全 文 ：中国生物制品学杂志 2009年 5月第 22卷第 5期 Chin J Biologicals May 2009，Vol. 22 No. 5
相思子毒素和蓖麻毒素是常见的两种植物毒
素，具有很强的毒性。蓖麻毒素的毒性是氰化物的
6 000倍，而相思子毒素的毒性比蓖麻毒素还高 70
多倍［1］。相思子和蓖麻植物资源丰富，分布广泛，提
取简单，容易成为恐怖袭击的工具［2］，而误食这两
种植物的种子造成中毒的事件也时有发生。准确、快
速检测和鉴定蓖麻毒素及相思子毒素是应对生物恐
怖和预防中毒的有效方法［3］。随着蛋白质芯片技术
的发展，生物毒素快速检测有了更先进的方法。本实
验以抗原抗体反应为原理，建立了相思子毒素和蓖
麻毒素的蛋白质芯片检测技术，为其进一步应用奠
定了基础。
1. 材料与方法
1. 1 细胞株
相思子毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株由吉林大
学畜牧兽医学院李小兵博士惠赠；蓖麻毒素单克隆
抗体杂交瘤细胞株由军事医学科学院军事兽医研究
所刘文森博士惠赠。
1. 2 试剂及仪器
相思子毒素抗原由吉林大学畜牧兽医学院李小
兵博士惠赠；蓖麻毒素抗原由军事医学科学院军事
兽医研究所刘文森博士惠赠；单增李斯特菌 ActA蛋
白及单增李斯特菌单克隆抗体由军事兽医研究所五
室保存；HRP标记的羊抗鼠 IgG购自北京鼎国生物
技术有限责任公司；Cy3 标记的羊抗鼠 IgG 购自
Amersham 公司；RPMI1640 培养基和二甲基亚砜均
购自GIBCOBRL公司；HEPES和 TMB均购自 Promega
公司；Tween-20和 BSA均购自 Sigma公司；高分子
三维基片购自北京博奥生物芯片有限责任公司；Hi－
Trap Protein A HP 亲合层析柱购自 GE Healthcare
公司；MicroGridⅡTAS芯片点样仪购自 BioRobotics
Coporation 公司；Personal4100A 型芯片扫描仪购自
GemePix公司。
1. 3 实验动物
SPF级 BALB/c小鼠，7 ~ 8周龄，购自长春生物
制品研究所实验动物室。
1. 4 腹水的制备及单抗的纯化
将杂交瘤细胞注射至 BALB ／ c小鼠腹腔，经 10 d
左右采集腹水，4 000 r ／ min 离心 5 min，用辛酸-硫
酸铵法进行初步纯化［4］。初步纯化的抗体经 Hitrap－
Protein A HP亲和层析柱纯化后，进行 SDS-PAGE分
析，采用 Bradford法测定单抗浓度。
1. 5 单抗亲和力的测定
按文献［5］方法测定单抗的亲和力。以 2 μg ／ ml
作者单位：1吉林大学畜牧兽医学院（长春 130062）；2军事医学
科学院军事兽医研究所（长春 130062）.
通讯作者：王兴龙，E-mail：wangxl-2006@163.com
中国图书分类号 S-3 Q816 文献标识码 A 文章编号 1004-5503（2009）05-0508-03 【实验技术】
蓖麻毒素和相思子毒素蛋白质芯片检测方法的建立
路浩 1 王兴龙 2 李晓艳 2 郎需龙 2 唐婕 2 张付贤 1 王英超 1 党源 1
【摘要】 目的 建立蓖麻毒素和相思子毒素蛋白质芯片检测方法。方法 制备并纯化蓖麻毒素和相思子毒素单克隆抗
体。采用竞争免疫法检测抗原，建立检测蓖麻毒素和相思子毒素的蛋白质芯片检测方法。应用蛋白质芯片检测两种毒素的模拟
样品。结果 应用蛋白质芯片检测蓖麻毒素、相思子毒素和两种毒素混合的模拟样品时，在其相应区域均没有荧光信号，结果为
阳性，与实验设计相符。结论 已成功建立了蓖麻毒素和相思子毒素蛋白质芯片检测方法，该方法具有广阔的应用前景。
【关键词】 蓖麻毒素；相思子毒素；蛋白质芯片
Development of Protein Chip Technique for Detection of Abrin and Recin
LU Hao△, WANG Xing-long, LI Xiao-yan, et al（△The Military Veterinary Institute, Military Academy of Medical
Science, Changchun 130062, China）
【Abstract】 Objective To develop a protein chip technique for detection of abrin and recin. Methods The McAbs against
abrin and recin were prepared and purified, based on which a protein chip for detection of antigens by competitive immunoassay was
prepared and used for detection of mock samples of abrin and recin. Results No fluorescent signals were observed in corresponding
regions of mock samples of abrin, recin and their mixture by using the prepared protein chip, indicating positive results consistent with
those designed. Conclusion The protein chip technique for detection of abrin and recin was successfully developed, which was of a
broad prospect in application.
【Key words】 Abrin; Recin; Protein chip
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DOI：10.13200/j.cjb.2009.05.89.luh.026
中国生物制品学杂志 2009年 5月第 22卷第 5期 Chin J Biologicals May 2009，Vol. 22 No. 5
A B C
（Ag）和 1 μg ／ ml（Ag′）的抗原分别包被酶标板；等
比稀释一抗，加入酶标板中，37℃ 温育 1 h；洗涤后
与 HRP标记的羊抗鼠 IgG 37℃ 温育 1 h，酶标仪测
定 A492值。用抗体浓度对数与 A492值作曲线，分别求
出 50%抗原饱和时的抗体浓度［Ab］t、［Ab′］t，按下式
计算抗体的亲和常数。
抗体亲和常数（Kaff）＝ 1 ／ 2（2［Ab′］t -［Ab］t）
1. 6 蛋白质芯片的制备
将相思子毒素和蓖麻毒素抗原分别溶于 80%
的丙三醇中，终浓度为 0. 1 mg ／ ml，作为检测抗原；
将 Cy3标记的羊抗鼠 IgG溶于丙三醇中，终浓度为
10 μg ／ ml，作为坐标点；将 PBS溶于丙三醇中，作为
空白对照；单增李斯特菌 ActA蛋白作为阴性对照。
点样温度为 20 ℃，湿度为 70%。使用 MicroGridⅡ
TAS芯片点样仪，采用夹缝针在高分子三维基片表
面进行点样。点样矩阵图见图 1。制备好的蛋白芯片
保存于 4 ℃ 备用。
图 1 点样模式图
Fig 1. Array layout
1. 7 蛋白质芯片反应检测
采用竞争免疫法检测抗原。取 4℃保存的蛋白芯
片，加入 3% BSA，37℃封闭 1 h，PBST（0. 01%PBS，
20%Tween-20，pH 7. 4）洗涤。将相思子毒素单抗、蓖
麻毒素单抗和单增李斯特菌单抗稀释至相同浓度后
混合，使每种单抗的终浓度均为 5 μg ／ ml，作为捕捉
抗体。分别将相思子毒素蛋白、蓖麻毒素蛋白和同时
含有这两种蛋白的溶液作为模拟样品。将捕捉抗体
与模拟样品以 1 ∶ 10 的比例（v ／ v）混合，37℃反应
1 h。将反应产物分别加至蛋白质芯片上，每围栏矩
阵加 25 μl，37℃ 作用 1 h。PBST 洗涤后，加入
0. 3 μg ／ ml的 Cy3荧光标记的羊抗鼠 IgG，每围栏
矩阵加 25 μl，37℃作用 1 h。反应后的芯片用 37℃
预热的 PBST洗涤，Personal 4100A型芯片扫描仪扫
描图像。如待检物质中含有目标抗原，芯片扫描无荧
光信号，而阴性点有荧光信号。
2. 结果
2. 1 单抗的纯化
纯化的相思子毒素和蓖麻毒素单抗经 SDS-
PAGE分析，均可见轻链和重链。相思子毒素单抗的
相对分子质量约为 81 000，蛋白含量为 2. 14 mg ／ ml，
抗体含量为 1. 16 mg ／ ml；蓖麻毒素单抗的相对分
子质量约为 73 000，蛋白含量为 1. 45 mg ／ ml，抗体
含量为 0. 96 mg ／ ml。见图 2。
1：未纯化的腹水；2：纯化的蓖麻毒素单抗；3：蛋白质
marker；4：纯化的相思子毒素单抗
图 2 纯化单抗的 SDS-PAGE分析
Fig 2. SDS-PAGE profile of purified McAbs
2. 2 单抗的亲和力
经计算，相思子毒素和蓖麻毒素单抗的亲和常
数分别为 2. 9 × 108 ／ mol和 3. 2 × 109 ／ mol。
2. 3 蛋白质芯片反应结果
在模拟样品芯片图像中，坐标点信号值正常，说
明点样过程正常。阴性点单增李斯特菌信号明显，空
白对照点没有信号。在检测相思子毒素、蓖麻毒素和
两种毒素混合的模拟样品时，在其相应区域均没有
荧光信号，结果为阳性，与实验设计相符，见图 3。表
明本实验制备的蛋白质芯片达到了检测这两种毒素
的设计要求。图中两个矩阵作为平行试验，得到了一
致信号值，确保了芯片的整体稳定性。
相思子毒素
坐标
空白对照
蓖麻毒素
阴性对照
1 2 3 4 Mr
93 000
66 200
45 000
35 000
20 000
14 400
A：相思子毒素；B：蓖麻毒素；C：两种毒素的混合样品
图 3 蛋白质芯片反应结果图
Fig 3. Determination of mock samples of abrin and recin by protein chip technique
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中国生物制品学杂志 2009年 5月第 22卷第 5期 Chin J Biologicals May 2009，Vol. 22 No. 5
3. 讨论
胶体金试纸条是常用的检测毒素的方法之一，
效果较好，但检测样品种类单一，不能高通量对大量
样品进行快速检测。蛋白质芯片技术为毒素的高通
量检测提供了先进的方法。本实验采用竞争免疫的
方法检测抗原［6］。反应原理为：在芯片基质上点样
一定浓度的抗原，制备抗原蛋白检测芯片，使用单克
隆抗体捕捉待检样品中的抗原。抗体与待检物质反
应后，将反应产物与芯片反应，洗涤除去与待检物质
中相应抗原结合的单克隆抗体。如果样品中没有抗
原，单克隆抗体就会与芯片上的抗原结合。再使用荧
光标记的二抗与芯片反应，扫描图像。待测样品中目
标抗原的量与荧光强度成反比，即如果待测物质中
有目标抗原，芯片扫描则没有荧光信号，而阴性反应
有荧光信号。
蛋白质芯片检测系统中，保持芯片上各种抗原
物质的活性十分重要，采用适当的基片可以长时间
保持点样抗原的活性。抗体混合物与被检物质的反
应时间需要逐步优化［7～9］。如反应时间过短，抗体与
被检抗原就不能充分结合，在芯片结合后就会造成
检测信号值有误差；如反应时间过长，单抗在 37℃
的温度下效价和亲和力就会下降，其中未结合的抗
体与芯片结合时效率会下降，可能出现假阳性。本实
验合理设计了多个对照点，监测各步反应：标记 Cy3
的羊抗鼠 IgG作为阳性坐标探针，还可以监测蛋白
芯片制备过程中蛋白的结合情况；PBS作为空白对
照点，可以监测点样过程是否有样品相互污染；单增
李斯特菌 ActA作为阴性对照，不仅可以监测反应过
程中是否有交叉污染，由于其反应过程中只加了二
抗，还可以作为芯片与二抗反应的对照。
相思子毒素和蓖麻毒素是结构上十分相近的两
种毒素，相思子毒素的 A链与蓖麻毒素的 A链存在
102个相同的氨基酸残基，在很多检测方法中，这两
种毒素常被用来相互作特异性鉴定［1，10］。本实验将
两种毒素点样在同一芯片上，单抗混合后同时对样
品进行检测。通过实验结果目标点的特异性证明，本
毒素检测蛋白芯片具有良好的特异性。
实验中发现，蛋白芯片检测还存在一些问题，如
样品的富集不能像多聚酶链反应一样可以扩增样
品。尽管如此，蛋白芯片仍是一种检测毒素的先进技
术，具有广阔的应用前景。
参考文献
［1］Bradberry S. Ricin and abrin. Medicine, 2007, 35（10）: 576-577.
［2］Olsnes S. The history of ricin, abrin and related toxins. Toxin,
2004, 44（4）: 361-370.
［3］Ler SG, Lee FK, Gopalakrishnakone P. Trends in detection of war－
fare agents——detection methods for ricin, staphylococcal entero－
toxin B and T-2toxin. J Chromatogr A, 2006, 1133（1-2）: 1-12.
［4］董志伟，王琰. 抗体工程. 2 版. 北京: 北京医科大学出版社，
2002: 280-281.
［5］Guglielmo-Viret V, Thullier P. Comparison of an electro－
chemiluinescence assay in plate format over a colorimetric ELISA,
for the detection of ricin B chain（RCA-B）. J Immunol Mtd, 2007,
328（1-2）: 70-78.
［6］Du HW, Wu MT, Yang WP, et al. Development of miniaturized
competitive immunoassays on a protein chip as a screening tool for
drugs. Clin Chem, 2005, 51（2）: 368-375.
［7］Rucker VC, Havenstrite KL, Herr AE, et al. Antibody microarrays
for native toxin detection. Anal Biochem, 2005, 339（2）: 262-270.
［8］Du HW, Lu Y, Yang W, et al. Preparation of steroid antibodies and
parallel detection of multianabolic steroid abuse with conjugated
hapten microarray. Anal Chem, 2004, 76（20）: 6166-6171.
［9］Kim SW, Kim MG, Jung HA, et al. An application of protein mi－
croarray in the screening of monoclonal antibodies against the oys－
ter mushroom spherical virus. Anal Biochem, 2008, 374（2）: 313-
317.
［10］李小兵，谢光洪，周昌芳，等． 相思子毒素-α的纯化及鉴定. 中
国兽医学报，2008，28（3）：310-313.
（收稿日期：2008-12-23）
征 稿
【消息】
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