全 文 ：留兰香总黄酮提取工艺研究
罗强，龙晓英，刘昌顺，郑玉蓉，卢耀文
(广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006)
摘要:目的 优化留兰香(Mentha spicata L．)总黄酮的提取工艺。方法 以留兰香总黄酮得率为指标，采用
单因素试验和 L9(3
4)正交试验设计，研究乙醇体积分数、固液比、提取时间 3个因素对总黄酮得率的影
响;在此基础上，通过改变温度进一步研究静态提取和动态提取对留兰香总黄酮得率的影响。结果 留
兰香总黄酮最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数 50%，提取温度(动态提取)90 ℃，料液比 1 ∶12(首次提
取需多加入 2倍溶媒)，提取 2次，每次提取 1．5 h，总黄酮得率为 6．50%。结论 该提取工艺经济、稳定、
可行，为留兰香进一步开发利用提供了依据。
关键词:留兰香;总黄酮;正交试验;提取工艺
中图分类号:Ｒ284．3 文献标志码:A 文章编号:1006-8783(2016)02-0149-04
DOI:10．16809 / j．cnki．1006-8783．2015121401
收稿日期:2015-12-14
基金项目:国家自然科学基金项目(81573353)
作者简介:罗强(1988—)，男，2013级硕士研究生，Email:jackrock2011@ 126．com;通信作者:龙晓英(1960—)，女，博士，教授，
硕士生导师，主要从事药物新剂型与新技术研究，电话:020-39352168，Email:longxy3156@ 163．com。
网络出版时间:2016-03-31 14:55 网络出版地址:http:/ /www．cnki．net /kcms /detail /44．1413．Ｒ．20160331．1455．001．html
Study on the extraction process of total flavonoids from Mentha spicata L．
LUO Qiang，LONG Xiaoying，LIU Changshun，ZHENG Yurong，LU Yaowen
(School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective To study the extraction process of total flavonoids from Mentha spicata L． Methods
With the yield of total flavonoids as the evaluation index，the orthogonal design was used to optimize the
extraction process of total flavonoids with three factors which were ethanol concentration，solvent volume，
and the extraction time． On the Basis of optimal conditions，the effects of the static and dynamic extraction
caused by temperature on extraction of total flavonoids from Mentha spicata L． were investigated． Ｒesults
The optimum process parameters were as follows:ethanol concentration of 50%，temperature of 90 ℃，solid-
liquid ratio of 1 ∶12(adding two-fold ratio of solid to liquid)，extraction times of 2 times and 1．5 h each
time． The content of total flavonoids in Mentha spicata L． was 6．50%． Conclusion The optimum extraction
process is economical，stable and feasible which can provide reference for the development of Mentha
spicata L．
Key words:Mentha spicata L．;total flavonoids;orthogonal design;extraction process
留兰香别名绿薄荷、香花菜，为唇形科植物留兰
香 Mentha spicata L．的全草［1］。本品辛、甘，微温，具
有解表、和中、理气功效，民间常用于治疗伤风感冒、
头痛、咽痛、胃肠胀气、风寒咳嗽等疾病［2］。现代研
究表明，留兰香具有抗感染、止痛、抗溃疡、抗菌、抗
病毒的功效［3］。留兰香主要含挥发油、有机酸、木脂
素类、萜类、黄酮等成分［4］。目前，国内外关于留兰香
的精油提取研究方面报道较多［5-8］，而留兰香中黄酮
类成分的提取工艺研究报道较少［9］。本文采用加热
浸提方法，在单因素试验的基础上，以总黄酮得率为
指标，利用正交试验设计优化醇提留兰香总黄酮的工
艺条件，为留兰香黄酮的后续研究开发奠定基础。
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Apr． 2016，32(2)
1 材料与仪器
1．1 原材料及处理
留兰香全草采自广东药科大学药用植物园，经
广东药科大学中药学院刘基柱副教授鉴定为唇形科
植物留兰香 Mentha spicata L．的全草。将留兰香用
自来水冲洗泥沙，再用去离子水洗干净，放至阴凉通
风处晾干备用。
1．2 试剂
芦丁(按 C27 H30 O16计，HPLC 法测定质量分数
为 91． 9%，UV 法测定质量分数为 92． 6%，批号:
100080-201409)由中国食品药品检定研究院提供。
95%药用乙醇(食品级)、95%乙醇(分析纯)由天津
彩云飞化工有限公司生产;NaNO、Al(NO3)3(分析
纯，天津市大茂化学试剂厂);NaOH(分析纯，天津
市福晨化学试剂厂);蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料
有限公司)。
1．3 仪器
HH-2数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限
公司);ＲE-2000B 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器
厂);DLSB-5L /10 低温冷却液循环泵(巩义市予华
仪器有限责任公司);UV-6100S 双光束紫外可见分
光光度计(上海美谱达仪器有限公司);BSA224S 赛
多利斯万分之一电子天平(德国赛多利斯北京有限
公司)。
2 方法
2．1 总黄酮的测定［10］
2．1．1 标准曲线的制备 精密称取芦丁对照品
10. 81 mg，置 50 mL棕色容量瓶中，加 50%(体积分
数，下同)乙醇溶液适量，超声处理使溶解，放冷，用
50%乙醇溶液定容，摇匀，即得。
精密吸取上述对照品溶液 0． 0、1． 0、2． 0、3． 0、
4．0、5．0、6．0 mL，分别置 25 mL 刻度试管中，加 50%
乙醇溶液至 6 mL，加入质量分数 5%亚硝酸钠溶液
1 mL，摇匀，放置 6 min，加质量分数 10%Al(NO3)3
溶液 1 mL，摇匀放置 6 min，加 NaOH试液 10 mL，摇
匀，再加 50%乙醇溶液至刻度，摇匀，放置 15 min，以
0．0 mL对照品溶液制得的溶剂为空白，用 1 cm比色
皿，在 200～800 nm 扫描，最大吸收波长为 500 nm。
在 500 nm下分别测定不同质量浓度的芦丁对照品
溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品质量浓度
为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程 y = 13．291x－
0．011 5(r = 0．999 8)，表明在 8．008 ～ 48．05 μg /mL
范围内质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。
2．1．2 样品的测定 精密吸取提取液 2 mL，用 50%
乙醇溶液定容至 10 mL 棕色容量瓶中，作为供试品
溶液。精密吸取 2 mL供试品溶液，置 25 mL刻度试
管，用 50%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，作为参比溶
液［11］;另精密吸取 2 mL 供试品溶液，按“2．1．1”项
下方法显色，自“加 50%乙醇溶液至 6 mL”起，依法
测定吸光度，从标准曲线上读出总黄酮质量浓度，计
算留兰香总黄酮得率。
2．2 药材吸液率考察
称取留兰香药材粉末(过 40 目筛)25 g 置于
300 mL烧杯中，平行 3份，分别加 10 倍量的 50%乙
醇溶液浸泡，用封口膜密封，室温放置，直至药材全
部浸透，时间为 2 h，用纱布过滤药材，沥干纱布，称
量药材湿重，计算药材吸液率，结果 3次测得的吸液
率分别为 188%、193%和 184%，平均为 188%，约为
2倍吸液量，说明首次提取时溶剂用量应多加 2倍。
2．3 留兰香总黄酮的提取
将干燥的留兰香全草粉碎，过 40 目筛，称取留
兰香粉末 20 g，置 500 mL 圆底烧瓶中，在不同条件
下水浴提取，每次提取液趁热过滤，合并滤液，量取
滤液体积，按总黄酮测定方法测定提取液中总黄酮
的浓度，计算总黄酮得率。
2．4 单因素试验
2．4．1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 固定
提取次数 2次(第 1次提取时，按药材吸液率补足溶
媒)，浸提温度 75 ℃，每次提取时间 1．0 h 的条件
下，按照固液比为 1 ∶10(g ∶mL)分别用 10%、30%、
50%、70%、90%乙醇溶液筛选合适的乙醇体积分数
范围。结果测得 10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶
液的总黄酮得率分别为 4． 62%、5． 45%、5． 75%、
4．96%和 2．53%。
可见，在其他因素不变的情况下，乙醇体积分数
在 10%～50%时，留兰香总黄酮得率随体积分数升
高而增加，当乙醇体积分数为 50%时，留兰香总黄
酮的提取率达到最高，之后提取率随着乙醇体积分
数的增加逐渐下降。因此确定用 30%、50%、70%的
乙醇进行正交试验。
2．4．2 固液比对总黄酮得率的影响 设定提取次
数 2次，每次提取时间为 1．0 h，浸提温度 75 ℃的条
件下，按照固液比(g ∶ mL，下同)分别为1 ∶ 6、1 ∶ 8、
1 ∶10、1 ∶12、1 ∶14加入50%乙醇溶液筛选合适的溶剂
用量范围。结果测得固液比为1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、
1 ∶14的总黄酮得率分别为5． 20%、5． 51%、5． 26%、
051 广东药学院学报 第 32卷
5．92%和5．98%。可见，随着提取溶剂用量的增加，总
黄酮得率逐渐提高，固液比达到1 ∶10之后，继续增大
溶剂用量，总黄酮得率趋于稳定，说明一定比例的溶
剂即可将黄酮类成分溶出充分，达到平衡后，再增加
溶剂用量，得率变化不明显，因此固液比1 ∶10是一个
平衡点。为了节约提取成本以及降低浓缩负荷，结合
浸提效果，溶剂用量不宜过大，选择固液比1 ∶ 8、
1 ∶10、1 ∶12进行正交试验。
2．4．3 提取时间对总黄酮得率的影响 设定提取
次数2次，按照固液比为1 ∶10 加入 50%乙醇溶液，浸
提温度 75 ℃的条件下，改变提取时间分别为 0．5、
1．0、1．5、2．0、2．5 h，筛选合适的提取时间范围。结果
测得提取时间为 0．5、1．0、1．5、2．0、2．5 h 的总黄酮得
率分别是 5．56%、5．75%、5．80%、5． 91%和 5． 93%。
可见，随着提取时间的延长，总黄酮的提取率增加，
大于 1．5 h 之后，总黄酮得率随时间变化的趋势趋
于平缓，这可能是留兰香药材细胞内外的总黄酮浓
度差已达平衡状态。为了缩短生产周期，选择提取
时间为 1．0、1．5、2．0 h进行正交试验。
2．4．4 提取次数对总黄酮得率的影响 固定浸提
温度 75 ℃，每次提取时间 1．0 h、按照固液比为 1 ∶10
加入 50%乙醇溶液的条件下，分别提取 1、2、3次，筛
选合适的提取次数。结果测得提取次数为 1、2、3 次
的总黄酮得率分别为 4． 98%、5． 77%和6．09%。可
见，随着提取次数的增加，总黄酮得率也在增加，提
取 2次的总黄酮得率比浸提 1 次的明显提高，提取
3次的总黄酮得率增加缓慢。浸提次数越多，从留
兰香药材中得到总黄酮质量分数越高，生产成本
(溶剂用量、能源消耗、劳动力投入)也增加。综合
考虑，正交试验设计中提取次数固定为 2次。
2．5 工艺优化试验
为了进一步研究各因素影响的显著性和得到最
佳的提取工艺参数，结合上述单因素试验结果，以乙
醇体积分数(A)、固液比(B)、提取时间(C)为考察
对象，采用 L9(3
4)正交表优选醇提留兰香总黄酮最
佳提取工艺条件。每个试验方案重复 2次。
2．6 静态提取和动态提取对黄酮得率的影响
在正交设计优化的工艺参数基础上，通过改变
温度(75、80、85、90 ℃)研究静态浸提和动态浸提对
黄酮得率的影响。
2．7 数据处理
试验结果用 SPSS 20．0 软件进行单因素方差分
析和 Duncan［12］多重比较，P＜0．05 表示差异有统计
学意义。
3 结果与分析
3．1 正交设计试验结果
正交试验的因素水平与试验结果见表 1，方差
分析结果见表 2。
表 1 留兰香总黄酮提取工艺 L9(3
4)正交试验结果
Table 1 The results of the extraction process of total flavonoids
from Mentha spicata L． by orthogonal design
试验
号
因素
A
乙醇体积
分数 /%
B
固液比 /
(g ∶mL)
C
提取
时间 /h
D
空白
总黄酮得率 /%
1 2
1 1(30) 1(1 ∶8) 1(1．0) 1 5．43 5．49
2 1 2(1 ∶10) 2(1．5) 2 5．76 5．69
3 1 3(1 ∶12) 3(2．0) 3 5．76 5．78
4 2(50) 1 2 3 5．87 5．73
5 2 2 3 1 5．96 5．89
6 2 3 1 2 5．85 5．78
7 3(70) 1 3 2 5．07 5．10
8 3 2 1 3 4．98 4．96
9 3 3 2 1 5．26 5．46
表 2 方差分析表
Table 2 The table of variance analysis
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
A 1．607 2 0．803 163．798 0．000
B 0．120 2 0．060 12．263 0．002
C 0．157 2 0．079 16．015 0．001
误差 0．054 11 0．005
总和 1．938 17
由表 2 可见，FA = 163． 798，FB = 12． 263，FC =
16. 015，因素 A、B、C的 P值均＜0．01(PA = 0．000，PB
= 0．002，PC = 0．001)，表明乙醇体积分数、固液比、提
取时间对留兰香总黄酮的提取率的影响均有统计学
意义，影响的大小顺序为 A(乙醇体积分数)＞C(提
取时间)＞B(固液比)。Duncan 多重比较结果显示，
因素 A的第 2水平最好，因素 B的第 3水平最好，因
素 C的第 2水平最好。因此，最终确定工艺条件为
A2B3C2，即乙醇体积分数为 50%，料液比 1 ∶12，提取
时间为 1．5 h。
3．2 最佳工艺参数验证试验
称取 3 份留兰香药材粉末(过 40 目筛)，按照
上述确定的最佳工艺参数进行验证试验，测得总黄
酮得率分别为 6．02%、5．99%和 5．98%，平均得率为
151第 2期 罗强，等．留兰香总黄酮提取工艺研究
6．00%，ＲSD为 0．35%。结果表明该工艺条件的总
黄酮得率较高且稳定合理。
3．3 静态提取和动态提取对黄酮得率的影响
在上述确定的最佳工艺条件下，改变温度(75、
80、85、90 ℃)考察静态提取和动态提取对留兰香总
黄酮得率的影响。结果测得总黄酮得率分别为
5．95%、6．07%、6．29%、6．49%，表明总黄酮得率随着
浸提温度升高而增加，说明动态提取效果较好。这
是由于随着温度的升高，药材在提取过程中由静态
(75 ℃)逐渐转变为完全沸腾状态(90 ℃)，可使溶
剂与药材表面充分接触，利于浸出成分的扩散。为
了验证动态提取效果，另取 3份留兰香药材粉末，结
合正交设计确定的最佳条件(50%乙醇、固液比
1 ∶10、提取时间 1．5 h)进行验证试验，测得总黄酮提
取率分别为 6． 48%、6． 49%和 6． 52%，平均得率为
6．50%，ＲSD为 0．32%。
4 讨论
100%乙醇溶液的沸点是 78 ℃左右，不同体积
分数的乙醇溶液沸点在 78 ～ 100 ℃之间［13］。因此，
采用不同体积分数的乙醇溶液进行提取时，药材的
状态不同(静态或动态)提取效率也不同。因此，单
因素试验中采用固定温度(75 ℃)，保证不同体积分
数的乙醇溶液均处于非沸腾状态(静态)。同样原
因，在正交设计试验中，也采用 75 ℃温浸提取。通
过单因素及正交设计确定最佳提取工艺条件下，再
将温度对药材在提取过程中的状态(动态或静态)
进行考察。结果表明，动态提取(完全沸腾状态，
90 ℃)下的黄酮得率比静态提取(完全静止状态，
75 ℃)高。
目前，留兰香中黄酮类成分的提取工艺研究报
道不多，客绍英等［9］报道采用超声技术辅助提取留
兰香全草中的总黄酮，在最优的工艺条件下总黄酮
得率可达 9．51%，Bimakr等［14］报道采用超临界萃取
留兰香叶子中的总黄酮，在最优的工艺条件下总黄
酮得率为 6．79%。本文采用加热回流提取留兰香全
草，在优化的工艺条件下总黄酮得率为 6．50%。总
黄酮得率不一致，除了与提取方法不一样有关外，还
与种植产地、采收时间、栽培技术、提取部位的不同
相关［15］。目前，超声辅助浸提仍处于研究开发阶
段［13］，还没有用于大生产，CO2 超临界萃取对设备
要求高［16］。回流提取仍是目前大部分生产企业所
采用的方法，因此本文对留兰香总黄酮的提取具有
一定的参考价值。
参考文献:
［1］吕世明，谭艾娟．留兰香的抗炎作用研究［J］．中兽医医
药杂志，2001，20(5):3-4．
［2］天宇．青草药速认图集［M］．福州:福建科学技术出版社，
2011:15．
［3］宋妍．留兰香水溶性部分化学成分的研究［D］．沈阳:沈
阳药科大学，2008．
［4］韩卫丽．留兰香提取物抗菌抗病毒作用研究［D］． 郑州:
河南农业大学，2010．
［5］ANSAＲI K，GOODAＲZNIA I． Optimization of supercritical
carbon dioxide extraction of essential oil from spearmint
(Mentha spicata L．)leaves by using taguchi methodology
［J］． J Supercrit Fluids，2012，67:123-130．
［6］鞠玉栋，杨敏，李珊珊，等．芳香植物药用保健功能及其
开发利用［J］．现代农业科技，2015，37(1):125-127．
［7］ALMEIDA P P，MEZZOMO N，FEＲＲEIＲA S Ｒ． Extraction
of Mentha spicata L． volatile compounds:evaluation of
process parameters and extract composition［J］． Food
Bioprocess Technol，2012，5(2) :548-559．
［8］曹丽君，马作东．留兰香精油提取方法研究［J］．唐山师
范学院学报，2010，32(5):56-58．
［9］客绍英，刘冬莲，马作东，等．超声波辅助提取留兰香中
总黄酮的研究［J］．中药材，2009，32(8):1288-1290．
［10］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2015年版一部
［M］．北京:中国医药科技出版社，2015．
［11］郑杭生，李计萍，韩炜，等．紫外-可见分光光度法测定总
黄酮含量的方法学考察要点［J］．中成药，2008，30(9):
1364-1365．
［12］杜双奎．食品试验优化设计［M］．北京:中国轻工业出版
社，2011:263-266．
［13］曹光明．中药浸提物生产工艺学［M］．北京:化学工业出
版社，2009:56．
［14］ BIMAKＲ M，ＲAHMAN Ｒ A，GANJLOO A，et al．
Optimization of supercritical carbon dioxide extraction of
bioactive flavonoid compounds from spearmint (Mentha
spicata L．)leaves by using response surface methodology
［J］． Food Bioprocess Technol，2012，5(3):912-920．
［15］杜晔．探析影响中药质量的因素［J］．中国实用医药，
2011，6(24):227-228．
［16］朱德艳．葛根黄酮不同提取方法比较［J］．江苏农业科
学，2015，43(5):265-267．
(责任编辑:陈翔)
251 广东药学院学报 第 32卷