全 文 ：收稿日期:2009-12-23;　修订日期:2010-06-11
基金项目:天然产物研究与利用湖北省重点实验室开放基金项目
(No.2008NP10)
作者简介:张长城(1973-),男(土家族), 湖北长阳人, 现任三峡大学医学
院副教授 ,博士学位 ,主要从事中药药理学与中医男科学的研究工作.
＊通讯作者简介:袁　丁(1964-), 男(汉族),湖北宜昌人 , 现任三峡大学
医学院教授 ,博士学位 ,主要从事中药化学与中药资源研究工作.
杠板归提取物抗单纯疱疹病毒 -I型的药理作用研究
张长城1 , 2 ,黄鹤飞 1 ,周志勇 1 ,袁　丁1＊
(1.三峡大学医学院 ,湖北宜昌　443002;　
2.天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ,湖北 宜昌　443002)
摘要:目的 研究杠板归提取物体外抗单纯疱疹病毒 -1(HSV-1)的作用 ,探讨杠板归抗疱疹病毒的药理作用与有效部
位。方法 利用溶剂法和色谱法从杠板归中提取分离出 4个部位 , MTT法检测杠板归各提取物的病毒抑制效果 , 以病毒
抑制率和治疗指数(TI)为评价指标 , 比较各部位体外抗病毒的效果。结果 杠板归醇提部位与大孔树脂醇洗部位抗病毒
作用最强 , 药物浓度在 8 μg· ml-1以上时 , 对 HSV的抑制程度可达 50%以上 , 与阳性对照药阿昔洛韦无统计学差异(P>
0.05)。结论 杠板归提取物体外具有较好的抗 HSV-1作用 ,其有效成分为黄酮类化合物 , 具有进一步研究开发价值。
关键词:杠板归;　单纯疱疹病毒 -1;　有效部位
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.053
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)11-2835-02
　　杠板归系为蓼科蓼属 Polygonaceae植物杠板归 Polygonum
perfoliatumL.的新鲜或干燥全草 ,又名贯叶蓼 , 具有清热解毒 、祛
痰止咳 、利湿消肿 、散瘀止血等功效 ,主治痈肿疔疮 、丹毒等 ,始载
于《万病回春》。
民间习用杠板归鲜品或干品捣烂外敷治疗带状疱疹等疾病 ,
具有良好的效果。现代药理研究表明 ,杠板归具有抗炎 、抑菌 、抗
肿瘤等活性 [ 1, 2] 。目前对杠板归抗病毒活性的研究较少 , 其药理
活性部分与活性成分尚不明确。 本文通过研究杠板归各提取部
位体外抗 HSV-1活性研究 , 探讨杠板归抗疱疹病毒活性的主要
活性部位与可能活性成分。
1　材料与仪器
1.1　药物 杠板归鲜品采自湖北宜昌市 , 经三峡大学医学院中药
学教研究室谭复成教授鉴定。阳性对照药物:阿昔洛韦(ACV,上
海通用药业股份有限公司)。
1.2　试剂与仪器 MTT(4, 5二甲基噻唑 -2, 5 -二苯基四唑溴
化物)为 SIGMA公司产品;RPMI1640培养基为 GIBICO公司产
品;二甲基亚砜(DMSO)购自上海菲达有限公司;小牛血清购自
三利公司;所用化学试剂均为国产分析纯。超净工作台(美国
Forma公司);TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器
厂);DG3022-A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)。
1.3　细胞与病毒 Hep-2细胞为武汉大学典型培养物保藏中心
提供。细胞生长液为 RPMI-1640, 加 10%小牛血清 , 100 U/ml
青霉素 , 100 μg/ml链霉素。细胞维持液中加 2%新生小牛血清。
单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)SM44株 ,武汉大学医学院病毒学研
究所提供 , 经 Hep-2细胞活化增殖 , CPE达 75%以上(+++～
++++)收获 ,测定病毒滴度为 TCID50 10-5.6 /0.1 ml, 分装后于
-80℃冻存备用 , 实验用病毒浓度为 1 000 TCID50。
2 　方法
2.1 　供试品的制备 取杠板归干燥药材 50g, 用石油醚脱脂后 ,
用 20倍量 75%乙醇微沸回流提取 2次 ,每次 2 h, 提取液减压浓
缩 、干燥 ,得醇提物(干燥后得醇提部位);醇提物加水溶解 ,通过
D101大孔树脂 ,水洗后经 75%乙醇溶液洗脱 , 得到水洗部位及
醇洗部位;经乙醇提取后的药渣用水回流提取两次 , 每次 2 h, 减
压浓缩 、干燥得水提部位。以芦丁(购于中国药品生物制品检定
所)为标准对照品 ,采用硝酸铝络合分光光度法 [ 3]测得经大孔树
脂纯化后的母液总黄酮含量达 86.08%。过滤除菌分装 , 实验前
用含 2%的小牛血清的 1640培养基稀释到所需浓度。
2.2 　药物对细胞的毒性作用 用胰酶将生长良好的 Hep-2细
胞消化分散成单个细胞悬液 ,按 2×105 /ml的浓度每孔 100μl接
种于 96孔板。置 37℃, 5%CO2培养箱中培养 24h。待细胞长成
单层后 ,弃培养液上清 , 换成不同浓度的含药维持液 , 每孔 200
μl,每种浓度重复 4孔。同时设 4个组 , 分别为空白细胞对照 、病
毒感染对照 、ACV阳性对照 、受试药物组 , 继续培养并于倒置显
微镜下每日观察记录。
采用 MTT法 [ 4]检测细胞存活率:上述药物作用的细胞继续
培养 72h,弃培养液上清 , 每孔加入含 5 mg/mlMTT的无血清
RPMI-1640培养基 50 μl, 置 CO2培养箱中继续培养 2 ～ 3 h后 ,
弃 MTT上清 , PBS洗 3次 , 每孔加溶解液(DMSO∶乙醇体积比为
1∶1)100 μl, 振荡 5 ～ 10 min, 待结晶完全溶解 , 置酶标测定仪
上 , 测定 570nm波长处的光密度 OD值 , 计算细胞存活率。 实验
重复 3次。
2.3 　药物抗病毒实验 于已长成单层 Hep-2细胞 96孔板
上 , 每孔接种 100 μl的 1 000 TCID50 /0.1 ml的 HSV-1病毒
液 , 于 37℃吸附 2 h, 弃病毒上清并用 PBS洗涤 。根据细胞毒
性实验的结果 ,在无细胞毒性浓度范围内 , 加入不同浓度的含
药维持液每孔 200 μl, 每种浓度重复 4孔。 然后将 HSV培养
板置 37℃、 5%CO2培养 , 逐日观察细胞病变情况。 当病毒对
照 CPE达 “ +++ ～ ++++”时 , 用 MTT检测病毒抑制
率 。实验重复 3次 [ 5 , 6] 。
2.4 　统计学方法 用统计软件 SPSS11.5的 Probit回归法计算
药物半数毒性浓度 TC50和半数抑制浓度 IC50 , 得到药物治疗指数
(TreatmentIndex, TI=TC50 /IC50)。
3　结果
3.1　药物对细胞的毒性作用 药物对 Hep-1细胞毒性作用表
现为:细胞粘连 、变圆 、壁厚 、破碎脱落 , 胞质内颗粒增加 , 折光性
增强并且吸光值明显下降。随着药物的浓度增加细胞存活率呈
递减趋势。结果见表 1。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11 时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期
表 1　各提取物对 Hep-2细胞的毒性作用
药物 提取物浓度 C/μg· ml-1 细胞存活率(%) CPE
醇提部位 1.25 94.7 -
2.50 94.7 +
5.0 82.7 ++
10.0 53.1 ++
20.0 38.3 +++
40.0 21.2 ++++
水洗部位 1.25 83.3 +
2.50 69.7 ++
5.0 50.4 ++
10.0 49.6 ++
20.0 24.6 +++
40.0 20.5 +++
醇洗部位 1.25 96.6 -
2.50 98.9 +
5.0 89.4 +
10.0 80.7 ++
20.0 54.2 ++
40.0 50.1 ++
水提部位 1.25 90.9 -
2.50 90.9 -
5.0 90.5 +
10.0 67.8 +
20.0 37.5 ++
40.0 22.4 ++
　　“ -”为无 CPE, “ +”为少于 25%细胞出现CPE;“ ++”为 50%细胞出现 CPE;
“ +++”为 75%细胞出现 CPE;“++++”为超过 75%细胞出现 CPE
3.2　 杠板归各部位抗病毒活性 杠板归醇提部位 、醇洗部位提
取物 、杠板归总提物抗 HSV-1作用显著 , 最高抑制率可达
78.10%, 杠板归水洗部位及水提部位效果均较差 , 醇提部位 、醇
洗部位提取物之间没有明显的差异 , 与阳性对照药物对 HSV的
抑制作用无统计学差异(P﹥0.05),结果比较见表 2 ～ 3。
表 2　各提取物对 HSV-1病毒生物合成作用
药物 提取物浓度C/μg· ml-1 病毒抑制率(%)
醇提部位 2.0 34.2
4.0 31.1
8.0 54.1
16.0 78.1
水洗部位 2.0 10.7＊
4.0 23.7＊
8.0 34.6＊
16.0 42.0＊
醇洗部位 2.0 33.7
4.0 36.7
8.0 67.8
16.0 75.2
水提部位 2.0 6.14＊
4.0 4.39＊
8.0 30.1＊
16.0 46.6＊
阿昔洛韦 2.0 52.2
4.0 55.7
8.0 68.7
16.0 81.6
　　与阿昔洛韦组比较 , ＊P>0.05
表 3　4个提取部位的药效学指标比较
药物 TC50/μg· ml-1
IC50
/μg· ml-1 TI
醇提部位 20.39 7.68 2.65
水洗部位 12.90 18.51 0.70
醇洗部位 34.48 6.30 5.47
水提部位 21.71 16.46 1.32
4　讨论
临床常用的抗单纯疱疹病毒药物有阿昔洛韦 、喷西洛韦等核
苷类抗病毒药物 ,其作用途径主要是抑制病毒复制过程中重要酶
的活性 , 阻止病毒复制和侵染宿主细胞。但核苷类药物都存在一
些缺陷 ,如生物利用度低 , 溶解度小 ,并在体内迅速失效及潜在致
畸等副作用 ,长期服用可产生耐药性 [ 7, 8] 。
杠板归为民间草药 ,具有一定的抗炎 、抑菌作用 ,民间常用于
治疗疱疹病毒感染。本实验初步讨论了杠板归抗 HSV-1病毒
的有效成分 , 实验结果表明:杠板归醇提部位与杠板归醇洗脱部
位有显著抗 HSV-1作用 , 效果与 ACV相当。杠板归经 D101大
孔树脂 75%醇洗脱后母液中黄酮含量达 80%以上 , 提示杠板归
中抗 HSV-1的主要有效成分为黄酮类化合物。 但杠板归提取
物如何进入细胞 ,通过何种机制阻断病毒感染细胞并抑制病毒的
复制 , 尚有待进一步研究。杠板归资源丰富 ,本实验为杠板归的
进一步开发利用提供了实验基础。
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