全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(30770484)
作者简介:章漳 ,女 ,博士研究生　　研究方向:中药活性成分及作用机制　　Tel:(021)22125390　　＊通讯作者:丁侃 ,男 ,研究员 ,博士生导
师　　研究方向:糖化学及糖生物学　　Tel:(021)50806928　　E-mail:kding@mail.shcnc.ac.cn
长梗秦艽酮体外抗肿瘤活性及其作用机制探讨
章漳 1, 2 ,段朝辉 1 ,丁侃 2＊ ,王峥涛 1(1.上海中医药大学中药研究所中药标准化教育部重点实验室 ,上海 201203;2.中国科学院上海
药物所糖生物学及糖化学实验室 ,上海 201203)
摘要:目的　研究长梗秦艽酮体外抗肿瘤活性, 探讨其部分作用机制。方法　采用噻唑蓝(MTT)法观察长梗秦艽酮对 BEL-
7402, HeLa, BXPC-3, PANC-1细胞增殖的影响 ,流式细胞术分析其对 BEL-7402细胞周期的影响 , Westernblot法检测其对 ERK1/2
蛋白激酶磷酸化的作用 , RT-PCR法检测其对 p53和乙酰肝素酶(heparanase)的 mRNA表达水平的影响。结果　长梗秦艽酮能够
显著抑制 4种肿瘤细胞的生长。长梗秦艽酮作用于 BEL-7402细胞后能够引起 S期细胞周期阻滞 , 激活 ERK1/2磷酸化而对 p38
磷酸化没有影响 ,上调 p53的 mRNA表达水平 ,抑制乙酰肝素酶的mRNA表达。结论　长梗秦艽酮具有显著的抗肿瘤活性, 其作
用机制可能与激活 ERK1/2信号通路及上调 p53基因从而诱导细胞周期阻滞和抑制乙酰肝素酶的表达有关。
关键词:长梗秦艽酮;肿瘤;细胞周期;ERK1/2;p53;乙酰肝素酶
中图分类号:R965 　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2010)04-0259-05
BioactivityandMechanismStudyofWaltonitoneonTumorCelsGrowthinvitro
ZHANGZhang1, 2 , DUANChao-hui1 , DINGKan2＊ , WANGZheng-tao1(1.KeyLaboratoryofStandardizationofChinese
MedicinesofMinistryofEducation, InstituteofChineseMateriaMedica, ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine, Shanghai
201203, China;2.GlycobiologyandGlycochemistryLaboratory, ShanghaiInstituteofMateriaMedica, ChineseAcademyofSciences,
Shanghai201203, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　Toinvestigateinhibitoryefectsofwaltonitone(WT), anewursane-typepentacyclictriterpeneisolated
fromGentianwaltoniBurkill, onseveralhumantumorcelsgrowthinvitroandtounderstandthepossiblemechanisms.METHODS　
ThepotentialefectofWTonthecelviabilitywasexaminedusingMTTassay.ThecelcycledistributionofBEL7402cellstreatedwith
WTwasanalyzedbyflowcytometry.PhosphorylationofERK1/2 andp38MAPKweredetectedbyWesternblot, whilethemRNAex-
pressionofp53 andheparanaseweredeterminedbyRT-PCRanalysis.RESULTS　WTstronglyinhibitedtheBEL7402, HeLa, BX-
PC-3, PANC-1 celsgrowth.WTinducedSphasecelcyclearrestandactivatedERK1/2phosphorylationinBEL-7402cels.ThemR-
NAexpressionofp53 wasup-regulatedduringWTtreatment.However, themRNAexpressionofheparanasewassignificantlyde-
creased.CONCLUSION　Theanti-tumoractivityofWTmightbeatributedpartlytotheinductionofcellcyclearrestthroughERK1/
2 pathwayandinhibitionofheparanaseexpressionbyup-regulationofp53gene.
KEYWORDS:waltonitone;tumor;celcycle;ERK1/2;p53;heparanase
　　长梗秦艽(GentianawahoniBurkil)为龙胆科
龙胆属植物 ,分布于我国西藏东部至南部 ,其根在当
地可作为秦艽的代用品 ,主要用于治疗风湿性关节
炎及肝胆疾病等 。在前期实验中 ,本实验室对长梗
秦艽的化学成分进行了系统研究[ 1] ,从中分离鉴定
了包括三萜类 、酚酸类 、环烯醚萜类 、倍半萜类等一
系列成分 ,同时对这些化合物的体外生物活性进行
了初步筛选。长梗秦艽酮(waltonitone, WT)是从长
梗秦艽中分离得到的一个新的乌苏烷型五环三萜化
合物(图 1),笔者在体外抗肿瘤活性筛选时发现其
有较强活性 ,本实验旨在观察 WT体外抗肿瘤活性 ,
探讨其对敏感瘤株的作用机制 ,为新药开发和临床
应用提供理论基础和实验依据。
1　材　料
1.1　仪器
FormaSeriesⅡ二氧化碳培养箱(美国 Forma公
司);CKX41倒置显微镜(日本 Olympus公司);Ther-
moMultiskanMK3酶标仪 (美国 Thermo公司 );
5417R型台式高速冷冻离心机 (德国 Eppendorf公
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图 1　长梗秦艽酮(WT)的化学结构式
Fig.1　Thechemicalstructureofwaltonitone(WT)(28-hy-
droxy-3-oxo-12-ursene)
司);F-4500紫外分光光度计(日本 Hitachi公司);
2720型 PCR仪 (美国 AppliedBiosystems公司);
Tannon水平及垂直电泳槽 (上海天能科技有限公
司);Tanon3500凝胶图像分析系统(上海天能科技
有限公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国 Becton
Dickinson公司);半干转印仪(美国 Bio-Rad公司)。
1.2　试剂及药品
RPMI1640和 DMEM培养基 (美国 GibcoBRL
公司);胎牛血清(FBS,杭州四季青公司);Trizol试
剂(美国 Invitrogen公司);AMV逆转录酶和 ExTaq
酶(日本 TaKaRa公司);ERK1 /2和 p38抗体(美国
CelSignalingTechnology公司);PVDF膜(美国 Bio-
Rad公司);化学发光检测试剂(美国 Pierce生物技
术公司);p53、乙酰肝素酶 、18SRNA引物 (上海生
工生物工程技术有限公司合成);二甲基亚砜(DM-
SO)、噻唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)和 RNase以及其
他常用生物试剂(美国 Sigma公司)。
WT由上海中医药大学中药研究所从长梗秦艽
中分离提取 ,结构主要经 NMR, MS光谱鉴定 ,纯度
95%以上 。WT用 DMSO配成 100mmol· L-1的储存
液 ,使用前用培养基稀释到所需浓度(DMSO终含量
不超过 0.1%)。
2　方　法
2.1　细胞培养
人肝癌 BEL-7402细胞株 ,人宫颈癌 HeLa细胞
株 ,人原位胰腺癌 BXPC-3细胞株和人胰腺导管上
皮癌 PANC-1细胞株均购自中科院上海生化细胞所
细胞库 。BEL-7402, HeLa和 BXPC-3细胞用含 10%
FBS的 RPMI1640培养 , PANC-1细胞用含 10% FBS
的 DMEM培养 ,取对数生长期细胞用于实验。
2.2　MTT法测定细胞生长
细胞接种于 96孔板内 ,待细胞贴壁后加入不同
浓度的 WT(每个浓度设 3个复孔),与细胞共孵育
48 h后加入 MTT(终质量浓度 0.5mg·mL-1)置培
养箱中反应 4h,弃去孔中培养基和 MTT,加入 DM-
SO后立即用酶标仪在 570 nm处测定吸光度(A),
所得值再减去空白的吸光度。采用 Logit法计算半
数抑制浓度(IC50)。
2.3　流式细胞术分析细胞周期
细胞经 WT处理一定时间后 ,胰酶消化收集细
胞 , 4 ℃固定在预冷的 70%乙醇中 。检测前离心弃
去固定液 , 用 PBS洗 2遍后 , 将细胞重悬在含 50
mg· L-1 RNase和 50 mg·L-1 PI的 PBS中 ,调整细
胞数为 1×106个 · mL-1 ,室温置暗处染色 30 min,
300目尼龙膜过滤后用流式细胞仪检测 DNA含量 ,
采用 ModiFit软件进行细胞周期分析 。
2.4　Westernblot蛋白质印迹分析
细胞经 WT处理一定时间后 ,加入 RIPA缓冲液
裂解(0.2% SDS, 0.5% TritonX-100, 5 g· L-1脱氧
胆酸钠 , 1 mmol· L-1 NaF, 1 mmol· L-1 Na3VO4 , 1
mmol· L-1 PMSF, 1% proteaseinhibitorcocktail),测
定总蛋白含量 。取等量蛋白样品加入上样缓冲液
99 ℃变性 8 min后 ,以 10% SDS-PAGE胶电泳 ,用
半干法将胶上的蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF
膜用含 5%的脱脂奶粉的 TBST溶液 (20 mmol·
L-1 pH8.0Tris, 150mmol· L-1 NaCl, 0.1%Tween-
20)封闭后 ,加一抗于 4 ℃孵育过夜 ,再与标记有辣
根过氧化物酶的二抗室温孵育 1 h。过氧化物酶活
性用增强型化学发光检测系统检测。
2.5　半定量 RT-PCR分析
细胞经 WT处理一定时间后 ,用 Trizol试剂依
照说明提取总 RNA,取 1 μgRNA用 AMV逆转录酶
和随机引物合成 cDNA。采用 p53,乙酰肝素酶引物
进行 PCR反应扩增目的基因 。p53上游引物序列:
5′-GTCTACCTCCCGCCATAA-3′,下游引物序列:5′-
CATCTCCCAAACATCCCT-3′,产物为 301bp;乙酰肝
素酶上游引物序列:5′-GCTACTCCGAGAACACTAC-
CAGA-3′, 下游引物 序列:5′-TGAATCAATCACT-
TCTCCACCAG-3′,产物为 427 bp;内参照 18SRNA
上游引物序列:5′-GTGGAGCGATTTGTCTGGTT-3′,
下游引物序列:5′-ACGCTGAGCCAGTCAGTGTA-3′,
产物为 201 bp。 PCR反应条件为 94℃变性 50 s, 55
℃退火 50s, 72 ℃延伸 50s, p53和乙酰肝素酶为 30
个循环 , 18SRNA为 25个循环 。 PCR产物经 1.5%
琼脂糖凝电泳 ,用计算机图像扫描分析系统测定电
·260· ChinPharmJ, 2010February, Vol.45No.4　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2010年 2月第 45卷第 4期
泳条带光密度值 , p53和乙酰肝素酶表达水平以该
条带密度与 18SRNA的百分比(%)表示 。
2.6　统计学处理
所有数据以 x±s的形式表示 ,用 t检验检测各
组间的差异 , P<0.01为有统计学上差异。
3　结　果
3.1　MTT法检测 WT对几种肿瘤细胞活性的影响
不同浓度的 WT处理人肝癌 BEL-7402细胞 ,人
宫颈癌 HeLa细胞 ,人原位胰腺癌 BXPC-3细胞和人
胰腺导管上皮癌 PANC-1细胞 48 h后 ,用 MTT法检
测细胞的活性。结果显示 , WT能够强烈抑制 BEL-
7402、HeLa、BXPC-3细胞的生长 ,对 PANC-1细胞活
性也有一定的抑制作用 ,抑制率随着浓度增大而增
大(图 2), 100 μmol· L-1的 WT对它们的抑制率分
别为 99.3%, 92.3%, 96.5%, 53.9%,并测得其 IC50
值分别为 (13.9 ±5.2), (27.3 ±5.7), (35.6 ±
3.5), (85.4±11.2)μmol· L-1 ,其中 BEL-7402细
胞对 WT最为敏感。
3.2　WT对 BEL-7402细胞周期的影响
流式细胞分析结果显示 , BEL-7402细胞经 25
μmol· L-1 WT处理后 ,细胞周期发生明显的变化 ,
G0 /G1 、G2 /M期细胞减少 , S期细胞增多 ,和对照组
相比 , WT处理 BEL7402细胞 12和 24 h后 , G0 /G1
分别减少 8.43%和 27.15%, G2 /M期细胞分别减少
8.23%和 12.56%, S期细胞分别增多了 16.46%和
39.48%,表明 WT处理可使 BEL-7402细胞阻滞于
S期 ,且作用时间越长周期阻滞效果越显著(图 3)。
3.3　WT对 BEL-7402细胞 ERK1/2磷酸化的影响
BEL-7402细胞经 25μmol· L-1 WT处理后 ,用
Westernblot蛋白质印迹分析法检测磷酸化 ERK1/
2,总 ERK1 /2, p38蛋白激酶以及内参照 β-actin的
　　
蛋白表达 ,结果显示 WT作用 0.25, 0.5, 1, 2和 3 h
后 ,显著激活 BEL-7402细胞 ERK1/2磷酸化 ,而对
总 ERK1/2和 β -actin没有影响。 ERK1/2磷酸化水
平在 WT作用 30min后开始升高 ,作用 2 h时达高
峰(图 4A)。 WT浓度越高 ,激活 ERK1/2磷酸化作
用越显著 (图 4B)。阳性对照药物紫草素 (shiko-
nin)能明显激活 p38磷酸化(图 4C),但 WT处理对
BEL-7402细胞 p38蛋白激酶的磷酸化没有影响 。
3.4　WT对 BEL-7402细胞 p53和乙酰肝素酶的
mRNA表达的影响
BEL-7402细胞分别经 25 μmol· L-1 WT处理
12、24和 36 h后 ,用 RT-PCR法检测 p53和乙酰肝
素酶基因 mRNA的表达。结果显示 , WT能够明显
上调 p53的 mRNA表达水平(图 5A),作用 24和 36
h后分别升高了约 1.5和 2.1倍 ,与对照组相比有
显著差异(P<0.01)。而 WT处理使乙酰肝素酶的
mRNA表达水平显著下降(图 5B),作用 24和 36 h
后分别降低了约 40%和 73%,与对照组相比有显著
差异(P<0.01)。
图 2　WT对BEL-7402, HeLa, BXPC-3和 PANC-1细胞活性
的影响 .n=3, x±s
Fig.2　 EffectsofWTonBEL-7402, HeLa, BXPC-3 and
PANC-1celsgrowth.n=3, x±s
图 3　WT对 BEL-7402细胞周期的影响(实验重复 3次 , 图为其中 1次实验结果)
Fig.3　EfectofWToncelcycledistributioninBEL-7402 cels(Datarepresentedoneofthreetimesindependentexperiments)
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图 4　WT对 BEL-7402细胞 ERK1/2和 p38MAPK磷酸化的
影响(实验重复 3次 ,图为其中 1次实验结果)
A-WT处理不同时间对BEL-7402细胞 ERK1/2磷酸化的影响;B-不同浓度
WT对 BEL-7402细胞ERK1/2磷酸化的影响;C-WT处理不同时间对 BEL-
7402细胞p38磷酸化的影响
Fig.4　EfectsofWTonERK1/2andp38MAPKphosphoryla-
tioninBEL-7402 cells(Datarepresentedoneofthreetimesin-
dependentexperiments)
A-time-efectofERK1/2 MAPKphosphorylationinBEL-7402 celstreatedwith
WT;B-dose-efectofERK1/2MAPKphosphorylationinBEL-7402celstreated
withWT;C-time-efectofp38MAPKphosphorylationinBEL-7402celstreated
withWT
4　讨　论
近年来研究发现 ,从中药中提取的一些三萜尤
其是五环三萜类化合物具有潜在的抗肿瘤作用 [ 2] ,
如熊果酸和齐墩果酸不仅对多种促癌 、致癌物有抵
抗作用 ,而且在肿瘤形成的各阶段都有预防和治疗
作用 ,包括抑制肿瘤细胞增殖 、转移 、侵袭 ,诱导肿瘤
细胞分化 ,促进凋亡 , 抗血管生成等 [ 3] 。本实验结
果显示 , WT具有显著的体外抗肿瘤活性 ,对 4种肿
瘤细胞株 BEL-7402、HeLa、BXPC-3、PANC-1均有不
同程度的抑制作用 ,其中对肝癌 BEL-7402细胞作
用最敏感。
已有研究表明 ,诱导肿瘤细胞周期阻滞是抗肿
瘤作用主要机制之一 ,许多参与调控细胞周期的蛋
白和基因都与细胞周期阻滞密切相关 ,如丝裂原活
化蛋 白 激 酶 (mitogen-activated proteinkinases,
MAPK)和肿瘤抑制基因 p53。细胞外信号调节激酶
(extracelularsignalregulatedkinase, ERK)1/2和
p38都属于 MAPK,其中 ERK1 /2信号转导通路主要
传递细胞丝裂原信号 ,参与调节细胞周期及促进细
　　
图 5　WT对 BEL-7402细胞 p53和乙酰肝素酶的 mRNA表
达的影响 .n=3, x±s
A-p53;B-乙酰肝素酶;1)P<0.01,与对照组相比
Fig.5　EffectsofWTonp53 andheparanasemRNAexpression
inBEL-7402 cels.n=3, x±s
A-p53;B-heparanase;1)P<0.01, vscontrol
胞增殖分化 [ 4] , p38 MAPK信号转导通路则在炎
症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用 。野
生型 p53基因是重要的肿瘤抑制基因 ,其作为一
种转录因子能促进或抑制很多与细胞周期及凋
亡相关基因的表达 [ 5] 。 Chen等 [ 6]的研究表明 ,
硒代胱氨酸 (selenocystine)能够抑制人乳腺癌
MCF-7细胞增殖 , 这种作用是通过激活 ERK1 /2
磷酸化和上调 p53诱导细胞周期 S期阻滞 ,促进
肿瘤细胞凋亡实现的 。本实验结果显示 , WT能
够诱导 BEL-7402细胞 S期阻滞 ,激活 ERK1 /2
磷酸化而对 p38 MAPK没有影响 ,同时上调 p53
基因的表达 。提示 WT抑制肿瘤细胞增殖的机制
可能是通过影响 ERK1 /2蛋白激酶的磷酸化水
平 ,调节基因表达 ,使促进肿瘤细胞异常增殖的
信号通路在一定程度上受到阻滞 , 从而影响细胞
的增殖 。
乙酰肝素酶是目前发现的哺乳动物细胞中唯一
能降解细胞外基质和基底膜中硫酸乙酰肝素糖链的
·262· ChinPharmJ, 2010February, Vol.45No.4　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2010年 2月第 45卷第 4期
糖苷 β(1※4)内切酶 ,在肿瘤增殖 、侵袭转移和血管
生成等过程中发挥了重要作用 ,它的过表达通常与
肿瘤的预后不良正相关 ,被认为是肿瘤治疗的新靶
点 [ 7] 。乙酰肝素酶抑制剂的研究是抗肿瘤药物研发
中的一个新领域 ,如已进入三期临床的乙酰肝素酶抑
制剂 PI-88,受到人们的广泛关注 [ 8] 。最近研究表明 ,
野生型 p53基因能够与乙酰肝素酶的启动子结合 ,抑
制乙酰肝素酶基因的表达[ 9] 。本实验结果显示 , WT
能够上调 p53基因同时明显抑制乙酰肝素酶的表达 ,
进一步影响肿瘤细胞增殖 。此外 , WT对肿瘤侵袭转
移和血管生成的作用有待进一步的研究 。
综上所述 ,笔者推测 WT抗肿瘤作用机制与细胞
周期阻滞有关 ,同时 WT也能抑制乙酰肝素酶的表
达。初步信号通路研究提示 WT可能是通过激活
ERK1/2信号通路 ,上调 p53基因诱导细胞周期阻滞
和抑制乙酰肝素酶的表达从而抑制肿瘤细胞的生长。
REFERENCES
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ulatesheparanasegeneexpression[ J].Oncogene, 2006, 25(28):
3939-3947.
(收稿日期:2009-05-06)
关于 “2010世界药学科学大会暨 AAPS年会与博览会 ”征文通知
由国际药学联合会与美国药学科学家协会共同举办的 2010年世界药学科学大会暨 AAPS年会与博览会(2010 Pharma-
ceuticalSciencesWorldCongress＆AAPSAnnualMeetingandExposition, PSWC2010)将于 2010年 11月 14 ～ 18日在美国路易斯
安那州新奥尔良市召开 ,会期 5天。
会议主题为:通过药学科学的发展改善全球健康状况。本次会议将围绕药学科研领域展开研讨 , 内容广泛 , 包括生物技
术 、药物分析 、临床药理 、药物化学 、天然药物以及与药物研发相关的法律法规等 , 会议详细内容请访问大会网站 www.
pswc2010.org。中国药学会作为大会的协办单位 , 参与了大会筹备和会议议程的制定工作 , 并有多名药学专家将担任分会场
主席和大会报告人。为展示我国药学科学发展水平 ,参与更多的国际药学交流合作 , 中国药学会鼓励参会人员积极提交论文
摘要 , 发表壁报参加交流。
欲提交大会摘要者请访问 htp://www.pswc2010.org/abstracts。
具体通知及相关附件下载请见中国药学会网站 www.cpa.org.cn。
关于征集 2011年世界药学大会暨 FIP第 71届年会报告人提名的通知
国际药学联合会 2011年世界药学大会将于 2011年 9月 2 ～ 8日在印度海得拉巴召开。现开始征集 2011年世界药学大
会报告人提名。为加强国际药学界对我国医药卫生事业改革与发展的了解 ,请各有关单位和各专业委员会按照 FIP关于报告
人提名通知中的要求推荐报告人 ,并于 2010年 2月 25日前将被推荐人的资料通过电子邮件发送到我会秘书处国际交流部。
具体通知可从中国药学会网站 www.cpa.org.cn下载。
[本刊讯 ]
·263·中国药学杂志 2010年 2月第 45卷第 4期　　　 　 　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2010February, Vol.45No.4