全 文 ：西藏八角莲不同部位鬼臼毒素的 HPLC分析
钟国辉 1 , 权红 2 , 袁雷 1 , 田发益 1 , 罗利攀 2 , 兰小中 3＊　(1.西藏农牧学院生物技术中心 ,西藏林芝 860000;2.西藏高原生
态研究所 ,西藏林芝 860000;3.西藏农牧学院动物科学技术学院 ,西藏林芝 860000)
摘要　[目的]建立了西藏八角莲 [Dysosmaversipelis(Hance)M.Cheng]不同部位鬼臼毒素的HPLC分析方法 ,并对鬼臼毒素含量进行检
测。 [方法]色谱条件为:色谱柱 , WhatesC18柱(125.0mm×4.6mm, 5μm);流动相 ,甲醇∶水(55∶45, V/V);流速 , 1.0ml/min;检测波长 ,
290nm;柱温 , 25℃;进样量 , 20μl。线性范围为 1～ 200μg/ml,回归方程:y=15 121x-46 585, r=0.999 1。 [结果 ]西藏八角莲根、块茎、
叶、叶柄、花和果实中均检测到鬼臼毒素 ,但是不同部位含量差异较大。其中 ,块茎中鬼臼毒素含量最高 ,为(180.50±2.74)(md)μg/g,
之后依次为根中(58.83±1.59)(md)μg/g,花中(40.33±1.24)(md)μg/g,叶中(36.93±1.09)(md)μg/g, 叶柄中(29.90±0.45)(md)μg/g,果实中(6.03±0.12)(md)μg/g,依次降低。 [结论]该检测方法灵敏度高、稳定性好、重复性高、分离效果好 , 不同组织中鬼臼毒素
含量以块茎中最高 ,果实中最低。该研究可为西藏药源植物功效成分的分析提供理论与实践指导。
关键词　HPLC;鬼臼毒素;八角莲;不同部位;西藏
中图分类号　S567　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2011)06-03262-03
AnalysisofPodophylotoxininDifferentPartsofD.tsayuensis(Hance)M.ChengbyHPLC)
ZHONGGuo-huietal　(BiotechnologyCenter, TibetAgriculturalandAnimalHusbandryColege, Linzhi, Tibet860000)
Abstract　[ Objective] ToanalyzethepodophylotoxinindiferentpartsofD.tsayuensis(Hance)M.ChengbyHPLC, andthecontentsofwhich
weredetermined.[Method] Thechromatographicconditionswereasfolows:WhatesC18 column(125.0mm×4.6mm, 5μm), mobilephaseof
carbinolandwater(55∶45), flow-rateof1.0ml/min, detectivewavelengthof290nm, columntemperatureof25℃andsamplevolumeof20
μl.Thelinearrangelinearrangelinearrangewas1～ 200μg/mlandtheregressionequationwas:y=15 121x-46 585, r=0.999 1.[ Result]
Therewerepodophylotoxinsintheroot, tuber, leaf, petiole, flowerandfruitofD.tsayuensis(Hance)M.Cheng, whilethecontentsofpodo-
phylotoxinvariedindifferentparts.Therewasthehighestlevelofpodophylotoxininthetuber, (180.50±2.74)(md)μg/g;thecontentofpo-
dophylotoxinintheroottookthesecondplace, (58.83±1.59)(md)μg/g;thecontentofpodophylotoxinintheflowerwas(40.33±1.24)(md)μg/g, thecontentofpodophyllotoxinintheleafwas(36.93±1.09)(md)μg/g;thecontentofpodophyllotoxininthepetiolewas29.90±
0.45(md)μg/g;thecontentofpodophyllotoxininthefruitwas(6.03±0.12)(md)μg/g.[Conclusion]HPLCwasofhighsensitivity, goodsta-bility, repeatabilityandseparatingefect;thecontentofpodophyllotoxinwasthehighestintuberandthelowestinthefruit.Thisresearchwould
providetheoreticalandpracticaldirectionforanalyzingefficiencycompositionsinmedicinalplantsofTibet.
Keywords　 HPLC;Podophyllotoxin;D.tsayuensis(Hance)M.Cheng;DifferentParts;Tibet
基金项目　西藏自治区科技厅自然基金项目(2009103)。
作者简介　钟国辉(1964-),男 ,湖南岳阳人 ,教授 ,从事植物营养与化
学的教学与科研工作。 ＊通讯作者 ,副教授 ,硕士 , 从事植
物生理研究 , E-mail:xzzhonggh@163.com。
收稿日期　 2010-11-29
　　八角莲 (RHIZOMAETRADIXDYSOSMAEPLEIAN-
THAE)别名鬼臼 ,为小檗科植物八角莲 [ Dysosmaversipelis
(Hance)M.Cheng]或六角莲 [ D.pleiantha(Hance)Woods]等
八角莲属多种植物的根茎 ,分布于我国湖北 、湖南 、广西 、云
南 、四川 、贵州和西藏等省区 [ 1] 。八角莲属类植物普遍含有
的鬼臼毒素等芳香四氢萘类 ,属于木脂体类 ,具有抗肿瘤 、抗
癌 、抗病毒和免疫调节等功能 ,为抗癌药 Vp-16的原料 。八
角莲是我国传统的民间常用药之一 ,具有清热解毒和祛痰散
结的功效 ,临床用于治疗流行性出血热 、乙型脑炎 、腮腺炎 、
痈肿疔疮 、咽喉肿痛 、跌打损伤 、风湿痹痛 、毒蛇咬伤及癌症
等 ,特别用于食道癌和子宫癌的治疗 [ 2] 。
鬼臼毒素在植物中的含量低且分布不均 ,因此 ,对植物
不同部位的鬼臼毒素进行有效提取和精确测定 ,不仅有利于
更好地确定其经济价值并加以合理利用 ,也对新的抗癌和抗
肿瘤药物的开发具有重要意义。目前 ,测定鬼臼类植物中鬼
臼毒素含量的方法主要有分光光度法 、荧光法 、薄层色谱扫
描法和高效液相色谱法。 2005年 ,邓书端等建立了一种分离
测定鬼臼毒素的毛细管区带电泳方法 ,并用该方法研究了八
角莲(云南省玉溪地区)不同部位中(根 、茎 、叶或须)鬼臼毒
素的分布情况 [ 3-4] 。八角连在西藏主要分布在藏东南的林
芝 、山南等地 ,资源量较为丰富 ,而对西藏八角莲中不同部位
鬼臼毒素含量测定的研究还未见报道。为此 ,笔者建立了西
藏八角莲中鬼臼毒素含量的 HPLC测定方法 ,并分别测定了
西藏八角莲根 、块茎 、叶 、叶柄 、花和果实中鬼臼毒素含量 ,以
期为该资源的有效利用提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1 　供试药材。西藏八角莲 ,采自西藏林芝地区米林县
南伊沟和西藏色季拉山等 ,由西藏农牧学院资源与环境科学
学院鲍隆友教授鉴定为 D.versipelis(Hance)M.Cheng。
1.1.2　主要试剂。甲醇(色谱纯);双蒸水;鬼臼毒素对照品
(含量 93%,中国生物制品检定所提供)。
1.1.3　主要仪器。高效液相色谱仪 ,由美国 Waters公司生
产 ,附 Waters1525液相色谱仪 、waters2487紫外可见检测器 、
EmpowerPro色谱工作站 、WhatesC18色谱柱(125.0 mm×4.6
mm, 5 μm);超声破碎仪 ,由宁波新芝生物科技股份有限公司
生产;高速离心机 ,由日本 KOKUSAN公司生产。
1.2　方法
1.2.1　对照品溶液的配制。精密称取鬼臼毒素对照品 1 mg
于 1 ml量瓶中 ,用甲醇溶解并定容 ,配制成浓度为 1 mg/ml
的对照品溶液。
1.2.2　样品溶液的制备。将八角莲不同组织(根 、块茎 、叶 、
叶柄 、花 、果实)分别置于电热恒温鼓风干燥箱中 ,于 50 ℃下
烘 5 h以上至恒重 ,然后用研钵研磨成精细粉末 ,过 80目筛 。
准确称取 25 mg粉末于小烧杯中 ,加入 25 ml已配好的 80%
甲醇 ,称量 ,用超声波振荡抽提 30 min,称量 ,用 80%甲醇补
足损失的重量 ,室温静置 10 min。准确吸取上清液 1 ml,于
8 000 r/min下离心 5 min,取上清液 ,经 0.25 μm有机相滤膜
责任编辑　姜丽　责任校对　马君叶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2011, 39(6):3262-3264, 3315
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.06.157
的注射器过滤 ,即得样品测定液 。
1.2.3　HPLC分析条件。WhatesC18柱(125.0mm×4.6mm,
5 μm);流动相 ,甲醇∶水(55∶45, V/V);流速 , 1.0 ml/min;检
测波长 , 290 nm;柱温 , 25 ℃;进样量 , 20 μl。
1.2.4　方法学考察 。
1.2.4.1　线性关系考察 。准确吸取鬼臼毒素对照品溶液 1、
5、10、20、50、100、200μl,分别置于 1ml量瓶中 ,用甲醇定容 ,
摇匀 ,配制成浓度 1、5、10、20、50、100、200 μg/ml的标准系列
溶液。吸取该系列溶液各 20 μl,按 “1.2.3”的 HPLC分析条
件测定峰面积积分值 y,以 y对浓度 x绘制校准曲线。
1.2.4.2　精密度试验。吸取鬼臼毒素对照品溶液 20μl,按
“1.2.3”的 HPLC分析条件测定峰面积积分值 ,重复 3次 ,计
算峰面积积分值的相对标准偏差(RSD)。
1.2.4.3　重复性试验。准确称取干燥 、粉碎 、过 80目筛的八
角莲根样 25mg5份 ,按 “1.2.2”的方法制备样品测定液 ,取
20μl,按 “1.2.3”的 HPLC分析条件测定峰面积积分值 ,计算
峰面积积分值的 RSD。
1.2.4.4　稳定性试验。准确称取八角莲根粉 25 mg,按
“1.2.2”的方法制备样品测定液 ,按 “1.2.3”的 HPLC分析条
件 ,每隔一定时间测定一次峰面积积分值 ,计算峰面积积分
值的 RSD。
1.2.4.5　回收率试验。准确吸取西藏八角莲叶 、根的样品
溶液 20 μl,分别准确加入鬼臼毒素对照品 30、50 μg,按
“1.2.3”的 HPLC分析条件测定峰面积积分值 ,计算回收率
和 RSD。
1.2.5　样品中鬼臼毒素含量的测定。吸取八角莲根 、块茎 、
叶 、叶柄 、花和果实的样品溶液各 20 μl,按 “1.2.3”的 HPLC
分析条件测定峰面积积分值 ,根据已得的线性回归方程计算
鬼臼毒素含量 。
2　结果与分析
2.1　色谱条件的确定　由图 1可知 ,在设定的 HPLC条件
下 ,鬼臼毒素的保留时间约为 10.1 min,与其他杂质可实现
基线分离。
2.2　方法学考察结果
2.2.1　线性关系。由图 2可知 ,以峰面积积分值(y)对鬼臼
毒素标准溶液浓度(x)绘制标准曲线 ,经线性回归 ,得回归方
程为:y=15 121x-46 585, r=0.999 1,表明鬼臼毒素标准溶
液浓度在 1 ～ 200μg/ml范围内与吸光度值的线性关系良好。
图 1　鬼臼毒素标准品 HPLC色谱图
Fig.1　HPLCchromatogramofpodophylotoxinstandardsample
图 2　鬼臼毒素标准曲线
Fig.2　Standardcurveofpodophyllotoxin
2.2.2　精密度。测得峰面积积分值的 RSD=0.835%(n=
3),表明仪器精密度良好。
2.2.3　重复性。测得峰面积积分值的 RSD=1.330%,表明
分析方法重复性较好。
2.2.4　稳定性。测得样品测定液的峰面积积分值的 RSD=
0.260%,显示样品溶液在 2.0 h内稳定。
2.2.5　回收率。样品叶的平均回收率为 99.6%,根的平均
回收率为 101.4%,相对标准偏差分别为 0.820%和 1.030%,
表明该测定方法的回收率较高 ,符合分析要求 。
表 1　回收率试验结果(n=3)
Table1　Resultofrecoverytest(n=3)
样品
Sample
测定值∥μg/g
Measuredvalue
标准加入量∥μg
Standardaddition
测定总量∥μg/g
Determinedcontent
回收率∥%
Recoveryrate
RSD
%
叶 Leaf 35.08 30.00 64.79 99.6 0.82
根 Root 59.13 50.00 110.35 101.4 1.03
2.3　样品中鬼臼毒素含量测定结果　西藏八角莲根 、块茎 、
叶 、叶柄 、花和果实样品溶液中鬼臼毒素的 HPLC见图 3 ～ 8,
含量见图 9。由图 9可知 ,西藏八角莲根 、块茎 、叶 、叶柄 、花
和果实等组织中鬼臼毒素含量差异较大 。其中 ,西藏八角莲
块茎中鬼臼毒素含量最高 ,达到(180.50 ±2.74)(md)μg/g,
在果实 、根 、花 、叶 、叶柄中含量分别为(6.03±0.12)、(58.83
±1.59)、(40.33 ±1.24)、(36.93±1.09)、(29.90 ±0.45)
(md)μg/g。
3　结论与讨论
3.1　结论　通过对鬼臼毒素对照品溶液的线性分析 ,发现
当对照品溶液浓度在 1 ～ 200μg/ml范围内时标准曲线线性
很好 , r=0.999 1。另外 , HPLC分析中 ,仪器精密度高 ,方法
的重复性和准确度很好 ,且样品溶液在 2.0 h内稳定。
利用 HPLC分析西藏八角莲根 、块茎 、叶 、叶柄 、花和果
实中鬼臼毒素含量 ,发现 6种组织中均检测到鬼臼毒素 ,但
是不同部位含量差异较大 。其中 ,块茎中鬼臼毒素含量最
326339卷 6期　　　　　　　　　　　　　　　　钟国辉等　西藏八角莲不同部位鬼臼毒素的 HPLC分析
图 3　西藏八角莲根中鬼臼毒素HPLC图
Fig.3　HPLCchromatogramofpodophylotoxininrootofD.ts-
ayuensis(Hance)M.Cheng
图 4　西藏八角莲块茎中鬼臼毒素HPLC图
Fig.4　HPLCchromatogramofpodophylotoxinintuberofD.
tsayuensis(Hance)M.Cheng
图 5.　西藏八角莲叶中鬼臼毒素HPLC图
Fig.5　HPLCchromatogramofpodophyllotoxininleafofD.ts-
ayuensis(Hance)M.Cheng
图 6　西藏八角莲叶柄中鬼臼毒素HPLC图
Fig.6　HPLCchromatogramofpodophylotoxininpetioleofD.
tsayuensis(Hance)M.Cheng
高 ,其次是根 、花 、叶 、叶柄 ,在果实中含量最低 。总体而言 ,
是地下部分含量高于地上部分含量 ,尤其块茎中鬼臼毒素的
含量是果实中鬼臼毒素含量的 30余倍。这说明作为鬼臼毒
素的资源植物以块茎为最好 ,但考虑资源利用与保护之间的
矛盾 ,一般以地上部分作为鬼臼毒素资源植物 。
图 7　西藏八角莲花中鬼臼毒素 HPLC图
Fig.7　HPLCchromatogramofpodophylotoxininflowerofD.
tsayuensis(Hance)M.Cheng
图 8　西藏八角莲果实中鬼臼毒素 HPLC图
Fig.8　HPLCchromatogramofpodophylotoxininfruitofD.ts-
ayuensis(Hance)M.Cheng
图 9　西藏八角莲不同部位中鬼臼毒素含量
Fig.9　ThecontentofpodophylotoxinindiferentpartsofD.ts-
ayuensisYingofD.tsayuensis(Hance)M.Cheng
3.2　讨论　八角莲作为一种药源植物 ,其成分复杂 ,含有大
量的大分子生物碱 ,且具有不稳定性 ,采用 HPLC法进行分
析是比较理想而准确的方法 。该试验采用二级管阵列检测
器对鬼臼毒素对照品在波长 200 ～ 400 nm间的紫外吸收光
谱进行了扫描 [ 5] ,结果在该试验条件下 ,鬼臼毒素在 290 nm
处有最大吸收峰 ,显示其在该波长下的特征吸收。选择甲醇
-水 、氯仿 -水 、甲醇 -氯仿 、乙醇 -氯仿等按一定配比超声
(下转第 3315页)
3264 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2011年
表 2　紫金标不同提取液的MIC、MBC值
Table2　 MICandMBCofdifferentextractisfromCeratostigmaminusStapfexprain mg/ml
萃取相Extractionphase
标准金黄色葡萄球菌StandardStaphylococcusaureus
MIC MBC
MRSA15#
MIC MBC
MRSA77#
MIC MBC
MRSA187#
MIC MBC
标准铜绿假单胞菌StandardPseudomonasaeruginosa
MIC MBC
绿脓 18#Pseudomonasaeruginosa18#
MIC MBC
绿脓 327#Pseudomonasaeruginosa327#
MIC MBC
石油醚层Petroleumetherlayer 0.010 0.020 0.005 0.010 0.005 0.010 0.039 0.078 0.313 0.625 0.313 0.625 0.156 0.625
乙酸乙酯层Ethylacetatelayer 0.039 0.078 0.020 0.039 0.020 0.039 0.156 0.313 0.313 0.625 0.313 0.625 0.313 1.250
正丁醇层Normalbutanollayer 0.156 0.313 0.313 0.625 0.313 0.625 1.250 2.500 1.250 2.500 1.250 2.500 1.250 2.500
水层Waterlayer 1.250 2.500 0.313 0.625 1.250 2.500 2.500 5.000 2.500 5.000 1.250 2.500 1.250 5.000
紫金标Ceratostigmaroot 0.156 0.625 0.078 0.313 0.156 0.313 0.078 0.313 0.625 1.250 0.625 1.250 0.625 2.500
萃取相Extractionphase
绿脓 5#
Pseudomonasaeruginosa5#
MIC MBC
标准大肠埃希菌StandardEscherichiacoli
MIC MBC
标准白色念珠菌StandardCandidaalbicans
MIC MBC
白念 249#
Candidaalbicans249#
MIC MBC
白念 249#
Candidaalbicans249#
MIC MBC
石油醚层Petroleumetherlayer 0.313 0.625 0.078 0.313 0.005 0.010 0.010 0.039 0.005 0.010
乙酸乙酯层Ethylacetatelayer 0.625 1.250 0.313 0.625 0.078 0.078 0.039 0.156 0.039 0.156
正丁醇层Normalbutanollayer 1.250 2.500 1.250 2.500 1.250 2.500 0.313 1.250 0.625 2.500
水层Waterlayer 1.250 2.500 1.250 2.500 2.500 2.500 0.625 2.500 1.250 2.500
紫金标Ceratostigmaroot 0.625 2.500 1.250 2.500 0.313 0.625 0.313 0.625 0.625 1.250
　　紫金标提取物呈现广谱抗菌特性 ,且具有较强的抗耐药
菌作用。结果表明 ,石油醚层和乙酸乙酯层的抑菌效果较
好 ,其中石油醚层最好 ,对几种菌株的 MIC和 MBC值分别为
0.005和 0.010mg/ml。
该试验所用耐药菌株 ,都是从临床感染患者中分离的对
抗生素有不同程度耐药的菌株。紫金标对这些耐药菌株表
现出较好的抑制作用 ,可进一步开发 ,该研究为进一步开发
抗菌活性较好且安全性更高的临床药物提供了依据 ,对于提
取物在体内的抗菌活性有待于进一步研究。
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(上接第 3264页)
提取 ,证明甲醇∶水(55∶45, V/V)对鬼臼毒素溶出率较高 ,提
取较完全。
八角莲是我国特有的濒危三级保护 、西藏自治区二级保
护多年生草本植物 ,西藏八角莲资源丰富 ,由于特殊的气候
与环境因素(温 、光 、热和水等),鬼臼毒素积累差异较大 。采
用 HPLC测定了西藏八角莲根 、块茎 、叶 、叶柄 、花和果实中
鬼臼毒素的含量 ,以此方法较全面地考察西藏八角莲各组织
中鬼臼毒素的分布情况尚属首次。
鬼臼毒素具有较强的毒性 ,在临床上不宜直接使用 ,一
般以其毒性较低 、疗效较好的制剂应用于临床 。在藏药传统
制药工艺中 ,以八角莲果实作为药材应该是考虑其低毒性 ,
这与该研究的分析结果一致 。
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