胞GES-1的杀伤作用曲线
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3 讨 论
RT和AT均是植物来源的蛋白毒素，两者在分
子结构、作用机制等方面有相似性[1，2]。由于RT具
有毒性强、制备容易等特点，从一次世界大战起就
被视为生物武器加以研究[4]，而AT的毒性更是强于
RT，因此发展有效的防治手段已成为各国生防领域
的重要研究任务，而主动免疫是一种预防毒素中毒
的有效方法。
目前，关于RT的疫苗研制较多，而AT相关的生
防疫苗研制较少，基本包括2大类别，即基于A链的
疫苗和全毒素，两者皆因毒性问题而未在人体使
用。其中，RVEc[9]的研究思路与RiVax[4]相似，均是
基于RTA分子进行基因改造以减轻或消除酶活性
而成为候选疫苗，前者可保护（5~10）×LD50注射或
气溶胶状态天然毒素的攻毒，后者在不使用佐剂的
情况下，可以抵抗经腹腔摄入的10×LD50的RT攻
毒。AT疫苗方面，Han等[3]采用定点突变技术获得
ATA 突变体（mABRAE164AR167L），能抵抗 10×
LD50剂量的天然毒素攻毒，显示出良好的免疫原
性。Zhang等利用ATA的截断片段免疫小鼠可抵抗
40×LD50的AT攻毒[5]。
关于毒素B链的免疫原性则存在争议，有文献
报道B链的免疫原性不如A链，不适合做疫苗候
选。但也研究者认为证明B链亚单位同样具有很好
的免疫原性，而且其他毒素的B链蛋白已被证明是
一种良好的疫苗候选抗原[4，6]。此外，B链蛋白在毒
素中发挥结合链作用，因此在缺乏A链的情况下，B
链蛋白是无毒性的，这也是B链蛋白疫苗优于基于
A链蛋白或全毒素疫苗的优势。
与此同时，随着生物技术的发展而使多价疫苗
的出现成为可能。韩艳辉等将RTA突变体（mRI-
CAD75AV76MY80A）和ATA突变体（mABRAE164-
AR167L）相连，成功表达获得二价候选疫苗mRICA/
mABRA[4]。因此，本研究同样以柔性linker连接RTB
和 ATB，优化密码子后成功构建原核表达载体
pQE80L-RTB/ATB，嵌合体蛋白以包涵体形式存在，
经纯化后纯度达97%以上。经免疫印迹实验验证，
嵌合体蛋白能分别与相应的多克隆抗体发生抗原
抗体反应，且MTS细胞毒性试验结果表明嵌合体无
毒性，为下一步筛选疫苗奠定了基础。
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(责任编辑：张璐)
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