全 文 ：HPLC法同时测定椭圆叶花锚中 4个 酮
俞培忠 ,申晓娟 ,孙雨伟 ,胡昌奇＊
(复旦大学药学院 , 上海 200032)
摘要　目的:建立同时测定椭圆叶花锚中 4种主要 酮类成分的 HPLC方法。方法:采用 KromasilC
18
柱(4.6mm×300 mm, 5
μm),流动相为甲醇 -0.01 mol· L-1磷酸氢二钾溶液(pH8.0)(80∶20), 流速 1.0mL· min-1 ,紫外检测波长 269 nm。结果:1
-羟基 -2, 3, 5-三甲氧基 酮 、1-羟基 -2, 3, 4, 5-四甲氧基 酮 、1-羟基 -2, 3, 7-三甲氧基 酮 、1-羟基 -2, 3, 4, 7 -
四甲氧基 酮进样量分别在 0.0148 ～ 1.48 μg(r=0.9999)、0.0296 ～ 2.96 μg(r=0.9998)、 0.0124 ～ 1.24 μg(r=0.9995)、
0.0136 ～ 1.36 μg(r=0.9996)范围内线性关系良好。平均回收率(n=5)分别为 101.0%, 98.9%, 97.9%, 99.5%;RSD分别
为 2.2%, 2.8%, 1.4%, 2.1%。结论:本法简便 、快速 、准确 ,重复性好 , 可作为椭圆叶花锚中的主要 酮类成分的理想检测方
法。
关键词:HPLC;椭圆叶花锚; 酮
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2009)04-0540-04
HPLCsimultaneousdeterminationoffour
xanthonesinHaleniaelipiticaD.Don
YUPei-zhong, SHENXiao-juan, SUNYu-wei, HUChang-qi＊
(SchoolofPharmacy, FudanUniversity, Shanghai200032, China)
Abstract　Objective:TodevelopanHPLCmethodforsimultaneousdeterminationoffourxanthonesinHaleniael-
lipiticaD.Don.Methods:TheanalysiswasperformedonKromasilC18(4.6mm ×300mm, 5 μm)basedoniso-
craticseparation.Themobilephaseconsistedofmethanol-0.01 mol· L-1 dibasicpotassiumphosphatesolution
(pH8.0)(80∶20)ataflowrateof1.0mL·min-1 andthedetectionwavelengthwas269nm.Results:Thelinear
rangesof1-hydroxy-2 , 3, 5-trimethoxyxanthone, and1 -hydroxy-2, 3, 4, 5-tetramethoxyxanthone, 1-hy-
droxy-2, 3, 7-trimethoxyxanthone, 1-hydroxy-2, 3 , 4, 7-tetramethoxyxanthonewere0.0148 -1.48 μg(r=
0.9999), 0.0296-2.96μg(r=0.9998), 0.0124-1.24μg(r=0.9995), and0.0136-1.36μg(r=0.9996)
respectively;Theaveragerecoverieswere101.0%(RSD=2.2%), 98.9%(RSD=2.8%), 97.9%(RSD=
1.4%)and99.5%(RSD=2.1%), respectively.Conclusions:Thismethodissimple, quick, sensitive, reliable
andreproducible.ItisthebestchoiceforthedeterminationofmajorxanthonesinHaleniaelipiticaD.Don.
Keywords:HPLC;HaleniaelipiticaD.Don;xanthone
　　龙胆科花锚属植物在全球约有 80余种 ,其中 ,
椭圆叶花锚(HaleniaelipiticaD.Don)是我国仅有的
2个花锚属植物之一[ 1] 。据 《全国中草药汇编 》记
载 [ 2] ,椭圆叶花锚又名黑及草 ,其性味寒苦 ,功能清
热利湿 ,平肝利胆 ,主治急性黄疸型肝炎 、胆囊炎 、胃
炎等。在藏药中是一味治疗黄疸的药物[ 3] 。临床
及药理研究表明椭圆叶花锚可治疗小儿急性黄疽性
肝炎和保肝 [ 4 ～ 6] 。早期研究认为其有效成分是 酮
苷[ 5, 7] 。而对椭圆叶花锚中的成分在体内吸收和分
布的研究中发现 ,花锚中 酮苷类成分的活性主要
是通过转化为 酮苷元来实现的[ 8] 。花锚属植物
中的 酮主要是含多氧基取代的简单 酮 ,在椭圆
叶花锚中 ,单羟基取代的主要有 4种 ,即:1-羟基 -
2, 3, 5-三甲氧基 酮( 酮 -1)、1-羟基 -2, 3,
4, 5-四甲氧基 酮( 酮 -2)、1-羟基 -2, 3, 7 -
三甲氧基 酮( 酮 -3)和 1-羟基 -2, 3, 4, 7-四
—540— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(4)
＊ 通讯作者　Tel:(021)54237564;E-mail:cqhu@shmu.edu.cn
DOI :10.16155/j.0254-1793.2009.04.013
甲氧基 酮( 酮 -4),在该植物的活性成分中占
了很大的比例 ,实验研究表明 酮具有促胆汁排泄
等作用 [ 9] 。
花锚属植物中 , 酮类化合物的结构非常相似 ,
主要区别在于羟基和甲氧基的数目及取代位置 ,且
苷和苷元的极性差别较大 。所以无论是针对椭圆叶
花锚中 酮苷的定量测定[ 10, 11] ,还是针对 酮苷及
苷元的定性检测 [ 7, 12] ,都采用了梯度洗脱的方式 ,但
对于 酮 -2和 酮 -3而言 ,即使在梯度洗脱方式
下也未能分离 ,仅靠质谱检测器通过分子离子的差
别来加以区别[ 12] ,而梯度洗脱在重现性及分析时间
上都略逊于等度洗脱 。
本文建立了 HPLC等度洗脱方法 ,在 12 min内
实现了对椭圆叶花锚中 4种活性 酮的分离。
1　仪器 、试剂与材料
仪器:高效液相色谱仪(美国 Waters公司 ,配有
510泵 , 481可变波长紫外检测器 ,恒温箱 , Rheodyne
7725I手动进样阀 , N2000色谱工作站), DL180超声
清洗器(浙江石浦海天电子仪器厂), MetlerAE240
电子天平(梅特勒 -托利多仪器上海有限公司)。
试剂:HPLC所用的甲醇为色谱纯(天津四友精
细化学品有限公司),其他均为分析纯 , 水为重蒸
水 。
材料:椭圆叶花锚采自云南大理 ,由云南大理学
院药学院刘光明教授提供 ,并由马晓匡教授鉴定 , 4
种 酮类化合物对照品由椭圆叶花锚中分离得到 ,
其结构经 NMR、MS等光谱鉴定确认 , 纯度 ≥97%
(HPLC)。
2　色谱条件
色谱柱:KromasilC18柱(4.6 mm×300 mm, 5
μm,大连依利特公司);流动相:甲醇 -0.01 mol·
L-1磷酸氢二钾溶液 (用氢氧化钠调节至 pH8.0)
(80∶20);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:269 nm;
柱温:30℃;进样:20 μL。
3　溶液的制备
3.1　对照品储备液　精密称取对照品 酮 -1∶7.4
mg、 酮 -2:14.5 mg、 酮 -3:6.2 mg和 酮 -4:
6.8mg,置于同一 50 mL量瓶中 ,用甲醇溶解并定
容 ,即得。
3.2　供试品溶液　精密称取粉碎过 60目筛的样品
250mg,置于锥形瓶中 ,加入甲醇 40 mL,超声(180
W)提取 45min,以甲醇洗涤滤渣 3次 ,每次 3 mL,
定容至 50mL量瓶中即得。
4　方法学考察
4.1　线性关系考察　准确量取对照品储备液 0.1,
0.2, 0.5, 1.0 , 2.0, 5.0, 10.0 mL分别置于 20 mL量
瓶中 ,以甲醇配成系列浓度溶液 ,分别精密吸取此系
列浓度溶液 20 μL注入高效液相色谱仪进行测定 ,
以峰面积 Y与进样量 X作图得标准曲线 ,数据经回
归分析 ,得 酮 -1、 酮 -2、 酮 -3、 酮 -4的
回归方程分别为:
Y=2.95×106 X+8.88×103　r=0.9999
Y=2.53×106 X+2.38×104　r=0.9998
Y=3.47×106 X+1.74×104　r=0.9995
Y=3.89×106 X+3.83×103　r=0.9996
线性范围分别为 0.0148 ～ 1.48, 0.0296 ～ 2.96,
0.0124 ～ 1.24, 0.0136 ～ 1.36μg。
4.2　精密度试验　按 “ 3.2”项下方法制备供试品
溶液 ,连续进样 5次 ,测定峰面积 ,计算 酮 -1、
酮 -2、 酮 -3及 酮 -4的 RSD值分别为 1.1%,
1.0%, 0.8%, 1.2%。结果表明精密度良好 ,符合含
量测定要求。
4.3　重复性试验　按 “ 3.2”项下方法制备 5份供
试品溶液 ,分别进样 20 μL,测定峰面积 ,计算样品
中 酮 -1、 酮 -2、 酮 -3、 酮 -4含量平均值
(n=5)分别为 0.37%, 0.79%, 0.27%, 0.20%;
RSD值分别为 1.7%, 1.6%, 2.3%, 2.0%。表明用
此方法测定这 4个 酮化合物的含量 ,重复性良好。
4.4　稳定性试验　按 “ 3.2”项下方法制备供试品
溶液 ,同一供试品溶液于 0, 1, 3 , 6, 12 h进样 ,测定
峰面积 ,计算 酮 -1、 酮 -2、 酮 -3、 酮 -4
的 RSD值分别为 1.5%, 1.6%, 2.6%, 1.8%。结果
表明供试品溶液中 酮化合物在 12 h内基本稳定。
4.5　加样回收试验　精密称取 5份已测知含量(
酮 -1:0.37%, 酮 -2:0.79%, 酮 -3:0.27%,
酮 -4:0.20%)的同一批椭圆叶花锚各 125 mg,
添加各对照品适量( 酮 -1:0.59 mg· mL-1溶液
0.5 mL, 酮 -2:1.34 mg·mL-1溶液 0.5 mL, 酮
-3:0.47 mg·mL-1溶液 0.5mL, 酮 -4:0.54 mg
·mL-1溶液 0.5 mL),按 “3.2”项下方法制备供试
溶液 ,进样测定 ,计算回收率 。 酮 -1、 酮 -2、
酮 -3及 酮 -4的平均回收率 (n=5)分别为
101.0%, 98.9%, 97.9%, 99.5%;RSD分别 为
2.2%, 2.8%, 1.4%, 2.1%。
4.6　最低检测限和定量限　定义信噪比 (S/N)为
3∶1时的浓度为最低检测限 , S/N为 10∶1时的浓度
为定量限 。 酮 -1、 酮 -2、 酮 -3及 酮 -4
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的最低检测限分别为 0.12, 0.22, 0.11 , 0.14 μg·
mL-1;定量限分别为 0.37, 0.73, 0.31 , 0.34 μg·
mL-1。
4.7　样品测定　按 “3.2”项下方法制备供试品溶
液 3份 ,进样测定 ,测得样品中 酮 -1、 酮 -2、
酮 -3及 酮 -4的峰面积 ,由对应的线性方程 ,计
算它 们 含量 分 别 为 0.38%, 0.82%, 0.28%,
0.21%。对照品及样品图谱见图 1。
图 1　4种对照品(A)及椭圆叶花锚样品(B)HPLC色谱图
Fig1　HPLCchromatogramsof4referencesubstances(A)andHalenia
elipiticasample(B)
1.1-羟基-2, 3, 5-三甲氧基 酮(1-hydroxy-2, 3, 5-trime-
thoxyxanthone)　2.1-羟基 -2, 3, 4, 5-四甲氧基 酮(1-hydroxy
-2, 3, 4, 5-tetramethoxyxanthone)　3.1-羟基 -2, 3, 7-三甲氧基
酮(1-hydroxy-2, 3, 7-trimethoxyxanthone)　 4.1-羟基 -2, 3,
4, 7-四甲氧基 酮(1-hydroxy-2, 3, 4, 7-tetramethoxyxanthone)
5　讨论
5.1　检测波长的选择　应用岛津 UV-260型紫外
分光光度计在 200 ～ 600 nm范围内对 酮 -1、 酮
-2、 酮 -3 , 酮 -4进行扫描 ,它们分别在 269,
275, 262, 269nm处有最大吸收 ,故选择检测波长为
269nm。
5.2　流动相的选择　有关 酮 -2和 酮 -3的
HPLC分离只有 1篇报道 [ 12] ,采用乙腈 -水梯度洗
脱 ,但这 2个化合物并未达到分离。考虑到这类化
合物含酚羟基 ,所以作者尝试过调节流动相的 pH
来实现分离 。用甲醇 -0.01 mol· L-1磷酸氢二钾
溶液(80∶20)为流动相 ,发现不同 pH对 4种 酮类
化合物的保留时间影响非常大(图 2)。虽然保留时
间总体都随着 pH增大而减小 ,但改变的程度是有
差异的 ,其中 酮 -2和 酮 -4的敏感程度相对更
大 。当 pH<7.5时 , 酮 -2与 酮 -3难以分离;
而 pH>8.5时 , 酮 -3与 酮 -4又发生重叠 ,只
有在 pH8.0附近的一个很窄的范围内 ,这 4种 酮
类化合物方能达到理想的分离。
图 2　缓冲液 pH变化对保留的影响
Fig2　EfectofchangeinbuferpHonretention
1-4.同图 1(sameasFig1)
5.3　提取方法的考察　提取溶剂考察了甲醇和无
水乙醇 ,二者对 4种 酮类化合物的提取无明显差
异 ,无水乙醇提取物中杂质较多 ,分离度较差 。另外
考察了超声提取和回流提取 ,结果表明 , 2种方法无
明显差异 。用超声波分别提取 15, 30, 45, 60 min,结
果 45 min可将 4种有效成分提取完全 。
参考文献
1 BAOBao-quan(包保全), SUNQi-shi(孙启时), BAOBa-gen
-na(包巴根那).AdvanceinthestudyofHaleniaplants:chemical
constituentsandbiologicalactivities(花锚属植物化学成分及生物
活性研究进展).JChinMedMater(中药材), 2003, 26(5):382
2 EditorialOficeofNationalChineseHerbalMedicine(全国中草药
汇编编写组).ColectionofNationalChineseHerbalMedicine(全
国中草药汇编).SectionA(上册).Beijing(北京):PeoplesMed-
icalPublishingHouse(人民卫生出版社), 1973.854
3 QinghaiProvincialInstituteforDrugControl(青海省药品检验
所), TheTibetanMedicineofChina(中国藏药).FirstSupplement
(第一卷), Shanghai(上海):ShanghaiScienceandTechnology
Publishers(上海科学技术出版社), 1996.126
4 CHENDa-xun(陈大勋), LIRui-feng(李瑞峰), MAZheng(马
正), etal.Observationofcurativeefectonchildacuteicterohepa-
titistreatedbyHaleniaelipitic(花锚治疗小儿急性黄疽性肝炎的
疗效观察).ChinTraditHerbDrugs(中草药), 1984, 15(11):29
5 ZHANGJing-ming(张经明), BAOWen-lian(鲍文莲), GAO
Hai-ping(高海平), etal.Studyofanti-hepaticinjuryandtoxici-
tybyHaleniaellipticaandxanthoneglycosides(花锚及其 酮甙抗
肝损伤和毒性的研究).ChinTraditHerbDrugs(中草药), 1984,
15(10):34
6 JINLan(金兰), GEYue-bin(葛月宾), LUOGui-hua(罗桂
花), etal.Protectiveefectsofethanol-extractofHaleniaeliptica
onchemicalhepaticinjuryinmice(椭叶花锚醇提物对化学性肝
损伤小鼠的保护作用).TraditChinDrugResClinPharmacol(中
药新药与临床药理), 2007, 18(5):345
7 SUNHong-fa(孙洪发), HUBo-lin(胡伯林), DINGJing-ye
—542— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(4)
(丁经业).ThreenewglycosidesfromHaleniaelipita(花锚的三个
新 酮).ActaBotSin(植物学报), 1987, 29(4):422
8 GAOJie(高洁), WANGSu-juan(王素娟), XURui-ming(徐
瑞明), etal.StudiesonchemicalconstituentsofHaleniaeliptica
guidedbyinvivoabsorptionanddistributionoftheconstituents(以
体内吸收分布特点指导花锚成分的研究).ActaPharmSin(药
学学报), 2004, 39(3):198
9 MikhailovaTM, ShultsEE, KomarovaNI, etal.Xanthonesfrom
Haleniacorniculata.synthesisandcholagogicactionofcentainde-
rivatives.ChemNatCompd, 2004, 40(5):451
10　JILan-ju(纪兰菊), DINGChen-xu(丁晨旭), CHENGui-
chen(陈桂琛), etal.Determinationofhaleniasideanddemethoxy-
haleniasideinwildandcultivatedHaleniaelipiticaD.Donbyre-
versed-phasehighperformanceliquidchromatography(反相高效
液相色谱法测定野生与栽培花锚药材及其制剂中的花锚甙和
去甲氧基花锚甙).ChinJChromatogr(色谱), 2004, 22(1):38
11　JILan-ju(纪兰菊), JIWen-he(吉文鹤), CHENGui-chen
(陈桂琛), etal.Determinationcompoundsofantihepatitis-halen-
iasideinTibetherbofHaleniaelipiticaD.Don(藏药椭圆叶花锚
中抗肝炎有效成分的含量测定).JWuhanBotRes(武汉植物学
研究), 2004, 22(5):473
12　RodriguezS, WolfenderJL, OdontuyaG, etal.Xanthones, secoiri-
doidsandflavonoidsfrom Haleniacorniculata.Phytochemistry,
1995, 40(4):1265
(本文于 2008年 10月 20日修改回)
—543—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(4)