全 文 ：收稿日期:2012 － 08 － 11
作者单位:中国医科大学附属盛京医院 a. 呼吸内科，b. 老年
病科，沈阳 110004
* 通信作者
长梗秦艽酮诱导人肺鳞癌 NCI-H520 细胞凋亡
徐小嫚a* ，张 毅b，曲 丹a，张 萌b，陈 愉a，赵 立a
［摘 要］ 目的 探讨长梗秦艽酮诱导肺鳞癌 NCI-H520 细胞凋亡的作用。方法 应用四甲基偶氮噻蓝
( MTT) 法检测长梗秦艽酮对 NCI-H520 细胞增殖的影响; 流式细胞术检测细胞凋亡率; 透射电子显微镜观察长梗
秦艽酮作用细胞后亚细胞结构的变化。结果 MTT结果显示，长梗秦艽酮( 10、20、30、40 μmol /L) 明显抑制 NCI-
H520 细胞增殖，且呈剂量效应关系; 流式细胞术显示，长梗秦艽酮可以诱导 NCI-H520 细胞凋亡，凋亡率呈剂量效
应关系; 电子显微镜下经蛇床子素作用后的细胞可见染色质浓聚、边集等典型的凋亡改变，而空白对照组没有相
应的变化。结论 长梗秦艽酮能有效抑制肺鳞癌 NCI-H520 细胞的增殖、诱导细胞凋亡。
［关键词］ 长梗秦艽酮; 肺鳞癌; 凋亡
Waltonitone induces apoptosis of human squamous cell lung carcinoma NCI-H520
cell XU Xiao-mana* ，ZHANG Yib，QU Dana，ZHANG Mengb，CHEN Yua，ZHAO Lia(a. Department of Respiratory
Medicine，b. Department of Geriatrics Medicine，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，Chi-
na)
［Abstract］ Objective To study the effects of waltonitone that inducing human squamous cell lung carcinoma
NCI-H520 cells apoptosis．Methods The MTT assay was used to measure NCI-H520 cell proliferation． Apoptosis was de-
termined by flow cytometry analysis． The changes of the nucleus in the NCI-H520 cells after waltonitone-treated were in-
vestigated by transmission electron microscopy． Results The cells were treated with waltonitone(10，20，30，40 μmol /L)
for 24 h，the growth of NCI-H520 cells was suppressed in a dose-dependent manner． Flow cytometric analysis showed that
waltonitone induced NCI-H520 cells apoptosis in a dose-dependent manner． Chromosome condensation was observed by
transmission electron microscopy in treated cells，the untreated cells remained normal． Conclusion Waltonitone could in-
hibit the growth of NCI-H520 cells and induce cell apoptosis．
Key words:Waltonitone;Lung cancer;Apoptosis
长梗秦艽为龙胆科龙胆属植物，分布于我国
西藏东部至南部，主要用于治疗风湿性关节炎及
肝胆疾病等。长梗秦艽酮(Waltonitone)是从长梗
秦艽中分离得到的一个五环三萜类化合物。近年
来，国内学者研究发现，长梗秦艽酮具有潜在的抗
肿瘤作用，可以抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤
细胞凋亡［1-3］。但长梗秦艽酮对肺鳞癌 NCI-H520
细胞的作用尚不明确，本文就长梗秦艽酮对人肺
鳞癌细胞系 NCI-H520 细胞株的影响及机制进行
探讨。
1 材料与方法
1. 1 主要材料及仪器 人肺鳞癌 NCI-H520 细胞
由北京协和医学院肿瘤实验室惠赠;长梗秦艽酮:
上海中药标准化研究中心;RPMI-1640 培养基:美
国 Hyclone公司;胎牛血清:天津索莱宝生物工程
有限公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT) :南京凯基生物
科技发展有限公司;二甲基亚枫(DMSO) :美国
Sigma公司;0. 25%胰蛋白酶:以色列 Biological In-
dustries公司;AnnexinV /PI 双染试剂盒:南京凯基
生物科技发展有限公司;2. 5% 戊二醛、1. 0% 饿
酸:中国医科大学电镜室提供;流式细胞仪:美国
BD公司。
1. 2 细胞培养 用含 10% 胎牛血清的 RPMI-
1640 培养基在 37 ℃、饱和湿度、5%二氧化碳的培
养箱中进行培养。肺鳞癌 NCI-H520 细胞呈单层
贴壁生长，用 0. 25%胰蛋白酶消化传代，每 2 ～ 3
天传代 1 次，选取对数生长期细胞进行实验。
1. 3 MTT 法检测细胞增殖 消化收集 NCI-H520
细胞制成浓度为 1 × 105 /mL 的细胞悬液，接种于
96 孔板，100 μL /孔。实验设实验孔、空白对照孔
及阴性对照孔，每组设 3 个复孔。接种过夜细胞
贴壁良好后加入终浓度为 10、20、30、40 μmol /L的
长梗秦艽酮组，培养 24 h。培养结束前每孔加
MTT 20 μL，继续培养 4 h后吸去上清，每孔加 DM-
SO 150 μL 振荡混匀，酶标仪检测波长 570 nm 的
每孔光密度值(OD 值)。实验重复 3 次。增殖抑
制率按公式计算:抑制率 = 1-加药组 OD 值 /对照
组 OD值 × 100%。
1. 4 流式细胞术检测诱导细胞凋亡 消化收集
NCI-H520 细胞制成浓度为 5 × 105 的细胞悬液，接
种于 6 孔板中培养过夜，每组设 3 个复孔，分别加
入长梗秦艽酮(0、20、40 μmol /L)培养液继续培养
24 h。以不含 EDTA 的胰酶消化收集细胞，离心、
·581·实用药物与临床 2013 年第 16 卷第 3 期 Practical Pharmacy And Clinical Remedies，2013，Vol． 16，No． 3
DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.2013.03.030
洗涤细胞。AnnexinV-FITC、PI 双染细胞，避光反
应 15 min，流式细胞仪检测凋亡率。实验重复 3
次。
1. 5 电镜观察 NCI-H520 细胞形态变化 NCI-
H520 细胞接种于培养瓶中培养过夜，加入终浓度
为 40 μmol /L的长梗秦艽酮溶液培养 24 h，并设空
白对照组。培养结束后用锥形离心管离心弃上
清，沉淀细胞先后应用 2. 5%戊二醛、1%锇酸固
定，逐级缓慢脱水，包埋，超薄切片，染色，透射电
镜观察并照相。实验重复 3 次。
1. 6 统计学分析 实验数据使用 SPSS 13. 0 统计
软件进行统计学处理，组间比较用单因素方差分
析(ANOVA) ，或两组之间比较采用 t 检验，P ＜
0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 长梗秦艽酮对 NCI-H520 细胞增殖的抑制
作用 MTT法检测结果显示，长梗秦艽酮作用
24 h后，随着药物浓度增大，对细胞的增殖抑制作用
逐渐增加，呈现剂量效应关系(P ＜0. 05)。见图 1。
图 1 长梗秦艽酮对 NCI-H520 细胞的增殖抑制作用
注:* P ＜ 0. 05
2. 2 流式细胞术检测诱导细胞凋亡 流式细胞
仪 AnnexinV /PI双染法检测结果显示，长梗秦艽酮
作用 24 h后，随着药物浓度的增大，早期凋亡和晚
期凋亡细胞的比例都逐渐增加，呈现剂量效应关
系(见图 2)。
图 2 流式细胞仪检测长梗秦艽酮诱导 NCI-H520 细胞凋亡
2. 3 电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化
电子显微镜可观察到长梗秦艽酮作用于 NCI-H520
细胞 24 h后，细胞形态产生了变化，可见染色质浓
聚、染色质边集等改变，出现了典型凋亡改变，而
对照组无相应变化(图 3)。
图 3 电子显微镜下观察 NCI-H520 细胞的形态学变化(4 000 ×)
3 讨论
肺癌仍然是 21 世纪全世界恶性肿瘤患者死
亡的首要原因。近 20 年来，化学治疗等综合治疗
应用于临床，但其对肺癌长期生存率的提高影响
较小［4-5］。目前的治疗是以铂类为主的化疗方案，
由于化疗的毒副反应，很多患者难于依从，且一些
较晚期的患者不能耐受化疗［6］。而中药及其有效
成分以副作用小、不易耐药等优势目前得到了肿
瘤研究者和临床医生的青睐［7-8］。
长梗秦艽酮是从中药中提取的天然化合物。
本试验采用人肺鳞癌细胞系 NCI-H520 细胞为研
究对象，结果表明，长梗秦艽酮对 NCI-H520 细胞
具有增殖抑制作用，并且呈时间剂量依赖关系。
长梗秦艽酮可诱导 NCI-H520 细胞凋亡，荧光显微
镜观察到细胞凋亡的形态，进一步证实了长梗秦
艽酮的抗肿瘤作用。细胞凋亡是肿瘤研究的热
点，许多临床上常见的化疗药物包括中药的抗肿
瘤机制均可诱导细胞凋亡，从而达到控制肿瘤恶
性生长的目的［9-10］。本试验结果显示，长梗秦艽酮
可以抑制肺鳞癌 NCI-H520 细胞的增殖，其机制可
能与诱导细胞凋亡有关，为长梗秦艽酮在治疗肺
癌方面提供了实验依据，但仍需研究其抗肿瘤机
制及临床应用，以进一步评估其抗肿瘤效果。
参考文献:
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收稿日期:2012 － 08 － 03
作者单位:大连市中心医院乳腺外科，大连 116033
纳米碳示踪剂在乳腺癌腋窝前哨淋巴结活检中的应用
高 伟，郭文斌
［摘 要］ 目的 探讨纳米碳混悬注射液对乳腺癌前哨淋巴结示踪的效果。方法 2011 年 6 月至 2012 年
6 月对 36 例乳腺癌患者在术前进行注射纳米碳混悬液注射行前哨淋巴结示踪。术前 30 min，于乳晕周围分 4 点
皮下均匀注射，找到腋窝黑染淋巴结确定为前哨淋巴结。结果 本组成功检查前哨淋巴结 34 例，检出前哨淋巴
结 62 枚，平均每例患者检出 1. 82 枚。检出率为 94. 4% ( 34 /36) ，准确率为 91. 6% ( 33 /36) ，灵敏度为 93. 3% ( 14 /
15) ，假阴性率 6. 6% ( 1 /15) ，假阳性率为 0。结论 纳米碳混悬液作为示踪剂能够达到良好的淋巴结示踪效果，
能够准确判定腋窝分期，指导选择性的腋窝淋巴结清扫，从而减少术后并发症的发生。
［关键词］ 乳腺癌;前哨淋巴结; 纳米碳混悬液
Application of carbon nanoparticle suspension injection into the mammary gland in
the sentinel lymph node biopsy for breast cancer GAO Wei，GUO Wen-bin(Department of Breast
Oncolgy，Dalian Central Hospital，Dalian 116033，China)
［Abstract］ Objective To explore the tracing effect of carbon nanoparticle suspension injection in the sentinel
lymph node(SLN)biopsy of breast cancer．Methods From June 2011 to June 2012，36 patients with breast cancer un-
derwent lymphatic tracing with a carbon nanparticle． The carbon nanparticle suspension was subcutaneously injected a-
round the areola at 30 min before operation． The lymph nodes blacked were named SLN． Results The detection rate of
SLN was 94. 4%(34 /36)． The correct，sensitive and false negative rates were 91. 6%(33 /36) ，93. 3%(14 /15)and
6. 6%(1 /15) ，respectively． Conclusion The carbon nanoparticle suspension injected subcutaneously around areola in
SLN biopsy is helpful for accurately evaluating axillary lymph node condition and decreases the extension of surgery and
postoperative complication in patients with breast cancer．
Key words:Breast cancer;Sentinel lymph node;Carbon nanoparticle suspension
前哨淋巴结(Sontiel lymph nodes，SLN)是肿瘤
发生区域淋巴结转移的第一站。乳腺癌前哨淋巴
结活检(Sontiel lymph node biopsy，SLNB)技术通过
对 SLN状态的判定，有助于腋窝分期，从而指导选
择性的腋窝淋巴结清扫，使 SLN 阴性乳腺癌患者
避免腋窝淋巴结清除，降低了手术并发症的发生
率［1-6］。本研究采用纳米碳(Carbon nanoparticle，
CNP)混悬液作为示踪剂染料，判断 SLN 着色、转
移情况，探讨其在行腋窝 SLNB中的价值。
1 资料和方法
1. 1 一般资料 选择 2011 年 6 月至 2012 年 6 月
我院收治的乳腺癌患者 36 例，术前均经空心针穿
刺活组织检查明确诊断为浸润性乳腺癌，年龄
24 ～ 68 岁，平均 52. 3 岁;入选病例满足以下条件:
(1)既往无腋窝手术史; (2)非炎性、哺乳期乳腺
癌;(3)胸壁乳腺无放射治疗史;(4)排除多中心病
灶，均为单发病灶。肿块位于左侧 20 例，右侧 16
例;肿瘤最大径 1. 6 ～ 3. 2 cm，平均 2. 4 cm;肿块位
于乳房外上象限 15 例，中央区 5 例，外下象限 8
例，内上象限 5 例，内下象限 3 例;T1 27 例，T2 9
例。肿瘤表皮均无破溃;术前体检或超声未发现
腋窝有肿大淋巴结，影像学检查未发现远处转移。
1. 2 CNP行腋窝淋巴结示踪方法 术前 30 min，
先用 1 mL 注射器抽取 1 支 CNP 混悬液(每支
·781·实用药物与临床 2013 年第 16 卷第 3 期 Practical Pharmacy And Clinical Remedies，2013，Vol． 16，No． 3