全 文 :第35卷第2期 西 南 大 学 学 报 (自然科学版) 2013年2月
Vol.35 No.2 Journal of Southwest University(Natural Science Edition) Feb. 2013
文章编号:1673-9868(2013)02-0027-08
不同树龄凹叶厚朴7种次生代谢产物积累研究①
谌金吾1, 杨占南1, 胡庭坤2,
王凤英1, 孙际薇1, 孙 敏1
1.西南大学 生命科学学院,重庆400715;2.贵阳市中药材生产管理办公室,贵阳550081
摘要:目的:建立研究同一地域来源、不同树龄的凹叶厚朴7种次生代谢产物质量分数变化,为确定凹叶厚朴最佳
采收条件提供参考依据.方法:利用高效液相色谱法(HPLC)对绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、和厚朴
酚与厚朴酚进行分离,并建立标准曲线及回归方程.分析随着树龄的增加,其叶、枝皮、茎皮和根皮中7种次生代
谢产物质量分数积累情况.结论:不同树龄的凹叶厚朴叶片、枝皮、茎皮和根皮中7种代谢产物质量分数随着树龄
积累差异较大,绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素等主要存在于在树龄相对较小的叶片和枝皮中,随着树
龄从7年增加至26年其积累变化不明显;厚朴酚与和厚朴酚主要分布于凹叶厚朴的树皮中,其中根皮质量分数最
高,茎皮、枝皮次之;7至13年树龄的植株,其厚朴酚与和厚朴酚积累量随树龄增加而明显增加,13至26年树龄
的植株随树龄增加二者积累量增幅不大.因此,凹叶厚朴的最适采收对象是树龄超过13年之后的植株.
关 键 词:树龄;凹叶厚朴;HPLC法;次生代谢产物
中图分类号:Q946 文献标志码:A
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.etWils.Var.biloba Rehd.etWils)为木兰科(Magnoliaceae)木
兰属(Magnolia)木兰亚属(Magnolia Subgenus)皱皮木兰组植物[1-2].凹叶厚朴与其同属植物厚朴(M.
officinalis Rehd.e tWils)均为国家重点保护濒危植物[3].因分布差异,凹叶厚朴常被称为“温朴”,主要分
布于湘、浙、桂、闽等省,叶型为凹型叶;而厚朴则被称为“川朴”,主要分布于鄂、川等省,其叶为小凸尖
型叶[4],中药“厚朴”即为二者的干燥根皮、茎皮和枝皮[5],具有温中下气、燥湿消痰、下气除满之功效,味
苦、辛、湿,归脾、胃、肺、大肠经,中医上常用来治疗湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘等.中药
厚朴的化学成分有绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、和厚朴酚与厚朴酚等,药用成分主要是和厚
朴酚与厚朴酚[6].和厚朴酚属于酚羟基类化合物,具有扩张血管、抗炎、抗菌、抑制血小板聚集和抗心律失
常等多种药理作用;厚朴酚属于联苯羟基化合物,具有抗菌、中枢神经镇静、肌肉松弛、抗溃疡等药理作
用[7],临床上广泛用于疼痛、感冒以及抗焦虑等方面的治疗[8].和厚朴酚与厚朴酚质量分数常占原药材的
5%~12%,二者质量分数在来源地域间、种源内家系间和家系内单株间存在显著差异[9].高效液相色谱法
(HPLC)是目前广泛应用于研究植物次生代谢产物的方法[10],孙全明等[11]用其分析复方中和厚朴酚与厚
朴酚,曾宝等[12]用其分析和厚朴酚在细胞模型中药物代谢相关因素.本研究采用 HPLC法研究了同一地
域来源不同树龄的凹叶厚朴树皮(根皮、茎皮和枝皮)和叶片中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、
① 收稿日期:2012-05-22
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81102796).
作者简介:谌金吾(1979-),男,贵州天柱人,博士研究生,主要从事药用植物生物技术及重金属植物修复的研究.
通信作者:孙 敏,教授,博士生导师.
和厚朴酚与厚朴酚7种次生代谢产物随着树龄增加的积累变化情况.
1 材料与试剂
1.1 植物材料
凹叶厚朴2011年5月8日采集于贵州省黎平县东风林场,采集树龄分别为7年、1 0年、13年和26
年,每个年份采集5棵植株,分别编号为7yr、10yr、13yr和26yr,植株林业性状见表1.每棵植株随机
采集叶片、枝皮、茎皮和根皮各3份,于烘箱60℃烘干至恒重.
表1 植物材料的林业性状
编号 树龄/a 茎高/m 胸径/cm 冠辐/m2
7yr 7 4~6 5~9 3~9
10yr 10 8~14 8~17 10~16
13yr 13 10~14 13~16 15~25
26yr 26 8~14 12~19 15~25
1.2 仪器和试剂
LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津)、ACCULA电子天平(北京赛多利斯)、DHG-9140A 电热恒温鼓
风干燥箱(上海齐欣)、超声波清洗剂(广州华南)、微型粉碎机(天津市泰斯特).
色谱纯乙腈和甲醇(Honeywel Burdick &Jackson,USA)、色谱纯甲酸(成都科龙)、纯净水(重庆乐百氏).
和厚朴酚、绿原酸、芦丁、槲皮苷、槲皮素和金丝桃苷购于昆明科翔生物科技有限公司;厚朴酚购于中
国药品生物制品检定所,所有标准品纯度均≥98%.
2 方 法
2.1 次生代谢产物提取及标准品配制
取干燥的植物材料分别用微型粉碎机粉碎后过80目筛,准确称取0.100 0g的样品置于250mL三
角瓶中,加入20mL甲醇超声提取30min后取出放冷,损失体积用甲醇补齐,0.45μm滤膜过滤后放于
4℃冰箱中备用.分别精密称取绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、和厚朴酚、厚朴酚标准品各
10.00mg,置于7个10mL的容量瓶中以甲醇定容得1mg/mL的7种对照品母液.分别取各对照品母
液1mL加入1个10mL容量瓶中,甲醇定溶、摇匀得含绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、和
厚朴酚、厚朴酚均为100mg/L的混合对照品溶液.
2.2 HPLC检测方法的建立
用混合标准品溶液多次进样优化得到7种次生代谢产物的 HPLC检测条件:色谱柱Shim-pack CLC-
ODS(SN:61526630,Dim.150mm×6.0mm,Particle Sz.5μm),流动相A相为0.1%甲酸,B相为乙
腈,柱温35℃、进样量20μL、流动相和总流量的时间洗脱梯度见表2.PDA全波长扫描,记录210nm峰
面积折算绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素和厚朴酚与厚朴酚质量分数.
表2 流动相的洗脱梯度
时间/min A相/% 总流量/(mL·min-1) 时间/min A相/% 总流量/(mL·min-1)
0.01 95 0.8 45 30 1.4
10 95 0.8 46 0 0.4
37 40 0.4 50 95 0.8
38 30 1.4 60 95 0.8
2.3 方法精密度和稳定性考察
取混合对照品溶液1天内每隔3h进样1次,连续进样6次,根据6次峰面积的相对偏差(RSD%)计
算精密度;取同一样品溶液,分别在第0,8,16,24,32,48h时进样,根据6次进样峰面积相对偏差(RSD%)
计算样品的稳定性.
82 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第35卷
2.4 凹叶厚朴7种次生代谢产物质量分数测定
标准曲线测定凹叶厚朴7种次生代谢产物质量分数.将100mg/L混合对照品溶液按照2倍梯度稀释
法,稀释4次,得到分别含有绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、和厚朴酚与厚朴酚100,50,25,
12.5,6.25mg/L混合对照品标准溶液.然后按照2.2方法进样并记录峰面积,以峰面积为纵标(y)、质量
分数为横标(x)绘制标准曲线得回归方程.样品也按照2.2方法测定并记录峰面积,按标准曲线所得回归
方程计算质量分数.
3 结果与分析
3.1 HPLC检测方法建立
按照2.2方法进样,所得图谱如图1所示,7种物质标准品可很好的实现分离.
图1 7种标准品HPLC图谱
3.2 方法精密度及样品稳定性考察
由图2、图3和表3可知,7种标准品在6次进样峰面积的相对偏差均小于2.5,说明所建立的 HPLC
方法有很好的精密度;样品的48h考察相对偏差均小于1,说明样品在48h很稳定.
图2 HPLC法精密度
图3 样品稳定性
表3 精密度和稳定性的相对标准偏差
RSD 绿原酸 芦丁 金丝桃苷 槲皮苷 槲皮素 和厚朴酚 厚朴酚
稳定性/% 2.45 1.00 1.98 0.83 3.91 0.89 0.91
精密度/% 0.52 0.26 0.13 0.52 0.96 1.18 0.94
92第2期 谌金吾,等:不同树龄凹叶厚朴7种次生代谢产物积累研究
3.3 凹叶厚朴次生代谢产物质量分数测定
采用HPLC法建立的凹叶厚朴7种次生代谢产物标准曲线,峰面积和对照品的质量分数有着良好的线
性相关性,R2 值在0.999 4~0.999 9之间,表明在6.26~100mg/L范围内,绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲
皮苷、槲皮素、厚朴酚与和厚朴酚的质量分数与相应的峰面积呈良好的线性关系,如图4.
图4 7种标准品的标准曲线图与线性方程
不同树龄凹叶厚朴叶片中绿原酸质量分数平均为1 518mg/kg,其中以13年树龄质量分数最高,为
2 367mg/kg,以26年树龄最低,为714mg/kg;芦丁在低树龄叶片中质量分数较高,以7年树龄4 918mg/kg
为最高,树龄在10年以上质量分数都在1 500mg/kg左右;金丝桃苷平均质量分数124mg/kg,10年树龄
的叶片中没有检测到;槲皮苷在7年树龄中质量分数最高,为6 553mg/kg,随树龄的增加质量分数有所降
低,10年以上树龄叶片的质量分数在840mg/kg左右;槲皮素仅在10年和26年树龄中检测出,质量分数
均低于50mg/kg.和厚朴酚与厚朴酚的质量分数平均为684mg/kg和527mg/kg,最大质量分数出现在
10年树龄叶片中.7种次生代谢产物在叶片质量分数变化见图5(a)-叶.
不同树龄凹叶厚朴枝皮的绿原酸平均质量分数达到2 711mg/kg,随着树龄增加绿原酸质量分数随
之增加,最高质量分数3 654mg/kg出现在13年树龄枝皮中.芦丁在不同树龄枝皮中质量分数平均为
571mg/kg,10年树龄质量分数最高为1 205mg/kg.金丝桃苷仅见于7年树龄枝皮中,槲皮苷和槲皮素仅
见于10年树龄枝皮中,且质量分数均很低.和厚朴酚与厚朴酚质量分数平均为4 240mg/kg和9 724mg/kg,
随着树龄增加质量分数均有增加,最高出现在26年树龄枝皮中,分别为5 697mg/kg和16 021mg/kg,最低
质量分数出现在7年树龄枝皮中,分别为1 186mg/kg和3 464mg/kg.7种次生代谢产物在枝皮质量分数积
累变化见图5(b)-枝皮.
不同树龄凹叶厚朴茎皮中绿原酸质量分数,平均值为4 260mg/kg,最高出现在13年树龄茎皮中,最
低质量分数出现在7年树龄茎皮中;芦丁在凹叶厚朴茎皮中质量分数平均为702mg/kg,树龄变化对其质
量分数积累影响不显著;金丝桃苷仅在13年树龄检测到,质量分数为311mg/kg;槲皮苷仅在10年和13
年树龄茎皮检测到,质量分数在70mg/kg左右,槲皮素在茎皮中没有检测到;和厚朴酚与厚朴酚质量分数在
茎皮中质量分数较高,平均分别为19 593mg/kg和25 504mg/kg,从7年树龄增加到13年树龄质量分数有明
显增加,树龄从13年增加到26年质量分数基本不变,和厚朴酚最大质量分数28 147mg/kg出现在13年树龄
茎皮中,厚朴酚最大质量分数31 965mg/kg出现在26年树龄茎皮中.7种代谢产物在茎皮质量分数积累见图
5(c)-茎皮.
不同树龄凹叶厚朴的根皮绿原酸和芦丁质量分数积累变化较大,平均分别为929mg/kg和603mg/kg;
03 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第35卷
金丝桃苷仅在26年树龄根皮检测到,质量分数为297mg/kg;槲皮苷和槲皮素在所有树龄根皮中均未检测
到.和厚朴酚与厚朴酚在不同树龄根皮中平均质量分数分别为50 322mg/kg和54 868mg/kg,和厚朴酚
从7年到13年树龄质量分数明显增加,到26年树龄质量分数有降低,最高质量分数出现在13年树龄根
皮中,为71 574mg/kg;厚朴酚从7年树龄到13年树龄质量分数在48 000mg/kg左右,26年树龄最高
为74 328mg/kg.7种次生代谢产物在根皮质量分数积累见图5(d)-根皮.
图5 凹叶厚朴叶、枝皮、茎皮和根皮中的7种次生代谢产物积累
不同树龄凹叶厚朴叶片、枝皮、茎皮和根皮中7种代谢产物质量分数随着树龄积累差异较大,绿原酸、
芦丁、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素主要分布于树龄相对较低的叶片和茎皮中,随着树龄从7年增加至26年
积累变化不明显,特别是金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素3种次生代谢产物分布极不均匀,仅在树龄相对较低
的7年有相对很低质量分数,故下面分析中仅以绿原酸、芦丁、和厚朴酚与厚朴酚作为研究对象对质量分
数与树龄进行回归分析.以凹叶厚朴树龄为自变量,以7种次生代谢产物为因变量,分析绿原酸、芦丁、和
厚朴酚与厚朴酚等4种次生代谢产物随着树龄增加在叶片、茎皮、枝皮和根皮中都凹叶厚朴不同部位质量
分数变化趋势如图6.
由图6可知,绿原酸在凹叶厚不同部位、不同树龄中的情况不同,在7年树龄中的蓄积量从大到小依
次为叶、枝皮、茎皮、根皮;在10年树龄与13年树龄中的蓄积量从大到小依次为枝皮、茎皮、叶、根皮;
在26年树龄中的蓄积量从大到小依次为枝皮、茎皮、根皮、叶.随着树龄的变化绿原酸积累不同,在叶中
积累量从大到小依次为13年、7年、10年、26年;在枝皮和茎皮中积累量从大到小依次为13年、10年、
26年、7年;在根皮积累量从大到小依次为26年、7年、10年、13年.综观不同的树龄和不同的部位绿原
酸质量分数积累可以发现,树龄13年中枝皮、茎皮和根皮质量分数相对最高,其次是10年茎皮、枝皮,然
后是所有树龄的叶,质量分数最低的是7年树龄根皮.从曲线方程线性来看4种次生代谢产物质量分数线
性关系与树龄都不显著,这是因为凹叶厚朴为落叶乔木,树叶的更替时间为1年,而我们采样7,10,13,26
年树龄,所采的叶片与树龄关系不大.但是4种次生代谢产物均表现在树龄为10年、13年的叶片中质量分
数相对较高,这是因为在这些不断更替的叶片中,较低树龄凹叶厚朴处于一个相对有利于绿原酸代谢积累
生理阶段.绿原酸属于酚酸类化合物主要在植物叶片与植物地上部相对比较幼嫩的组织器官中合成然后转
运至植物各器官.
芦丁属于黄酮类的次生代谢产物,其在植物体内分布广泛,其积累量常常与植物的抗逆境有关.随着
树龄的增加,芦丁在不同的器官中质量分数差异很大,积累量从大到小依次为叶片、枝皮、茎皮、根皮.这
种递变规律与叶片年龄、枝皮、茎皮和根皮年龄有关,相比之下,植物总原生根皮和茎皮树龄最老,枝皮次
之,而落叶乔木的叶片往往是一年生.植物越是是幼嫩的器官对外界响应就越敏感,芦丁作为黄酮类化合
13第2期 谌金吾,等:不同树龄凹叶厚朴7种次生代谢产物积累研究
物典型代表质量分数变化也正好反映凹叶厚朴不同部位随着树龄增加抗逆敏感程度减弱.凹叶厚朴树龄越
低质量分数越高,其随着树龄增加质量分数是呈递减,这可从图6-(a)可知.
从图6可知,厚朴酚与和厚朴酚随着树龄增加在凹叶厚朴枝皮和茎皮中的线性回归方程的判定系数为
Y =-2 620x2+19 055x-2481.8 R2 =0.997 8
Y =18.843x2+4 402.2x-920.76 R2 =0.994 2
Y =-4 497.4x2+27 748x-16 047 R2 =0.979 8
Y =-798.x2+5 261.2x-2 922.6 R2 =0.808 8
厚朴酚和和厚朴酚随着凹叶厚朴线性关系非常好,基本上反映这2种次生代谢产物在凹叶厚朴枝皮和茎皮
积累.但是在根皮和叶片中线性不好,可能还是因为叶片不是这2种代谢产物合成和储存的部位,同时叶
片是每年都凋落,研究叶片积累规律,按照叶片出芽、展开和凋落等不同阶段或者按照月份来分析,可能
会得到更有规律的成果;显然按照树龄是不能得到规律性的结论.根皮中随着树龄增加2种次生代谢产物
积累线性不是很明显(判定系数R2 分别为0.616 8,0.876 3),但均显示了树龄为26年质量分数达到最大
值.和厚朴酚与厚朴酚主要是分布在凹叶厚朴的树皮中,叶片中质量分数很低,其中树皮又以根皮质量分
数最高,其次是茎皮,枝皮质量分数最低.树龄从7年到13年二者积累量明显增加,树龄从13年增加至
26年增幅不大,所以采集中药厚朴最好选用13年以上的植株.
图6 凹叶厚朴叶、枝皮、茎皮和根皮中的次生代谢产物积累趋势
4 讨 论
同一区域来源不同树龄凹叶厚朴中7种次生代谢产物随着树龄的增加积累变化差异较大.绿原酸、芦
丁、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素质量分数积累与树龄增加没有表现出明显的积累,和厚朴酚与厚朴酚从7
年树龄到13年树龄有很明显的质量分数积累,从13年树龄到26年树龄质量分数增幅不大.这主要因为绿
23 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第35卷
原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、和厚朴酚、厚朴酚等7种次生代谢产物本身的性质、生理生化功
能和分布贮存不同,芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素为黄酮类次生代谢产物,在一定条件下可以相互转
化,有共同合成途径[13-14].芦丁、槲皮苷、金丝桃苷等天然黄酮类化合物存在于许多植物的花、叶、果实
中,它们经酸水解可得到槲皮素.许良[15]等分析了野生多叶棘豆(Oxytropis myriophylla (Pal.)DC.)地
上部位芦丁2年中不同月份积累规律发现,芦丁等次生代谢产物质量分数与植物年龄差异不大.汪海峰[16]
等研究也证明与凹叶厚朴同为落叶乔木的银杏(Ginkgo biloba L.)叶片中黄酮类次生代谢产物积累是植物
自身发育状况影响下初级代谢和次级代谢相互结果,因为新叶老叶每年的更替,叶片中的黄酮质量分数仅
是短期(1年)内对自然胁迫产生的生理生态适应结果,与树林增加这种结果没有累加性.这与本文研究黄
酮类次生代谢产物在凹叶厚朴质量分数变化与树龄相关性很低的结果一致.作为芦丁、槲皮苷、金丝桃苷
等中草药来源主要是沙棘、槐米、山楂、桑寄生、银杏、三七、高良姜、款冬花等植物,凹叶厚朴作为中药
主要是依据其含有以厚朴酚和厚朴酚为主的酚质量分数.厚朴酚和和厚朴酚在枝皮和叶片中质量分数与树
龄相关性不高,这主要是因为在采集叶片与枝条与枝条与树龄无关所致,枝条与叶片每一年都会更新.茎
皮、根皮厚朴酚与和厚朴酚随着树龄增加而积累,这是因为茎皮和根皮为采样时保存与树龄一致的原生树
皮.和厚朴酚在茎皮和从7年到10年迅速积累达到最大,之后到26年质量分数变化不大;在根皮的积累
从7年到13年达到最大,然后26年略微下降.这结果与张春霞[17]等研究浙江凹叶厚朴结果不一致,可能
是因为影响和厚朴酚积累除了树龄之外,还与药材的产地有关.传统认为对中药材厚朴采剥应该在16年树
龄以上,赵中振[18]等则认为中药材厚朴采收树龄20~30年树龄为较为合适,但是由于目前市场对厚朴药
材需求量的急剧增加,结合《中国药典》对厚朴总酚的质量分数2%的规定,本文认为对于凹叶厚朴药材的
采剥13年树龄较为适宜.这与曾燕如[19]等认为的“随树龄增大厚朴酚类的质量分数迅速增加,12年以后
基本稳定”观点近似.
同一区域来源不同树龄凹叶厚朴中7种次生代谢产物随着树龄的增加积累变化差异较大.绿原酸、芦
丁、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素质量分数积累与树龄增加没有表现出明显的积累,和厚朴酚与厚朴酚从7
年树龄到13年树龄有很明显的质量分数积累,从13年树龄到26年树龄质量分数增幅不大.因为采样是在
不同的个体间进行,个体的差异也会影响检测结果,长期定点对一定数量单株个体进行分析观察,得到的
结果将会更加准确.
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Study on Accumulation of Seven Secondary Metabolites
of Magnolia officinalis var.biloba
Rehd.etWils.with Different Tree Ages
CHEN Jin-wu1, YANG Zhan-nan1, HU Ting-kun2,
WANG Feng-ying1, SUN Ji-wei 1, SUN Min1
1.School of Life Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;
2.Guiyang Production Management Ofice of Traditional Chinese Medicine Raw Materials,Guiyang 550081,China
Abstract:In order to provide reference for determining the best conditions of harvest for Magnolia offici-
nalis var.biloba Rehd.etWils,high performance liquid chromatography(HPLC)was performed to sepa-
rate chlorogenic acid,rutin,hyperoside,quercetin,quercitroside,honokiol and magnolol from different
parts of the trees from the same original regions but with different ages.Standard curves and regression e-
quations were set up to analyze the accumulation of the above seven secondary metabolites in the leaves,
branch skins,stem skins and root skins.Their accumulation differed considerably with increasing tree
age.Chlorogenic acid,rutin,hyperoside,quercetin and quercitroside were found to be contained mainly in
the leaves and branch skins of young trees,and the content change was not obvious between 7-year-old and
26-year-old trees.Magnolol and honokiol were mainly contained in the bark(or skin)structure of M.bi-
lobaand were the richest in the root skins,folowed by the stem skins and the branch skins.In 7-to 13-
year-old plants,their accumulation increased significantly with increasing tree age.However,in 13-to 26-
year-old plants,their accumulation did not increase significantly with tree age.In conclusion,the optimum
time for harvesting M.bilobais when the tree is around 13-year-old.
Key words:tree age;Magnolia officinalis var.biloba Rehd.etWils.;HPLC;secondary metabolite
责任编辑 胡 杨
43 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第35卷