全 文 ：中国国境卫生检疫杂志 2009 年 8 月第 32 卷第 4 期 Chinese Frontier Health Quarantine Aug.2009,Vol 32,No.4
〔检测技术〕
相思子毒素抗原和抗体制备
聂 聪 1 王 静 1 孙肖红 1 杨 宇 1，2 高 姗 2 康 琳 2 赵金银 2 王景林 2
（1.中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所，北京 100123；
2.军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071）
摘要 〔目的〕 研究一种相思子毒素抗原、抗体的制备技术。 〔方法〕 根据相思子毒素对半乳糖的特异性结合
能力，采用亲和层析技术将相思子种子中大部分杂质除去；经凝胶过滤层析，进一步去除植物种子中与蛋白毒素并存
的凝集素，获得电泳纯度天然相思子毒素纯品。 〔结果〕 利用大肠埃希菌表达重组相思子毒素 A 链蛋白，经金属螯合
层析法纯化，得到重组相思子毒素 A 链蛋白抗原。重组抗原免疫大耳白兔、昆明小鼠，采用辛酸-硫酸铵盐析法和亲和
层析法纯化兔血清和鼠腹水获得多抗；2 种抗体与天然毒素特异性结合的活性效价均为 106。 〔结论〕 抗原、抗体的制
备为建立相思子毒素检测方法奠定了基础。
关键词 天然；相思子毒素；抗原；抗体；制备；技术
〔中图分类号〕 R446.42 〔文献标识码〕 B
Preparation of Antigen and Polyclonal Antibody of Abrin Toxin Nie Cong1, Wang Jing2, Sun Xiaohong2, Yang Yu1,2, Gao Shan1,
Kang Lin2, Zhao Jinyin2, Wang JingLin2 (1. Chinese Academy of Inspection and Quarantne, Bejing 100123, China; 2. State Key
Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Acedamy of Military Medical Sciences, Beijing
100071,China)
[Abstract] Objective A prepare method of antigen and antibody of Abrin Toxin was built. Method Most contaminants in seeds
were removed using affinity chromatography according to the specific binding capacity between abrin and galactose. Gel
chromatography was carried out to remove lectins according to the molecuLar weight difference between abrin and lectin. Result
Abrin A-chain protein was obtained through recombinant protein system in E. coli and purified using metal chelating chromatography.
White rabbit and Kunming mice were immunized, the rabbit serum and mice ascetic polyclonal antibody were collected and purified by
Bitter-Ammonium sulfate salting-out and affinity chromatography methods. The dilution of rabbit serum and mice ascetic polyclonal
antibody combined with abrin toxin was 106. Conclusion The preparation of antigen and polyclonal antibody of abrin toxin lay the
foundation for abrin toxin detection.
[Key words] Natural; Abrin Toxin; Antibody; Antigen; Preparation; Technology
相思子毒素（Abrin）是存在于豆科藤本植物相思
豆 （Abrus precatorius） 中的一种剧毒性高分子糖蛋
白，其含量约占种子的 2.8%～3.0%,属于Ⅱ型核糖体
失活蛋白，由 A 和 B 2 条多肽链组成，彼此靠一个二
硫键相连[1]。 其中，A 链分子量为 30 000，能够抑制蛋
白质合成导致细胞死亡，为毒性单位。 B链分子量为
35 000，有 2个半乳糖结合位点，具有凝集活性，帮助
A链进入细胞质，发挥毒性作用，为结合单位[2-3]。单独
的 A 链和 B链均无毒性， 只有双链聚合形式才显示
毒性作用。 相思子毒素毒性很大,性质稳定,且来源较
广,提取成本低廉,具有一定的潜在威胁[4-5]。 高纯度的
相思子毒素抗原、 抗体的制备是毒素检验及鉴定的
基础。 本研究根据纯化蓖麻毒素的方法 [6]，提取相思
子毒素，获得高纯度毒素。 目前国内建立的相思子毒
素检测试剂，多以毒素脱毒为免疫原获得抗体[7-11]，该
法存在危险性，并不适合大量制备。 本研究以重组相
思子毒素 A 链为抗原制备相思子毒素抗体， 并采用
正辛酸-硫酸铵逐步沉淀法及 HiTrapTM rProtein A FF
亲和层析纯化法获得不同纯度的重组抗体。
1 材料与方法
1.1 材料 相思豆（云南），相思子毒素 A 链（pET-
28ABRaB）重组质粒(由军事医学科学院微生物流行
病研究所毒素室构建保存 )； 次氨基三乙酸 (NTA，
Amersham)、 基-β-D-半乳糖苷琼脂糖亲和介质
（Sigma）、SephacrylTMS -200 G75 凝 胶 柱 （GE）、
HiTrapTM rProtein A FF(AKTA)；2 cm×10 cm 玻璃层析
柱（AKTA）；其它化学试剂均为分析纯，购于北京鼎
基金项目：国家质量监督检验检疫总局科研基金项目（2007GYJ023）
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DOI:10.16408/j.1004-9770.2009.04.021
中国国境卫生检疫杂志 2009 年 8 月第 32 卷第 4 期 Chinese Frontier Health Quarantine Aug.2009,Vol 32,No.4
国生物技术公司。
1.2 天然相思子毒素的制备 将相思子去壳、浸泡、
匀浆取上清， 先以体积分数为 30%的硫酸铵沉淀去
除杂蛋白， 再以体积分数为 90%的硫酸铵沉淀收集
目的蛋白，沉淀在缓冲液(0.01 mol/L，pH7.4)中透析除
盐,得到淡黄色粗毒素。 选择衍生化的琼脂糖树脂对
目的蛋白亲和层析去除杂蛋白， 然后用凝胶过滤去
除凝集素[6]，获得天然毒素。
1．3 重组相思子毒素 A 链抗原蛋白的制备 pET-
28ABRaB 经测序验证后，转化 E.coliBL21，培养粗提
物通过螯合镍离子次氨基三乙酸 (Ni-NTA)亲和层析
柱对重组蛋白进行纯化。
1．4 抗重组相思子毒素 A 链抗体的制备
1.4.1 兔抗重组相思子毒素 A 链抗体的制备 纯化
的重组相思子毒素 A 链抗原蛋白与福氏完全佐剂充
分乳化，免疫新西兰纯种大耳白兔，耳缘静脉采血，
以天然相思子毒素为抗原， 用间接酶联免疫吸附试
验（ELISA）测定效价。 效价达到 106后心脏采血。
1.4.2 鼠抗重组相思子毒素 A 链抗体的制备 用纯
化的重组相思子毒素 A 链抗原蛋白与等体积的福氏
完全佐剂充分乳化，免疫昆明小鼠，尾静脉采血，以
天然相思子毒素为抗原，用间接 ELISA 测定效价。效
价达到 106后，腹腔注射 S180细胞至昆明小鼠。 2周
后大量采集腹水。
1．5 兔、鼠抗重组相思子毒素 A 链抗体的纯化
1.5.1 辛酸-硫酸铵盐析法纯化抗体 兔血清、 鼠腹
水经滤膜滤过，加醋酸缓冲液稀释，在酸性条件下，正
辛酸沉淀非 IgG 蛋白，离心取上清液，在中性条件下
置冰浴中饱和硫酸铵，以体积分数为 45%饱和度沉淀
IgG蛋白，收集沉淀蛋白，透析，离心、取上清液，经蛋
白定量，SDS-PAGE鉴定其纯度，－70℃保存备用。
1.5.2 亲和层析纯化相思子毒素 A 链抗体 兔血
清、鼠腹水经滤膜滤过，按说明书经 HiTrapTM rProtein
A FF亲和柱纯化抗体。 纯化后的抗体透析、离心、取
上清液，经蛋白定量，SDS-PAGE 鉴定其纯度，－70℃
保存备用。
1.6 抗体活性检测 间接 ELISA 法检测重组抗体
与天然毒素特异性结合的效价。
2 结果
2.1 天然相思子毒素亲和纯化结果 根据相思子毒
素、凝集素与其他杂蛋白对半乳糖结合能力不同，采
用 10 mmol/L 的半乳糖缓冲液进行洗脱杂蛋白及少
量凝集素， 然后采用 100mmol/L 的半乳糖缓冲液洗
脱目的蛋白， 图 1所示亲和纯化的 SDS-PAGE 分析
结果，可见目的蛋白与凝集素并未完全分开，所以下
一步选择凝胶过滤将 2者分开。
2.2 天然相思子毒素凝胶过滤结果 相思子毒素和
凝集素的分子量分别为 65kDa、120kDa，用SephacrylTM
S-200凝胶柱对 2者进行分离。 图 2为洗脱曲线，可
以看出 2者实现了分离。 SDS-PAGE 分离图见图 3。
经过亲和层析和凝胶过滤 2 步纯化， 得到了电泳纯
的相思子毒素（条带 2）。 电泳过程中，在 DTT存在的
条件下， 相思子毒素分子内的二硫键被打开， 得到
A、B 单链 （条带 1）， 分子量分别为 31、33kDa。 经
TotalLab2.0 图像软件分析纯度为 96%。
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中国国境卫生检疫杂志 2009 年 8 月第 32 卷第 4 期 Chinese Frontier Health Quarantine Aug.2009,Vol 32,No.4
2．2 重组相思子毒素 A 链抗原蛋白 通过螯合镍
离子次氨基三乙酸 (Ni-NTA) 亲和层析柱对重组
蛋白进纯化， 经 TotalLab2.0 图像软件分析 RABa 的
纯度在 95％以上，如图 4 所示，蛋白定量仪定量 4.8
mg/ml。
2.3 兔、鼠抗重组相思子毒素 A 链抗体的制备与纯
化
2.3.1 辛酸-硫酸铵盐析法纯化 IgG 利用辛酸-硫
酸铵盐析法纯化免疫兔血清和小鼠腹水， 兔多克隆
抗体纯度 90%、IgG 浓度 8 mg/ml； 鼠多克隆抗体纯
度 90%、IgG浓度 6mg/ml（图 5）。
2.3.2 重组蛋白 A 琼脂糖凝胶 6B FF 亲和层析纯化
IgG 该法纯化蛋白，其纯度均达 98％以上，兔多抗
浓度为 2～8mg/ml；鼠多抗为 1～6mg/ml。
2.4 兔、 鼠多抗效价测定 天然相思子毒素为包被
抗原，间接 ELISA 法测定多克隆抗体效价，结果见表
1，兔、鼠多克隆抗体的效价均为 106。
3 讨论
天然相思子毒素及其凝集素可以与半乳糖特异
性结合，分离纯化方案主要针对这一特性制定。 亲和
层析是将相思子毒素和其它杂质分离的主要方法，
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中国国境卫生检疫杂志 2009 年 8 月第 32 卷第 4 期 Chinese Frontier Health Quarantine Aug.2009,Vol 32,No.4
在传统的亲和技术中， 多采用 Sepharose 4B 琼脂糖
（或酸化处理以暴露更多的半乳糖残基）作为亲和介
质， 但是由于 Sepharose 4B 表面半乳糖的不均一性
导致了结果的重复性差、产率低[6]。基于此，我们选择
衍生化的琼脂糖树脂对目的蛋白进行纯化， 将相思
子毒素及其凝集素与其他杂蛋白分离， 然后用凝胶
过滤将凝集素与相思子蛋白分离， 经过纯化获得了
电泳纯度为 96%的相思子毒素。
Abrin 是一种大分子植物蛋白,免疫原性好,但由
于其高毒性，通常采用甲醛减毒处理,以低毒的类毒
素作为免疫抗原制备抗血清[7-11]。 但这种方法通常会
使抗原蛋白损失免疫原性， 并且对动物及操作人员
都具有伤害性， 所以本实验采用高纯度的重组蛋白
作为免疫抗原制备抗体。 用传统免疫方法获得兔多
克隆抗体，以昆明小鼠腹腔直接注射 S180 细胞刺激
昆明小鼠产生高效价抗体， 这种抗体相当于单克隆
抗体且产量高、成本低[12]。 在兔多克隆抗体的制备过
程中，在 3 次免疫后效价没有明显的上升，所以在抗
原与弗氏佐剂混合中，改用冰浴超声间歇快速混匀，
减少了抗原的降解； 在注射方法上也分别采用了皮
下多点注射以及肌肉多点注射， 试验发现皮下多点
注射效果较好；通过心脏采血获得血清 25ml/只。 在
鼠多克隆抗体效价达到理想值后采用腹腔直接注射
S180细胞可以刺激昆明小鼠产生高效价抗体， 这种
高效价抗体既存在于腹水，也存在于血清中。 由于昆
明小鼠个体较大，产生的腹水量较多，理论上每只昆
明鼠最高可产 15ml以上，但是本实验昆明鼠最高产
腹水量为 10 ml。 由于 S180 细胞早期在腹腔中可迅
速增殖，至使腹腔膨胀,到了后期，才较迅速刺激腹水
产生，所以采集腹水应尽量选择稍晚时期，并且在注
射剂量上有待优化。
在多克隆抗体的纯化方面，首先采用辛酸-硫酸
铵沉淀法。 该法 pH 值是最关键的，在偏酸条件下辛
酸沉淀 IgG 成分外的杂蛋白， 在中性条件下过饱和
硫酸铵沉淀 IgG。鼠腹水和兔血清均获得了较高纯度
的抗体蛋白，该法适合制备大量的抗体；采用蛋白 A
柱亲和层析纯化免疫血清、腹水，该法每次的上样量
很低，但是能获得高纯度的抗体蛋白，在制备时间及
制备量上与辛酸-硫酸铵沉淀法有些差距，但是该法
可以获得高纯度的抗体蛋白。
以天然抗原包被酶标板测得重组抗体的效价均
为 106，与重组蛋白包被检测结果基本一致，证明该
重组抗原免疫获得的抗体与天然毒素的亲和力好。
通过试验，获得了大量、高纯度、高亲和性的多
克隆抗体，高质量抗原、抗体的获得为建立免疫学检
测相思子毒素的方法奠定了物质基础。
参 考 文 献
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〔收稿日期：2009-07-17〕
表 1 兔、鼠多克隆抗体效价表
Table 1 The rabbit serum polyclonal antibody and mice ascetic polyclonal antibody to combine together with Abrin Toxin
分类 空白 阴性 107 106 105 104 103 102
兔多克隆抗体
鼠多克隆抗体
-0.001
0.010
0.07
0.08
0.115
0.137
0.190
0.211
0.221
0.234
0.248
0.253
0.336
0.358
0.375
0.373
284· ·