全 文 ：凹叶厚朴低温胁迫 SSH文库的构建及差异基因的表达分析
陆 宁1，陈剑成1，郑郁善 2* (1．福建农林大学林学院，福建福州 350002;2．福建农林大学艺术园林学院，福建福州 350002)
摘要 ［目的］通过凹叶厚朴差减文库的构建及序列分析，找出其主要抗寒相关功能基因。［方法］随机挑选单克隆菌落进行 PCＲ检测，
对 837个阳性克隆测序后进行拼接得到97个 unigenes，将97个 unigenes在NCBI进行 BLAST比对，后进行 BLAST2GO功能分类，推定出
11个相关基因进行荧光定量 PCＲ。［结果］CHS、APX、TＲX、EＲF、DＲEB、LHCB、WＲKY、HSP、PP2C、GAPDH 10个基因在凹叶厚朴受到低温
侵害时出现差异表达，推断这 10个基因在低温时可能表现出防御机制。［结论］该研究为与凹叶厚朴亲缘关系相近的植物抗低温特性
遗传育种提供理论基础。
关键词 凹叶厚朴;低温胁迫;SSH文库;基因表达量
中图分类号 Q781 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)14 －141 －05
Construction of Magnolia officinalis Low Temperature Stress SSH Library and Differential Gene Expression Analysis
LU Ning1，CHEN Jian － cheng1，ZHENG Yu － shan2* (1． College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fu-
jian 350002;2 College of Art and Landscape，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002)
Abstract ［Objective］The aim was to obtain cold resistance relevant genes through construction of Magnolia officinalis subtractive library and
sequence analysis． ［Method］PCＲ detection was conducted on randomly selected monoclonal colony，after 837 positive clone sequencing，97
unigenes were obtained，BLAST comparison was conducted on NCBI，then BLAST2GO functional classification was carried out． ［Ｒesult］Fluo-
rescence quantitative PCＲ was conducted on 11 relevant genes． CHS，APX，TＲX，EＲF，DＲEB，LHCB，WＲKY，HSP，PP2C，GAPDH exhibited
the defense mechanism when Magnolia officinalis was damaged by low temperature． ［Conclusion］The study can provide theoretical basis for cold
resistance genetic breeding of plants with similar affinities to Magnolia officinalis．
Key words Magnolia officinalis;Low temperature stress;SSH library;Gene expression
基金项目 国家科技支撑计划项目(2011BAI01B06) ;福建省科技重点
项目(2009Y0003)。
作者简介 陆宁(1988 － ) ，男，福建漳州人，硕士研究生，研究方向:分
子生物学与基因工程。* 通讯作者，教授，博士，博士生导
师，从事药用植物分子生物学方面的研究。
收稿日期 2016-04-26
温度是影响凹叶厚朴生长发育的关键因素，探寻低温
胁迫对凹叶厚朴分子机理的影响具有重要的理论和实践意
义。植物为了应对寒冷气候进化形成了具有抗低温能力的
遗传特性［1］。当受到低温伤害时植物的抗寒基因才能被诱
导表达启动。植物在抵御低温过程中是由多个基因共同参
与代谢调控，单个基因无法增加植物的抗寒性［2］。根据抗寒
过程中代谢产物的作用归为两类:调控基因和保护基因［3］。
调控基因是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因，能够
起到调节保护基因的表达。保护基因转录翻译而成的蛋白
及其他代谢产物可以直接起到抗低温的作用［4］。
目前，对凹叶厚朴及其亲缘相近植物有关抗寒基因的研
究鲜见报道。笔者通过凹叶厚朴差减文库的构建及序列分
析，找出其主要抗寒相关功能基因，分析代谢途径，以期为与
凹叶厚朴亲缘关系相近的植物抗低温特性遗传育种提供理
论基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 选取 11月份生长健壮、粗细接近的 2 年生凹叶
厚朴，来源于三明明溪。
1． 2 试剂 大肠杆菌 DH5α和 Trizol 试剂均购自诺普生物
有限公司。逆转录试剂盒和载体 pMD18 － T vector 均购自宝
生物工程有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1． 3 方法
1． 3． 1 植物半致死温度的测定。幼苗低温锻炼后，选取适
量材料分别置于 －2、－4、－6、－ 8、－ 10、－ 12、－ 14、－ 16 ℃
的低温冰箱中低温胁迫 24 h，将顶芽取下，加入 ddH2O后用
电导率仪测定第 1次内含物渗透值(Ci) ;然后将其置于沸水
中水浴 10 min后 25 ℃下放置 12 h，漩涡振荡后测定第 2 次
电解质渗透值(Ct) ，按 Y =(Ci － Cw)/(Ct － Cw)计算试样的
电解质渗透率，每处理重复 3次。
对测定后的结果用 Logistic方程对温度与电解质渗透值
关系进行拟合，用坐标曲线的拐点温度作为试样的临界温
度。Logistic方程:Y = K /(l + aebt)。
1． 3． 2 植物的低温胁迫处理。为使 driver组和 tester组除温
度不同其他生长条件一致，采取如下方法进行试验:取 4 棵
凹叶厚朴苗，分为 2盆，放于 25 ℃人工气候培养箱培养 7 d，
7 d后将一盆凹叶厚朴留于人工气候培养箱中，作为 driver
组;将另一盆凹叶厚朴于生长期转移至温度为半致死温度的
人工气候培养箱中培养 3 d，作为 tester组。3 d后将 2 组顶
芽采下除去最外层，保存备用。
1． 3． 3 ＲNA 的提取和 cDNA 的合成。采用天根 ＲNAprep-
pure植物总试剂盒法提取凹叶厚朴顶芽总 ＲNA，取得到的 2
管 driver 组(常温)总 ＲNA 提取液与 2 管 tester 组(低温)
ＲNA提取液各 5μL于 PCＲ管中进行质量检测。
使用 clontech公司 In － Fusion SMAＲTer DirectionalcDNA
Library Construction Kit合成 cDNA，操作步骤按照使用说明
书进行。加入小于 1 μg的起始模板总 ＲNA，当进行至 10个
循环后暂停程序，取出反应液 30 μL至新的 PCＲ管，作为探
寻最佳循环数的试验液体，剩余 70 μL反应液置于 4 ℃冰箱
备用，当进行至 13、16、19、22 个循环，取出反应液 5 μL至新
的 PCＲ管，将上述各循环产物取出 5 μL通过电泳得到的条
带寻找最佳循环数。之后将剩下的第一链产物全部进行至
最佳循环数。
1． 3． 4 抑制 SSH文库的构建。抑制 SSH杂交具体操作按照
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(14) :141 － 145，174 责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.14.050
PCＲ Select TM cDNA Subtraction Kit(Clontech 公司)的使用
说明书进行。以低温条件下凹叶厚朴 cDNA 作为试验组
(tester) ，25 ℃凹叶厚朴 cDNA作为驱动组(driver)。经 Ｒsa I
酶切消化、接头连接、2 次 SSH杂交和 2 次 PCＲ 完成整个抑
制 SSH杂交过程。利用看家基因 CBC18 的特异引物:上游
引物 TGATACAGATGGAACTAAC，下游引物 GGAACTCTAT-
ACGCTAAC。对 SSH和未 SSH的第 2 次 PCＲ产物进行 PCＲ
扩增，以检测 SSH 成功与否。
用分级柱对 SSH PCＲ 产物进行纯化回收，与 pMD － 18T
Easy载体(TaKaＲa公司)连接。利用电转化法将连接好的载
体导入大肠杆菌菌株 DH5a(Tian公司)中，取一些原始文库
稀释不同倍数混匀后移至培养皿中涂板，将培养皿放入
37 ℃恒温培养箱过夜培养后检查菌落形成与否。经蓝白斑
筛选，挑取所有白色克隆至含有 LB 液体培养基中，37 ℃振
荡过夜培养。第 2天每管取 1 μL采用质粒引物进行阳性克
隆 PCＲ检测。将阳性克隆送伯尚生物公司进行测序。
1． 3． 5 序列分析和功能分类。将测序的序列进行去载体、聚
类拼接得到 unigenes序列，将序列在 NCBI 蛋白数据库中进
行 BLAST比对，得到序列相关的相似核酸序列和相似蛋白
质。在 BLAST比对结果中，将对齐分(Score)＞ 80，同一性
(Ident)＞ 35% 的序列进行相关作用注释，将对齐分值
(Score)＜80的序列利用 BLASTN进行同源性比对。将序列
用 BLAST2GO进行功能分类。
1． 3． 6 荧光定量 PCＲ 分析候选基因的表达。将供试幼苗分
为 4组放入培养箱，温度分别设为25、6、－2、－8 ℃。胁迫处
理 24 h后取各处理凹叶厚朴顶芽，提取总 ＲNA，取各样品
ＲNA 1 μg，按 TaKaＲa 公司 PrimerScriptTM ＲT reagent Kit 说
明书进行反转录。基因的特异引物设计按照荧光定量 PCＲ
引物原则使用 Primer 5． 0软件对选定的 11 个低温相关的候
选基因设计特异引物，内参基因选用 UBC18基因。
反应在 ABI7500 实时荧光定量 PCＲ 仪上进行，循环数
为 40。每个样品 3 个重复，相对表达量的计算:△△Ct =
(CT，gene － CT，UBC18)低温处理 －(CT，gene － CT，UBC18)
常温处理。
2 结果与分析
2． 1 半致死温度 在 4个温度梯度下将凹叶厚朴幼苗胁迫
24 h后，电导率检测结果见图 1。从图 1 可以看出，在 － 8 ～
－10 ℃电导率直线上升，在 － 10 ℃时电导率为 65． 35%，膜
透性几乎完全破坏。运用 SPSS软件对内含物渗透值进行分
析，得回归方程:y =0． 752 6 /(1 +18． 925e －0． 372x) ，半致死
温度为 －7． 93，与预测值相近，可以代表凹叶厚朴顶芽的半
致死温度。
2． 2 cDNA的合成结果
2． 2． 1 ＲNA 提取结果。提取的 4 组凹叶厚朴 ＲNA 的
OD260 /OD280均高于 2． 0且小于 2． 2，认为 ＲNA中蛋白质或其
他有机物的污染在许可范围内。OD260 /OD230均大于 1． 8，表
明 ＲNA溶液中的盐类等无机物污染较小，且充分去除了漂
洗残留的乙醇。由图 2可知，4组提取的凹叶厚朴 ＲNA经电
图 1 电导率随温度的变化规律
Fig． 1 The variation law of conductivity with temperature
泳检测 28S、18S条带明亮，且 28S的亮度接近于 18S的 2倍，
说明 ＲNA的完整度较高，比例适当。试验中选取 tester1 与
driver1进行下一步试验。
图 2 ＲNA电泳检测图谱
Fig． 2 ＲNA electrophoresis detection
2． 2． 2 双链 cDNA的合成。从图 3可以看出，随着扩增循环
数的增加，dscDNA的 300 ～ 3 000 bp的亮度呈由浅到深到浅
的变化，且 dscDNA的片段大小也呈向上集中的趋势。选取
分布较集中、亮度最高、含量最多的 19 循环为最优循环数，
其产物集中分布在 0． 3 ～ 3． 0 kb，可以满足下一步试验的需
要，将 tester和 driver剩余的 70 μL反应液通过 PCＲ 进一步
扩增到 19循环，再进行下一步的反应。
图 3 dscDNA的电泳结果
Fig． 3 dscDNA electrophoresis results
2． 3 SSH文库的构建结果
2． 3． 1 双链 cDNA(dscDNA)的酶切。由图 4 可知，合成的
dscDNA分布在0． 2 ～3． 0 kb，酶切后的 dscDNA分布在0． 1 ～
2． 0 kb，条带下移说明 dscDNA的 ＲsaI酶切比较完全。
2． 3． 2 接头连接效率分析。由图 5 可知，看家基因 UBC18
的 3端引物与 primer1的 5端引物共同扩增的片段大于看家
241 安徽农业科学 2016 年
注:M为 DNA 分子量标准;driverB 与 testerB 为 ＲsaI 酶切产物;
driverA与 testerA为合成的试验组双链 cDNA。
Note:M． DNA molecular weight marker;driverB and testerB． ＲsaI
enzyme products;driverA and testerA． Synthetic test group
double － stranded cDNA．
图 4 driver与 tester组双链 cDNA合成与酶切结果
Fig． 4 driver and tester group double － stranded cDNA synthesis
and enzyme digestion
基因 UBC18 3端、5端引物扩增的片段，与预期结果一致。
注:M． DNA分子量标准;1、2． 以 Tested － 1 与 Adaptor1 连接为模
板 PCＲ的产物;3、4． 以 Tested － 2 与 Adaptor2Ｒ 连接为模板
PCＲ的产物;1、3．以 PCＲprimer1 与看家基因 3引物 PCＲ的产
物;2、4．以看家基因 3与 5引物 PCＲ的产物。
Note:M． DNA molecular weight marker;1，2． PCＲ products with
Tested －1 Adaptor1 connection as template;3，4． PCＲ prod-
ucts with Tested － 2 Adaptor2Ｒ connection as template;1，3．
With PCＲprimer1 and housekeeping gene 3primer PCＲ prod-
ucts;2，4． With housekeeping gene 3 and 5primer PCＲ prod-
uct．
图 5 接头连接效率检测
Fig． 5 Joint connection detection efficiency
2． 3． 3 消减产物 2次 PCＲ结果。第 2次 PCＲ扩增结束后，
取阳性对照扩增产物、未消减抑制性扩增产物、消减抑制性
扩增产物进行电泳检测，结果见图 6。由图 6可知，消减产物
2次抑制性 PCＲ扩增出的条带较亮且完整，由此可知，接头
连接效率较高。因为没有两端连有接头的 DNA是无法在特
定引物下进行扩增。第 2次 PCＲ扩增产物主要分布在0． 3 ～
1． 0 kb，且分布均匀，未见明显的主带，与预期结果符合。
2． 3． 4 消减效率检测。以消减杂交的产物为模板 PCＲ检测
UBC18看家基因，28个循环后才有条带出现，而以未经消减
杂交的产物为模板扩增，在第 18 个循环处即有条带出现。
UBC18 看家基因18S在消减 cDNA和未消减 cDNA中含量差
注:M． DNA分了量标准;1．阳性对照扩增产物，2．未消减抑制性扩
增产物，3．消减抑制性扩增产物。
Note:M． DNA molecular weight marker;1． Positive contrast amplifi-
cation products，2． Not cutting inhibitory amplification prod-
ucts，3． Cutting inhibitory amplification products．
图 6 消减产物 2次 PCＲ结果
Fig． 6 Ｒeduction product twice PCＲ results
异显著，表明 tester和 driver中共有的 cDNA已被有效消除，
同时也表明低温组和常温组的特异性差异表达基因也相应
得到富集(图 7)。
注:1 ～4分别为未经消减杂交产物的 18、23、28、33 循环，5 ～ 8 分
别为消减杂交产物的 18、23、28、33循环。
Note:1 －4 are 18，23，33 and 28 cycles of not cutting hybrid prod-
ucts，and 5 －8 are 18，23，28 and 33 cycles of cutting hybrid
products．
图 7 PCＲ检测看家基因 cDNA的消减效率
Fig． 7 PCＲ detection of housekeeping gene cDNA abatement ef-
ficiency
图 8 差减原始文库菌落
Fig． 8 Differential reduced original library colony plate
34144卷 14期 陆 宁等 凹叶厚朴低温胁迫 SSH文库的构建及差异基因的表达分析
2． 3． 5 文库质量评价。通过 IPTG 诱导，经 X － Gal 染色测
定原始文库的重组率，统计蓝白斑比例，结果表明文库重组
率为99． 3%(图 8) ，随机挑选的 23 个阳性克隆插入片段在
0． 2 ～1． 0 kb，平均值约为 0． 65 kb，菌液 PCＲ 检测得到的阳
性克隆重组率为 100%(图 9)。
图 9 差减 cDNA文库部分随机插入片段电泳图谱
Fig． 9 Subtraction cDNA library partial random insertion fragment electrophoresis
2． 4 测序结果
2． 4． 1 片段长度。消减文库共测序 900 个阳性克隆，通过
SEQMAN 软件分析，去除低质量及污染序列，共得到高质量
序列 837个。
经聚类拼接共得到 126 个 conting。经 SEQMAN 软件组
装，最后得到 97 个 unigenes(包括病毒或污染的 unigenes)。
其中，unigenes最长的序列为 5 849 bp，最短的为 523 bp，序
列长度集中在 1 000 ～ 3 000 bp，79%的序列长度大于 1 000
bp，43%的序列长度大于 2 000 bp，22%的序列长度大于
3 000 bp。由此可知，消减文库中的序列分布全面。
2． 4． 2 NCBI 蛋白数据库注释。从 GenBank 中对编码区进
行注释，通过与 NCBI蛋白数据库进行比对注释，得到与 uni-
genes序列编码同源性相近的蛋白信息。将 97 个拼接完成
的 unigenes与 NCBI蛋白数据库进行 BLAST比对注释，有 76
条 unigenes在数据库中得到注释。其中，来自于莲的基因有
29条、葡萄 12条、可可 7、海枣 5、油棕 4，表明凹叶厚朴抗寒
基因具有与上述植物较高的同源性。
2． 4． 3 GO功能分类。将具有已知或推定功能蛋白的 98 条
unigeness在 BLAST2GO 进行功能分类，成功对 58 条 unige-
ness进行了分类，共获得114个 GO terms。其中，生物学过程
最多(67) ，占 46． 52%，其次是分子功能(42)和细胞组件
(35) ，分别占 29． 17%和 24． 31%。
分类结果显示，凹叶厚朴抗寒抵御机制主要靠生物学过
程的调控方式进行，而细胞组件的调控相对较少。测序的
ESTs涵盖的功能较齐全，且能反映特定时期细胞表达信息
(低温胁迫) ，表明文库构建成功，可用于后续抗寒相关基因
的筛选。
2． 4． 4 可能在逆境环境中有响应的基因。在对 97 条 uni-
genes信息处理后，最终推定出有可能参与抗寒应激防御的
11个基因(表 1)。
表 1 推定出的 11条抗寒基因
Table 1 11 cold resistance genes
Unigene编号
Unigen No．
基因名称
Gene name
相关蛋白
Ｒelevant proteins NCBI ID E
527_g4 FLS基因 黄酮醇合成酶 AIY60790． 1 1． 47E －177
745_g1 CHS基因 查尔酮合酶 AHJ60259． 1 0
564_g1 LHCB1因 捕光叶绿素 a /b结合蛋白 XP_010243713． 1 1． 23E －178
776_g1 WＲKY基因 锌指家族蛋白家族 XP_010921056． 1 9． 98E －146
523_g1 HSP70基因 热激蛋白 70 ABF61868． 1 1． 12E －56
922_g1 APX基因 过氧化物酶 XP_010261239． 1 2． 82E －73
317_g1 PP2C基因 蛋白磷酸酶 XP_010264593． 1 1． 53E －136
470_g1 Trx基因 硫氧还蛋白 XP_010276450． 1 1． 31E －96
091_g1 EＲF基因 乙烯应答转录因子 XP_010276450． 1 2． 62E －40
601_g1 DＲEB基因 脱水应答元件结合蛋白 XP_012858875． 1 9． 80E －67
746_g1 GAPDH基因 3 －磷酸甘油醛脱氢酶 XP_008776392． 1 0
2． 5 荧光定量 PCＲ结果 由图 10可知，除 FLS基因外，其
他基因均比常温表达量较高。其中，CHS、APX、TＲX、DＲEB
等基因均随温度的降低表达量不断增加，LHCB、WＲKY、HSP、
PP2C等基因在 － 8 ℃时由于温度过低代谢受到抑制，从而
使表达量有所下降。EＲF、GAPDH基因表达量随温度的降低
而升高，这 2个基因与温度的相关性较强。但在温度过低时
植物代谢受到阻碍，基因的表达受到抑制，这是由于低温破
坏了基因正常的代谢途径。因而判定 CHS、APX、TＲX、EＲF、
441 安徽农业科学 2016 年
DＲEB、LHCB、WＲKY、HSP、PP2C、GAPDH 10 个基因在凹叶厚
朴受到低温侵害时出现差异表达，由此推断这 10 个基因在
低温时可能表现出防御机制。
图 10 荧光定量 PCＲ测定基因表达量
Fig． 10 Gene expression measured by fluorescence quantitative PCＲ
3 讨论
3． 1 文库构建注意事项 cDNA文库是生物在某一时期基
因所表达的文库，即 DNA所转录出的 ＲNA序列，因此，文库
中大部分为相同的高峰度序列，对于寻找低峰度的功能基因
较为困难。差减 cDNA 文库可以有效较少文库中的高峰度
基因，保留低峰度差异基因，有利于筛选出目的基因，是较为
理想的基因筛选方法。但差减文库相比全长文库试验步骤
多而复杂，因此需要注意以下几点:①植物的低温胁迫临界
值受季节气候的影响较大，在测定胁迫临界值后应尽快开始
差减文库的构建过程。此外，植物抗寒基因的表达量也会随
季节气候的变化而变化，因此，为了能准确反映凹叶厚朴 11
月份抗寒基因的表达情况，在进行荧光定量 PCＲ 验证基因
表达量时宜选择与 11月份温度相近的冬季进行为宜。②植
物取材。为了减少原始 tester组和 driver组在遗传背景和基
因表达上的差异，在植株取材上应选择相同年份、同一种源
且生长环境相同的植株。挑取形态外观相近的植株，取同一
部位作为试验材料。取材部位以嫩叶或嫩芽为宜。凹叶厚
朴为落叶植物，受到低温侵害时植物叶片自然掉落，叶片中
的抗寒基因较少。顶芽在低温下可存活，证明顶芽具有较多
的抗寒基因表达，因此，顶芽为凹叶厚朴构建差减文库较好
的取材。③ＲNA 的提取和 cDNA 的合成。在操作过程中
ＲNA与 DNA的降解都会造成差减文库假阳性的产生，加大
数据分析难度。因此，在试验过程中应尽量保持样品的低温
以避免外界污染，可以选择在冰上对试剂进行添加，且保持
周围环境洁净，在超净工作台上操作可以减少外界环境的干
扰，所有与样品有直接或间接接触的仪器和试剂都应消毒
杀菌。
3． 2 2种 cDNA 合成方法的比较 差减文库所用的 cDNA
是用 Oligo d法合成的 cDNA，因为 Oligo d(T)15和基因特异
性引物(GSP)比随机引物的特异性低。随机引物在转录过
程中会有多个退火位点，产物短且只有部分长度的 cDNA。
但 Oligo d法的起始模板是 mＲNA，加大了试验难度。
该试验最终采用 clontech 公司的 in － fusion SMAＲTer
cDNA Construction Kit 合成差减文库构建所需要的 cDNA，这
是由于:①在总 ＲNA中仅含有 2%左右的 poly(A)ＲNA，即
mＲNA，且在 mＲNA提取过程中会有大量 mＲNA的损耗。因
此，需要 100 μg左右总 ＲNA才可以满足后续试验的需求，而
10株左右的凹叶厚朴幼苗顶芽可提取出 100 μg总 ＲNA。②
用 Oligo d法合成的 cDNA未进行扩增，产物总量较少，在进
行纯化后又会有部分损失。下一步进行酶切后需要进行纯
化，还会损失一部分。最终因量太少在进行琼脂糖凝胶电泳
后无法显示出明显条带，不利于后续试验操作。③使用磁珠
提取 mＲNA步骤繁琐，且成功率较低，而过柱法提取 mＲNA
较为简单高效，但价格相对较高。
3． 3 抗寒基因评价 通过对所得到的 97 条基因比对，结果
表明，凹叶厚朴的低温胁迫信号途径为不依赖 ABA 的信号
途径，研究表明有 CBF /DＲE 参与的信号途径不依赖 ABA。
该试验通过对差减文库序列片段的深入分析得到 10个有关
胁迫响应的基因，并通过荧光定量 PCＲ 验证了基因的差异
表达，包括:①WＲKY基因属于锌指家族蛋白家族［5］，在多种
植物的抗性基因中均有发现，是抵御逆境的重要基因，但尚
未有关于 WＲKY 基因分子机制的相关资料［6］。②DＲEB /
CBF转录因子［7］通过调控凹叶厚朴的磷酸肌醇代谢、膜运
输、细胞新陈代谢、胁迫信号转导等来抵御低温［8］伤害。③
EＲF基因是 AP2 /EＲF［9］蛋白基因家族的其中一员［10］，AP2 /
EＲF蛋白基因与植物抗逆有关，其通过蜡质合成、激素合成
以及 ＲOS清除来抵御低温［11］。④HSP 基因转录［12］得到的
热激蛋白在植物受到低温侵害时可以减少溶质渗漏保护植
物细胞膜的完整性，减少细胞的脱水进而保护植物在低温下
不受侵害。⑤LHCB1基因转录得到的捕光叶绿素结合蛋白
与光能的吸收和多余能量的消耗有关［13］，可以提高植物在
低温下细胞膜的稳定性，且减少因低温产生的过氧化物的积
累。⑥APX可以在植物受到逆境伤害时减少过氧化物［14］和
羟基自由基的积累，保护植物叶绿体和其他细胞组分，是植物
抗逆过程中重要的酶［15］。⑦Trx硫氧［16］还蛋白可以调控酶活
性，并使可逆的二硫键及硫醇变化起氧化还原载体的功能，是
维持细胞膜内环境稳定的重要因子。⑨GAPDH基因［17］是与细
胞膜抗渗透胁迫及稳定性有关的基因。
(下转第 174页)
54144卷 14期 陆 宁等 凹叶厚朴低温胁迫 SSH文库的构建及差异基因的表达分析
得到的各种保健品，这无法满足人们对赶黄草功效的需求，
所以需要进一步研究开发赶黄草。
3 推广建议
3． 1 加大赶黄草产品的研发力度 目前市场上所销售的赶
黄草品种十分单一，且产品制作过程技术含量不高。市面上
常见的赶黄草产品是经过清洗、干燥、切断和简单包装的赶
黄草茎干，以及经过炒制成茶的赶黄草叶子等粗加工的保健
品，少有更进一步的提取物制成的产品。市场上与赶黄草相
关的产品大多为保健品，少有赶黄草为原料的药品销售。因
此，应采用现代技术手段，对赶黄草的来源、品质、成分等作
出系统有效的质量评价，对赶黄草的化学成分、药理作用以
及相关机制做进一步研究，为赶黄草成方制剂奠定基础，争
取研发出更多产品。
3． 2 打造赶黄草产品的经典品牌 赶黄草产品目前有自己
的品牌，但较杂乱，通过进一步走访调查发现，目前的生产厂
家也很重视品牌的建立与品牌知名度的提高。因此，目前更
应塑造属于赶黄草的经典品牌，这就需要厂家加大对赶黄草
品牌的宣传力度，让原有的品牌在现在的基础上更进一步，
提高品牌知名度，使赶黄草被更多的人所熟知，建立赶黄草
的经典品牌。
3． 3 拓宽赶黄草产品的宣传广度 目前针对赶黄草的宣传
相当局限，包括泸州本地的报纸、电视、电台等，都很难看到
对赶黄草的宣传，相反的，网络上关于赶黄草的介绍、资料比
较齐全。所以作为泸州的道地药材，应充分运用各种媒体对
赶黄草进行推广。特别是泸州本地人士，更应该对赶黄草有
更多更全面的了解，这样才便于向外推广。同时，零售药店
还可以运用促销手段，通过营业推广手段和公共关系活动，
直观有效地宣传赶黄草，使人们在购买赶黄草产品的同时对
赶黄草知识了解得更多，在增加赶黄草销售量的同时提升赶
黄草的知名度。
3． 4 争取政府部门的更多支持 作为泸州市的道地药材，
无论是赶黄草的研究开发，还是赶黄草的销售，都离不开政
府部门的支持。政府部门对科研方面的支持，可以使赶黄草
的研究更加顺利，如科研课题的批准与课题项目科研经费的
支持。近年来，因为政府部门的支持，赶黄草的研究开发得
到了很大发展，研究成果也相当可观。政府部门对赶黄草生
产与销售上的支持，使得赶黄草的销售不再局限于泸州市本
地，开始逐渐走出泸州分布全国各地，甚至国外都开始涉及。
因此，赶黄草产业在以后的发展中，更要争取获得政府部门
更大的支持。这不仅有利于推动泸州地方经济的发展，更有
利于推动医学上关于肝病治疗的进展并造福人类。
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471 安徽农业科学 2016 年