全 文 ：doi: 10．3969 ／ j．issn．1009－0002．2011．04．001 研究报告
重组蓖麻、相思子毒素 A链嵌合突变体的制备与分析
韩艳辉，张弢，康琳，高姗，辛文文，王景林
军事医学科学院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071
［摘要］ 目的：构建蓖麻毒素（RIC）、相思子毒素（ABR）A 链突变体的嵌合体蛋白，实现嵌合体蛋白的可溶性表达、
纯化及抗原性分析 。 方法 ： 采用柔性 linker 连接 RIC A 链突变体 （mRICAD75AV76MY80A） 和 ABR A 链突变体
（mABRAE164AR167L）， 构建嵌合体基因 mRICA ／mABRA， 将该嵌合体基因亚克隆至原核载体 pQE80L 构建表达质粒
pQE80L－mRICA ／mABRA，再转化至大肠杆菌 M15 获得表达工程菌株 M15 ／ pQE80L－mRICA ／mABRA，工程菌在 18℃
经 0．1 mmol ／ L 的 IPTG 诱导 14 h，表达的嵌合体蛋白经 Ni－NTA 亲和层析柱纯化，通过 ELISA 和 Western 印迹检测
嵌合体蛋白的抗原性。 结果：所获得的 mRICA ／mABRA 嵌合体基因经一致性比对分析，与预计嵌合基因的序列一致
性为 100％，其开放读框全长 1572 bp，编码 524 个氨基酸残基；重组表达质粒 pQE80L－mRICA ／mABRA 经 PCR 及
双酶切鉴定证明构建正确，嵌合体蛋白相对分子质量约为 62×103，与预测相符，可溶性的嵌合体蛋白经 Ni－NTA 亲
和层析柱纯化，纯度可达 99％；间接 ELISA 和 Western 印迹结果表明，嵌合体蛋白能同时与抗 RIC 多克隆抗体和抗
ABR 多克隆抗体发生特异的抗原抗体反应。 结论：得到的 mRICA ／mABRA 嵌合体蛋白具有良好的抗原性，为研制新
型 RIC 和 ABR 双价疫苗奠定了重要基础。
［关键词］ 蓖麻毒素；相思子毒素；突变体；嵌合体；抗原性
［中图分类号］ Q78 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1009－0002(2011)04－0453－05
Production and Characterization of a Recombinant Chimeric Protein
Consisting Mutant Ricin A Chain and Abrin A Chain
HAN Yan－Hui, ZHANG Tao, KANG Lin, GAO Shan, XIN Wen－Wen, WANG Jing－Lin
State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military
Medical Sciences, Beijing 100071, China
［Abstract］ Objective: To construct the chimeric protein mRICA ／mABRA consisting mutant ricin （RIC） A chain
and abrin （ABR） A chain, express it in the cytoplasm of Escherichia coli M15, and evaluate its antigenicity．
Methods: The chimeric gene mRICA ／mABRA was produced by connecting the genes of mutant ricin A chain
（mRICAD75AV76MY80A） and mutant abrin A chain （mABRAE164AR167L） via linker． The recombinant expression vector
pQE80L－mRICA ／mABRA was transformed into E．coli M15 for expression under induction of IPTG at 18℃． The
product was purified using chelating nickel－nitrilotriacetic acid （Ni－NTA） affinity chromatography, and then its
antigenicity was determined by ELISA and Western blot． Results: Both PCR and sequencing analysis proved that
recombinant plasmid pQE80L－mRICA ／mABRA was produced correctly, the sequence of chimeric gene mRICA ／
mABRA had a 100％ homology with the sequence of designed gene, with an open reading frame of 1572 bp,
which could encode the chimeric protein mRICA ／mABRA with 524 amino acid residues． The Mr of soluble ex-
pressed protein mRICA ／mABRA was approximately 62×103． The protein reached a purity of about 99％ after purifi-
cation, and showed specific affinity with both polyclonal antibodies against native ricin and abrin． Conclusion: This
study describes the generation of a substantial amount of chimeric protein mRICA ／mABRA from E．coli and the po-
tential application of mRICA ／mABRA as an effective chimeric vaccine candidate that can protect against ricin and
abrin simultaneously．
［Key words］ ricin A chain; abrin A chain; mutant; chimeric protein; antigenicity
蓖麻毒素 （ricin，RIC） 和相思子毒素（abrin，
ABR）都属于大分子植物毒素，由 A、B 多肽链通过
二硫键组成异二聚体。其中，A链具有 RNA N－糖苷
［收稿日期］ 2011－02－11
［基金项目］ 军队“十一五”计划专题（06Z069）
［作者简介］ 韩艳辉（1981－ ），女，硕士研究生
［通信作者］ 王景林，（E－mail）wangjl6481＠hotmail．com
生 物 技 术 通 讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．4 Jul．, 2011 453
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LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．4 Jul．, 2011
酶活性，能够抑制蛋白质合成，为效应链；B 链含有
2个半乳糖结合位点， 介导 A链进入细胞内发挥毒
性作用，为结合链[1－2]。 RIC小鼠腹腔 LD50为 3．0 μg ／
kg 体重， 其毒性至少是有机磷神经毒剂 VX 的 380
倍；而 ABR小鼠腹腔 LD50为 0．04 μg ／ kg体重，其毒
性是 RIC 的 75 倍[3－4]。 蓖麻籽、相思籽来源广泛，容
易获得，提取成本低廉，因此，这 2 种毒素作为毒素
战剂和恐怖剂的潜在威胁不容忽视[5－6]。 目前尚没有
同时针对这 2 种毒素中毒的预防疫苗，因此，发展
和研制蓖麻、相思子毒素双价疫苗，对提高国家生
物医学防护能力具有十分重要的意义。
RIC 和 ABR 的效应链都是 A 链， 文献报道在
RIC A 链中，Y80、Y123、E177、R180、N209和 W211位氨基酸
残基与 RIC 的酶活性密切相关，为关键性残基 [7－9]。
在 ABR A 链中，E164、R167 与 ABR 的酶活性密切相
关，而 Y74、Y113、W198与底物结合作用相关 [10－11]。 已有
学者通过关键氨基酸位点突变，报道了一种 RIC A
链突变体疫苗，已进入Ⅰ期临床试验，并取得了良
好的免疫效果[8－9，12]。根据这一思路，我们分别构建了
2 个突变体 mRICAD75AV76MY80A和 mABRAE164AR167L，利用
柔性 linker连接 2 个突变体基因，形成嵌合体，分析
mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白的抗原性，为筛选安全
有效的 RIC和 ABR双价疫苗候选抗原奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
宿主菌大肠杆菌 DH5α 和 M15 为本实验室保
存； 含有目的基因的质粒 pUC57－mRICA ／ mABRA
由南京金斯瑞生物科技公司合成；pMD18－T 载体、
PCR 反应试剂、DNA 片段琼脂糖凝胶回收试剂盒、
核酸 Marker 购自 TaKaRa 公司；N 端有 6×His 标签
的原核表达载体 pQE－80L 购自 Qiangen 公司 ；T4
DNA 连接酶及限制性内切酶 KpnⅠ、Hind Ⅲ等购
自 NEB 公司； 抗天然 RIC 兔多克隆抗体和抗天然
ABR兔多克隆抗体由本实验室制备；HRP 标记的山
羊抗兔 IgG购自 Santa Cruz公司；5 mL 镍预装柱购
自 GE Healthcare 公司；异丙基－β－D 巯基半乳糖苷
（IPTG）购自 Promega 公司；其他化学试剂为国产分
析纯产品。
1．2 嵌合体基因合成及引物设计
采用编码 6 个氨基酸的柔性 linker 基因连接编
码 mRICAD75AV76MY80A 和 mABRAE164AR167L 的基因片段 ，
得到嵌合突变体基因 mRICA ／ mABRA，其开放读框
全长 1572 bp，编码 524 个氨基酸残基，预测相对分
子质量约为 62×103。 根据大肠杆菌密码子偏好性对
所构建的嵌合突变体基因 mRICA ／ mABRA 进行密
码子优化，优化后的序列与原序列相比，362 个低频
使用密码子被替换成高频密码子，同时在 5＇ 端引入
KpnⅠ酶切位点、3＇端引入 HindⅢ酶切位点，设计好
的嵌合突变体基因序列由南京金斯瑞生物科技公
司合成。 此外，还设计扩增嵌合突变体基因片段的
上 下 游 引 物 P1 （5′ －CCGGTACCATCTTCCC-
GAAACAGTATCC G－3′，下划线部分为 KpnⅠ酶切
位点 ) 和 P2 （5＇ －CGC AAGCTTGTTCGGCGGAT-
TACAGAC－3′， 下划线部分为 HindⅢ酶切位点)，由
上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1．3 重组 mRICA ／ mABRA 嵌合突变体表达质粒的
构建
以质粒 pUC57－mRICA ／ mABRA 为模板 ，PCR
扩增 mRICA ／ mABRA 嵌合突变体基因片段。PCR产
物经 DNA 片段琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收
后，连接至克隆载体 pMD18－T，再转化感受态大肠
杆菌 DH5α，用 PCR 方法筛选阳性克隆，并送上海
生工公司测序鉴定。 用 KpnⅠ和 HindⅢ双酶切鉴定
质粒 pMD18T－mRICA ／ mABRA 和空载体 pQE－80L，
回收纯化载体片段和目的基因片段， 以 T4 DNA 连
接酶连接 ， 构建重组表达质粒 pQE80L－mRICA ／
mABRA， 转化感受态大肠杆菌 DH5α，PCR 筛选阳
性克隆，提取质粒，进行双酶切鉴定。
1．4 mRICA ／ mABRA 嵌合体工程菌的诱导表达
将鉴定正确的重组表达质粒 pQE80L－mRICA ／
mABRA 转化 M15 感受态细胞， 获得表达工程菌
M15 ／ pQE80L－mRICA ／ mABRA，经 PCR 和双酶切鉴
定正确后，挑新鲜单菌落，接种至 LB 培养基（含 100
μg ／ mL 氨苄青霉素和 50 μg ／ mL 硫酸卡那霉素）中
过夜振荡培养， 次日按 1∶100 的比例转接到 1000
mL 上述培养基中， 于 37℃、180 r ／ min 振摇培养至
D600nm 为 0．6， 加入 IPTG 至终浓度为 0．1 mmol ／ L，
18℃继续诱导 14 h；将诱导表达后的菌液离心收集
菌体，沉淀用 PBS 洗涤后，用 150 mL 超声裂解液悬
浮，置冰上进行超声破碎，10 000 r ／ min、4℃离心 15
min，分别收集上清和沉淀；将以上诱导前、诱导后全
菌样品和破菌后的上清及沉淀溶解液各取少量，进
行 15％ SDS－PAGE 鉴定。
1．5 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白的纯化及定量
收集菌体裂解上清， 依次经 3．0、0．8、0．45 μm
滤膜过滤，Ni－NTA 柱亲和层析，咪唑梯度洗脱目的
蛋白， 收集目的峰洗脱液，SDS－PAGE检测纯度，采
用 BCA 法对 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白进行定
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量。
1．6 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白的抗原性分析
纯化的 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白经 SDS－
PAGE 后， 转移至硝酸纤维素膜上进行 Western 印
迹分析，分别以抗天然 RIC 兔多克隆抗体和抗天然
ABR 兔多克隆抗体为一抗、HRP 标记的山羊抗兔
lgG为二抗，经 DAB显色。
将 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白用包被液进行
系列稀释 （2～20 μg ／ mL），100 μL ／孔包被酶联板 ,
分别以抗天然 RIC 兔多克隆抗体和抗天然 ABR 兔
多克隆抗体为一抗、HRP 标记的山羊抗兔 lgG 为二
抗进行 ELISA 检测。 分别以天然 RIC 和天然 ABR
为阳性对照，以空载体表达蛋白为阴性对照。
2 结果
2．1 克隆质粒 pMD18T－mRICA ／ mABRA 的鉴定
将重组克隆质粒 pMD18T－mRICA ／ mABRA 的
PCR 产物行 1％琼脂糖凝胶电泳， 扩增片段大小与
预期一致，约为 1572 bp（图 1），用 KpnⅠ、HindⅢ双
酶切鉴定质粒 pMD18T－mRICA ／ mABRA，也得到与
预期结果符合的目的片段（图 1），测序结果与所设
计优化的嵌合体基因编码序列完全一致，表明成功
构建了重组克隆质粒 pMD18T－mRICA ／ mABRA。
2．2 重组表达质粒 pQE80L－mRICA ／ mABRA 的构
建和鉴定
重组表达质粒 pQE80L－mRICA ／ mABRA 构建
如图 2， PCR 和双酶切鉴定均得到与预期结果大小
一致的片段（图 3），说明成功构建了重组表达质粒
pQE80L－mRICA ／ mABRA。
2．3 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白的诱导表达与纯
化
经 15％ SDS－PAGE 分析，表达工程菌株 M15 ／
pQE80L－mRICA ／ mABRA 在 18℃、 经 0．1 mmol ／ L
的 IPTG 诱导培养 14 h, 在上清有特异性蛋白表
达，相对分子质量约为 62×103，与预期的蛋白大小
相符（图 4A）。以 Ni－NTA亲和层析柱纯化上清液中
的目的蛋白， 在约 250 mmol ／ L 的咪唑浓度出现目
的洗脱峰（图 4B），一步纯化的 mRICA ／ mABRA 经
Totallab图像软件分析，纯度达 99％左右。 收集液合
并透析、 浓缩至 20 mL 左右，BCA 法定量蛋白浓度
约为 0．87 mg ／ mL，由此推算一步亲和纯化可获得约
17 mg ／ L的目的蛋白。
2．4 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白的抗原性分析
Western 印迹分析， 在相对分子质量 62×103附
近均有特异显色带出现 （图 5）， 说明 mRICA ／
mABRA 嵌合体蛋白既能被抗天然 RIC 兔多克隆抗
体所识别， 又能被抗天然 ABR 兔多克隆抗体所识
别，同时具有 RIC和 ABR的抗原性。 间接 ELISA结
果表明，2 μg ／ mL以上浓度 mRICA ／ mABRA 包被孔
均为强阳性，说明 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白能分
别与抗天然 RIC 兔多克隆抗体和抗天然 ABR 兔多
克隆抗体发生特异性的抗原抗体反应，进一步验证
了所获得的 mRICA ／ mABRA 嵌合体同时具有 RIC
和 ABR的抗原性。
图 1 质粒 pMD18T－mRICA ／mABRA的 PCR和双酶切鉴定
M1：DL2000 DNA marker；M2：DL8000 DNA marker；1：pMD18T －
mRICA ／mABRA PCR 扩增产物；2：pMD18T－mRICA ／mABRA 双酶切
前；3：pMD18T－mRICA ／mABRA经 KpnⅠ ／ HindⅢ双酶切产物
图 2 重组表达质粒 pQE80L－mRICA ／mABRA构建示意图
图 3 重组表达质粒 pQE80L－mRICA ／mABRA的 PCR和双酶切鉴定
M1：DL2000 DNA marker；M2：DL8000 DNA marker；1：pQE80L －
mRICA ／mABRA PCR 扩增产物；2：pQE80L－mRICA ／mABRA 双酶切
前；3：pQE80L－mRICA ／mABRA经 KpnⅠ ／ HindⅢ双酶切产物
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图 4 mRICA ／ mABRA 嵌合体表达及纯化产物的 SDS－PAGE 分析（A）和亲和纯化（B）
M：低分子量标准蛋白 marker；1：未诱导的工程菌；2：工程菌经 IPTG诱导后；
3：诱导后工程菌超声离心后上清；4：诱导后工程菌超声离心后沉淀；5：亲和层析纯化后的 mRICA ／ mABRA
3 讨论
在《禁止生物武器公约》中，RIC 和 ABR 已被列
为潜在的重要毒素战剂和生物恐怖战剂 [1]，对有可
能受到 RIC 和 ABR 威胁的人员接种疫苗进行主动
免疫保护，是惟一有效的医学对策[13]。 目前关于 RIC
和 ABR 的疫苗研究，一种是将天然蓖麻、相思子毒
素经甲醛化脱毒处理成为类毒素疫苗 [14－17]，虽有良
好的免疫保护作用，但制备过程繁琐，对操作人员
有潜在的危险性，特别是甲醛脱毒存在的残留毒性
会引起严重的毒副作用；另一种是经化学方法去糖
基化的 RIC A 链亚单位疫苗 [18]，虽然无毒，但有引
起局部或全身血管渗漏综合症的可能[9，19]。 近年来，
美国 Taxas大学西南医学中心的 Vitetta 科研小组研
究报道了一种重组 RIC A 链突变体疫苗 Rivax
（Y80A ／ D75A 和 Y80A ／ V76M）， 经肌肉途径免疫后
的小鼠， 可以抵抗经腹腔摄入的 10×LD50 的天然
RIC 的攻毒。 随后，这种新型重组 RIC A 链突变体
疫苗进入Ⅰ期临床试验，志愿者免疫血清产生了中
和抗体，并具有良好的安全性[8－9，12]。
通过对 RIC A 链和 ABR A 链关键氨基酸位点
的定点突变， 我们成功地获得了 RIC A 链突变体
（mRICAD75AV76MY80A） [20] 和 ABR A 链 突 变 体
（mABRAE164AR167L）。细胞毒性实验结果表明，2个突变
体对人肝癌细胞 SMMC－7721 和骨髓瘤细胞 Sp2 ／ 0
的杀伤作用较之未突变前其 IC50明显升高， 其毒性
与天然 RIC 和 ABR 相比，均降低到原来的 1 ／ 8000～
1 ／ 10 000，获得了预期的减毒突变体蛋白。 在本研
究中，我们利用柔性 linker 连接 2 个突变体基因，构
建了长度为 1572 bp的嵌合突变体基因。 有研究表
明[21]，某些嵌合蛋白之间若无 linker 存在，则各亚单
位组分的抗原性会丢失， 引入 linker 则可以恢复嵌
合蛋白中亚单位组分各自的抗原性。 因此，linker 是
嵌合蛋白中不可缺少的重要组成部分。 本研究选用
的 linker 编码 6 个氨基酸（GSGGSG），DNAstar 软件
分析该 linker 具有良好的柔韧性， 有利于嵌合蛋白
空间结构的形成。 此外，通过将 mRICAD75AV76MY80A和
mABRAE164AR167L设计成嵌合体蛋白来表达，不仅克服
了物理、 化学方法结合不同抗原的条件难以控制，
各批次间样品差异大，以及效率较低的缺点，而且
图 5 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白的 Western 印迹分析
A：SDS－PAGE 对照胶经考马斯亮蓝染色；B：以抗天然 RIC 兔多克隆抗体为一抗的 Western 印迹；C：以抗天然 ABR兔多克隆抗体为一抗的
Western 印迹；M：低分子量标准蛋白 marker；1：mRICA 阳性对照；2，4：mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白；3：mABRA 阳性对照
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简化了抗原纯化制备成本。
许多外源蛋白在原核宿主大肠杆菌内表达时，
往往不能自发正确折叠成有一定空间结构和特定
生物功能的蛋白质，而是以一种不溶性的沉淀即包
涵体的形式存在。 我们通过选择 pQE80L、pQE30、
pET－28a、pTIG－Trx 等不同原核表达载体，并采用低
温、低 IPTG浓度诱导，获得了 mRICA ／ mABRA 嵌合
体蛋白的可溶性表达，其中，尤以 pQE80L 载体表达
最成功，嵌合体蛋白的可溶性表达量为 17 mg ／ L，大
大方便了 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白的纯化和应
用。
我们首次通过柔性 linker 连接 mRICAD75AV76MY80A
和 mABRAE164AR167L突变体基因， 在大肠杆菌中获得
了 mRICA ／ mABRA 嵌合体蛋白的可溶性表达，并保
留了 2 种毒素的抗原性， 为下一步研究 RIC、ABR
双价疫苗奠定了基础。
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