全 文 ：收稿日期:2016 － 04 － 27
作者单位:中国医科大学附属盛京医院 a. 干诊科，b. 第一呼
吸内科，沈阳 110004
基金项目:辽宁省博士启动基金项目(20121130)
* 通信作者
DOI:10． 14053 / j． cnki． ppcr． 201607004
长梗秦艽酮对吉西他滨耐药肺癌 H1975 细胞的抑制作用及其机制研究
张 毅a，徐小嫚b，张 萌a，何 平a*
［摘 要］ 目的 探讨天然化合物长梗秦艽酮对吉西他滨耐药肺腺癌细胞 H1975 增殖、凋亡的影响及其可
能机制。方法 采用MTT 比色法检测长梗秦艽酮对 H1975 细胞增殖的影响;采用 AnnexinV /PI流式细胞仪双染
法检测长梗秦艽酮诱导 H1975 细胞凋亡;通过荧光电子显微镜观察长梗秦艽酮诱导凋亡的细胞核形态变化;通
过Western blot研究长梗秦艽酮发挥抑癌作用的靶蛋白及机制。结果 长梗秦艽酮显著抑制肺癌细胞 H1975 的
增殖，且呈现明显时间剂量依赖性;长梗秦艽酮可以诱导细胞凋亡;长梗秦艽酮处理使细胞出现染色质边集、核碎
裂等典型的细胞凋亡改变;长梗秦艽酮处理使 Bcl-2 表达降低，Bax 表达升高。结论 长梗秦艽酮可以抑制
H1975 细胞增殖，通过对 Bcl-2 和 Bax 的调节诱导细胞凋亡，是一种潜在的天然抗肿瘤药物。
［关键词］ 长梗秦艽酮;肺癌;增殖;凋亡
Waltonitone inhibits proliferation and induces apoptosis in gemcitabine-resistent
H1975 lung cancer cells ZHANG Yia，XU Xiao-manb，ZHANG Menga，HE Pinga* (a. Department of Geri-
atrics Medicine，b. Department of Ｒespiratory Medicine，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang
110004，China)
［Abstract］ Objective To study the effects and the possible mechanisms of waltonitone on cell proliferation
and apoptosis in lung cancer H1975 cells． Methods MTT assay and Annexin V-FITC flow cytometry were used to
measure the effects of waltonitone on cell proliferation and apoptosis． In addition，waltonitone-induced morphological
changes were assessed by Hoechst 33342 staining under a fluorescence microscope. Finally，to explored the possible
mechanisms by which waltonitone stimulated apoptosis we performed western blot to screening its potential targets． Ｒe-
sults The proliferation of H1975 cells was inhibited by waltonitone in a dose-and-time dependent manner． Flow cy-
tometry analysis showed that waltonitone could induce H1975 cells apoptosis． Chromosome condensation and nuclear
fragmentation were observed by Hoechst 33342 dying in treated H1975 cells. Waltonitone down-regulated Bcl-2 and up-
regulated Bax in H1975 cells． Conclusion Waltonitone remarkably suppressed proliferation and greatly promoted ap-
optosis of H1975 cells possibly through regulation of Bcl-2 and Bax．
Key words:Waltonitone;Lung cancer;Proliferation;Apoptosis
0 引言
近年来，中药抗肿瘤作用越来越受到关注，大
量中药复方及天然单体成分在实验和临床研究中
被证实具有显著的抗肿瘤作用。长梗秦艽，多年
生草本，是龙胆科龙胆属植物，主要分布于我国西
藏东部和南部地区，作为中草药曾长期用于治疗
风湿性关节炎及肝胆疾病。长梗秦艽酮(waltoni-
tone)是从长梗秦艽中分离得到的一个五环三萜化
合物。有研究表明，长梗秦艽酮能够抑制肝癌细
胞的增殖，同时促进肝癌细胞的凋亡［1］。与此结
果类似，我们之前发现，长梗秦艽酮能抑制肺癌
A549 细胞的增殖并可促进其凋亡［2-3］，提示长梗
秦艽酮是一种潜在的抗肿瘤药物。本研究旨在探
讨长梗秦艽酮对吉西他滨耐药的肺癌 H1975 细胞
中潜在的抑癌作用及其机制。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 人肺癌 NCI-H1975 细胞购自
中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;长梗
秦艽酮(waltonitone):上海中药标准化研究中心，
用 DMSO 配制成 100 mmol /L 贮存液于 － 20 ℃保
存;ＲPMI-l640 培养基:美国赛默飞公司;胎牛血
清:美国 Hyclone公司;MTT 细胞增殖及细胞毒性
检测试剂盒:江苏凯基生物技术股份有限公司;二
甲基亚枫(DMSO):美国 Sigma 公司;胰蛋白酶:
美国 sigma公司;Hoechst33342:美国 Sigma 公司;
AnnexinV /PI双染细胞凋亡检测试剂盒:江苏凯基
生物技术股份有限公司;流式细胞仪:美国 BD 公
司;蛋白裂解液:美国赛默飞公司;Bcl-2 抗体:CST
公司;Bax 抗体:CST 公司;GAPDH 抗体:美国
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santa cruz 公司。
1. 2 细胞培养 H1975 细胞用含 10%胎牛血清
的 ＲPMI-l640 培养基在 37 ℃，饱和湿度、5%二氧
化碳的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
1. 3 MTT 法检测细胞增殖 消化收集对数生长
期细胞，每孔加入 100 μL 约 3 × 103个细胞于 96
孔板中，细胞培养过夜。实验组分别加入不同浓
度长梗秦艽酮溶液(10、20、30 μmol /L)作用 5 d。
对照组加入等量的 DMSO 溶液。每实验组设 3 个
重复孔。培养结束前每孔加 20 μL MTT 溶液继续
培养 4 h，小心吸去上清，每孔加 150 μL DMSO，振
荡混匀后酶标仪检测(波长 570 nm)每孔光密度
值(OD 值)。实验重复 3 次。增殖抑制率按如下
公式计算:抑制率 = 1 －加药组 OD 值 /对照组 OD
值 × 100%。
1. 4 流式细胞术检测细胞凋亡 H1975 细胞以
5 × 105 /孔接种于 6 孔板中培养过夜，分别加入终
浓度为 30 μmol /L 的长梗秦艽酮溶液，并设空白
对照组。继续培养 24、48 h后，用不含 EDTA 的胰
酶消化收获细胞。4 ℃、1 500 转 /min 离心 5 min，
收集细胞，冷 PBS 洗涤离心细胞 2 次。用 500 μL
1 × Binding Buffer 悬浮细胞，浓度大约为 1 ×
106 /mL。在细胞悬浮液中加入 5 μL AnnexinV-
FITC 轻轻混匀，再加入 5 μL PI 后轻轻混匀避光
孵育15 min。在 1 h内用流式细胞仪检测。结果用
Cellquest专业软件获取分析数据。实验重复 3 次。
1. 5 荧光显微镜观察 H1975 细胞核形态 将
H1975 细胞 5 × 105 /孔接种于 6 孔板中培养过夜，
每组设 3 个复孔，加入 30 μmol /L 的长梗秦艽酮
溶液继续培养 24、48 h。PBS 清洗 2 次，吹干，固定
液(甲醇:冰乙酸 = 3∶ 1)固定 15 min，PBS 清洗后
加入 Hoechst 33342(浓度为 5 mg /L)荧光染料
1 mL，37 ℃避光孵育 15 min，应用荧光显微镜观
察、照相。实验重复 3 次。
1. 6 Western Blot 实验 H1975 细胞以 5 × 105 /
孔接种于 6 孔板中培养过夜，每组设 3 个复孔，加
入 30 μmol /L 的长梗秦艽酮溶液继续培养 48 h。
用蛋白裂解液提取细胞中的总蛋白，并用 Bradford
方法对蛋白进行定量。40 μg 总蛋白在 10% 的
SDS-PAGE凝胶中电泳分离并转印到 PVDF 膜
上。用 5%脱脂奶粉对膜封闭 2 h，然后用相应的
一抗 4 ℃孵育过夜(Bcl-2 1 ∶ 1 000;Bax 1 ∶ 1 000;
GAPDH 1∶ 1 000)。对应的二抗在 37 ℃条件下孵
育 2 h，在膜上滴加 ECL 发光液，通过 BioImaging
Systems (UVP，Upland，CA，USA)系统进行发光。
1. 7 统计学分析 实验数据结果用 SPSS 13. 0 统
计软件进行统计学处理，组间比较用单因素方差
分析(ANOVA)或两组之间比较采用 t 检验，P ＜
0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 长梗秦艽酮抑制 H1975 细胞的体外增殖
MTT 实验结果显示，随着药物浓度的加大，长梗秦
艽酮对 H1975 细胞增殖的抑制作用明显增加;而
且随着作用时间的增加，长梗秦艽酮对 H1975 细
胞增殖的抑制也增强(图 1)。这些结果提示我们，
长梗秦艽酮能够抑制 H1975 细胞的增殖，且具有
剂量和时间依赖性。
图 1 长梗秦艽酮对 H1975 细胞增殖的抑制作用
2. 2 长梗秦艽酮诱导 H1975 细胞凋亡 在
H1975 细胞中加入 30 μmol /L 的长梗秦艽酮分别
作用 24 和 48 h后，通过 AnnexinV /PI流式细胞仪
双染法测细胞凋亡的变化。结果表明，与对照组
相比，长梗秦艽酮处理能显著增加 H1975 细胞的
凋亡，且随着作用时间的增加，早期凋亡和晚期凋
亡细胞的比例都有所增加，说明长梗秦艽酮能诱
导肺癌 H1975 细胞的凋亡(图 2)。
2. 3 长梗秦艽酮引起细胞凋亡的形态学变化
H1975 细胞用 30 μmol /L 浓度的长梗秦艽酮溶液
作用后，用 Hoechst 33342 染料对细胞核进行染
色，在荧光显微镜下观察显示，与空白对照相比，
长梗秦艽酮作用于 H1975 细胞 24、48 h后，细胞形
态变化明显。随着药物浓度增大，细胞数量减少，
细胞核形态变化显著，呈现核碎裂、染色质边集等
细胞凋亡改变(图 3)。
2. 4 长梗秦艽酮调节凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax
的表达 H1975细胞用30 μmol /L浓度的长梗秦
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图 2 流式细胞术检测长梗秦艽酮诱导 H1975 细胞凋亡
图 3 荧光显微镜观察长梗秦艽酮引起细胞凋亡的形态学变化
图 4 长梗秦艽酮影响凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 的表达
艽酮溶液作用 48 h 后，提取细胞中的总蛋白进行
Western blot实验。我们筛查了与细胞增殖、凋亡
相关的一系列蛋白表达的变化。结果发现，长梗
秦艽酮能够抑制 Bcl-2 蛋白的表达，同时增加 Bax
蛋白的表达。如图 4 所示，长梗秦艽酮溶液作用
后 Bcl-2 蛋白的表达显著下降而 Bax 蛋白表达显
著上升，提示长梗秦艽酮对 H1975 细胞的凋亡诱导
可能是通过对 Bcl-2与 Bax 蛋白的调节而实现的。
3 讨论
肺癌是严重危害人类生命健康的疾病，其发
病率和死亡率在全球范围内每年仍在上升［4］。到
目前为止，临床上对于肺癌的治疗仍然以手术切
除为主，辅助以放疗、化疗及分子靶向治疗等方
法。但是由于肺癌对放化疗及分子靶向治疗容易
产生耐受和抵抗性［5-6］，在过去的十几年间，肺癌
患者的生存质量和生存率并未得到很大提高。因
此，发现新的治疗肺癌的药物，尤其是对放化疗及
分子靶向治疗产生耐药抵抗的肺癌具有治疗作用
的药物正成为研究的热点。近年来，中药抗肿瘤
的研究受到了广泛的关注［7-10］，有多种具有抗肿瘤
活性的中药被发现，尤其是从中药中提取的天然
单体化合物。从中药中提取的天然单体化合物可
以通过多种机制发挥抗肿瘤作用，其中包括抑制
肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细
胞的侵袭及转移等机制［11-14］。近年来的研究发
现，天然单体化合物在减少肿瘤细胞对放化疗及
分子靶向治疗耐药及抵抗性、增强药物对肿瘤细
胞的敏感性等方面也发挥着重要的作用［15-22］。
本研究选取的药物长梗秦艽酮是从中药长梗
秦艽中提取的五环三萜类天然化合物，具有多种
生物活性。近年来的研究表明，长梗秦艽酮具有
明显的抗肿瘤活性，对肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤
有明显的抑制作用［1-3］。但是，研究并不全面，尤
其是对放化疗及分子靶向治疗耐药肿瘤的作用及
机制尚不明确。本研究通过 MTT、流式细胞仪、荧
光电子显微镜、Western blot 等实验方法研究长梗
秦艽酮对吉西他滨耐药的人肺腺癌细胞系 H1975
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细胞的抑制作用及其机制。MTT 实验结果表明，
长梗秦艽酮对 H1975 细胞具有增殖抑制作用，且
有时间及剂量依赖性。流式细胞仪 AnnexinV /PI
双染法及荧光电子显微镜结果表明，长梗秦艽酮
可以诱导 H1975 细胞凋亡，提示长梗秦艽酮抑制
H1975 细胞的作用可能与诱导细胞凋亡有关。进
一步研究发现，长梗秦艽酮能够调节细胞凋亡相
关蛋白 Bcl-2 和 Bax 的表达，提示长梗秦艽酮可能
通过 Bcl-2 和 Bax 促进肺癌 H1975 细胞凋亡。
综上所述，从中药中提取的天然单体化合物
可以通过多靶点、多通路发挥抗肿瘤作用。本研
究结果可以为长梗秦艽酮在治疗吉西他滨耐药肺
癌方面提供实验依据，但仍需要进一步的动物体
内实验探讨其体内抗肿瘤作用及临床应用前景。
参考文献:
［1］ Zhang Z，Wang S，Qiu H，et al． Waltonitone induces human
hepatocellular carcinoma cells apoptosis in vitro and in vivo
［J］． Cancer Lett，2009，286(2):223-231．
［2］ Zhang Y，Zhou X，Xu X，et al． Waltonitone induces apoptosis
through mir-663-induced Bcl-2 downregulation in non-small
cell lung cancer［J］． Tumour Biol，2015，36(2) :871-876．
［3］ Zhang Y，Zhang GB，Xu Xin，et al． Suppression of growth of
A549 lung cancer cells by waltonitone and its mechanisms of
action［J］． Oncol Ｒep，2012，28(3) :1029-1035．
［4］ Torre LA，Bray F，Siegel ＲL，et al． Global cancer statistics，
2012［J］． CA Cancer J Clin，2015，65(2) :87-108．
［5］ Isozaki H，Ichihara E，Takigawa N，et al． Non-Small Cell Lung
Cancer Cells Acquire Ｒesistance to the ALK Inhibitor Alec-
tinib by Activating Alternative Ｒeceptor Tyrosine Kinases［J］．
Cancer Ｒes，2016，76(6) :1506-1016．
［6］ Lantermann AB，Chen D，Mc Cutcheon K，et al． Inhibition of
Casein Kinase 1 Alpha Prevents Acquired Drug Ｒesistance to
Erlotinib in EGFＲ-Mutant Non-Small Cell Lung Cancer［J］．
Cancer Ｒes，2015，75(22) :4937-4948．
［7］ Liu J，Wang S，Zhang Y，et al． Traditional Chinese medicine
and cancer:History，present situation，and development［J］．
Thorac Cancer，2015，6(5) :561-569．
［8］ Tian H，Qin W，Wu W，et al． Effects of Traditional Chinese
Medicine on Chemotherapy-Induced Myelosuppression and Fe-
brile Neutropenia in Breast Cancer Patients［J］． Evid Based
Complement Alternat Med，2015:736197．
［9］ Zhang L，Tian W，Kim S，et al． Arsenic sulfide，the main com-
ponent of realgar，a traditional Chinese medicine，induces ap-
optosis of gastric cancer cells in vitro and in vivo［J］． Drug
Des Devel Ther，2015，9:79-92．
［10］ Wang W，Xu L，Shen C． Effects of Traditional Chinese Medi-
cine in Treatment of Breast Cancer Patients After Mastectomy:
A Meta-Analysis［J］． Cell Biochem Biophys，2015，71(3) :
1299-1306．
［11］ Wang L，Peng Y，Ski K，et al． Osthole inhibits proliferation of
human breast cancer cells by inducing cell cycle arrest and ap-
optosis［J］． J Biomed Ｒes，2015，29(2) :132-138．
［12］ Fan Z，Duan X，Cai H，et al． Curcumin inhibits the invasion of
lung cancer cells by modulating the PKCα /Nox-2 /ＲOS /ATF-
2 /MMP-9 signaling pathway［J］． Oncol Ｒep，2015，34(2) :
691-698．
［13］ Ji Q，Liu X，Fu X，et al． Ｒesveratrol inhibits invasion and me-
tastasis of colorectal cancer cells via MALAT1 mediated Wnt /
β-catenin signal pathway［J］． PLoS One，2013，8 (11) :
e78700．
［14］ Wang L，Ye X，Cai X，et al． Curcumin suppresses cell growth
and invasion and induces apoptosis by down-regulation of
Skp2 pathway in glioma cells［J］． Oncotarget，2015，20;6
(20) :18027-18037．
［15］ Ma L，Li W，Wang Ｒ，et al． Ｒesveratrol enhanced anticancer
effects of cisplatin on non-small cell lung cancer cell lines by
inducing mitochondrial dysfunction and cell apoptosis［J］． Int
J Oncol，2015，47(4) :1460-1608．
［16］ Marostica LL，Silva IT，Kratz JM，et al． Synergistic Antiprolif-
erative Effects of a New Cucurbitacin B Derivative and Chem-
otherapy Drugs on LungCancer Cell Line A549［J］． Chem Ｒes
Toxicol，2015，28(10) :1949-1960．
［17］ Hu S，Li X，Xu Ｒ，et al． The synergistic effect of resveratrol in
combination with cisplatin on apoptosis via modulating auto-
phagy in A549 cells［J］． Acta Biochim Biophys Sin (Shang-
hai) ，2016，48(6) :528-535．
［18］ Xu XM，Zhang Y，Qu D，et al． Combined anticancer activity of
osthole and cisplatin in NCI-H460 lung cancer cells in vitro
［J］． Exp Ther Med，2013，5(3) :707-710．
［19］ Yar Saglam AS，Alp E，Elmazoglu Z，et al． Treatment with cu-
curbitacin B alone and in combination with gefitinib induces
cell cycle inhibition and apoptosis via EGFＲ and JAK /STAT
pathway in human colorectal cancer cell lines［J］． Hum Exp
Toxicol，2016，35(5) :526-543．
［20］ Lee JY，Lee YM，Chang GC，et al． Curcumin induces EGFＲ
degradation in lung adenocarcinoma and modulates p38 activa-
tion in intestine:the versatile adjuvant for gefitinib therapy
［J］． PLoS One，2011． 6(8) :e23756．
［21］ Zhu Y，He W，Gao X，et al． Ｒesveratrol overcomes gefitinib
resistance by increasing the intracellular gefitinib concentration
and triggering apoptosis，autophagy and senescence in PC9 /G
NSCLC cells［J］． Sci Ｒep，2015，5:17730．
［22］ Wada K，Lee JY，Huang HY，et al． Novel curcumin analogs to
overcome EGFＲ-TKI lung adenocarcinoma drug resistance and
reduce EGFＲ-TKI-induced GI adverse effects［J］． Bioorg Med
Chem，2015，23(7) :1507-1514．
·018· 实用药物与临床 2016 年第 19 卷第 7 期 Practical Pharmacy And Clinical Ｒemedies，2016，Vol． 19，No． 7