全 文 ：荔枝草提取物对大鼠肝线粒体损伤的保护作用
师梅梅， 杨建雄* ， 任 维
(陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710062)
收稿日期:2010-12-14
基金项目:国家自然科学基金项目资助(20575039)
作者简介:师梅梅(1982—) ，女，博士生，主要从事中药药理研究。Tel:15094081076，E-mail:shimeimei1982@ 163． com
* 通信作者:杨建雄(1854—) ，男，教授，主要从事天然产物的分离及功能评价研究。E-mail:jxyang@ snnu． edu． cn
摘要:目的 研究荔枝草提取物(SE)对大鼠肝线粒体损伤的保护作用。方法 采用差速离心法制备大鼠肝线粒体，利
用 Fe2 + -Vc系统产生·OH，诱导大鼠肝线粒体损伤，通过检测 SE对肝线粒体脂质过氧化水平、肿胀程度、蛋白质羰基水
平、ATP酶的活性以及生成超氧阴离子的多少来评价其对大鼠肝线粒体损伤的保护作用。结果 SE可以有效地抑制线
粒体损伤时的脂质过氧化反应和线粒体膨胀，降低蛋白质羰基的量，恢复 ATP酶的活性，清除线粒体中产生的 O2 －·，并
且呈现良好的量效关系。结论 荔枝草提取物对大鼠肝线粒体损伤有较好的保护作用。
关键词:荔枝草提取物;线粒体;抗氧化
中图分类号:R962 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2011)10-1673-04
Protective effect of extract from Salvia plebeia R． Br． on damage to rat liver mi-
tochondria
SHI Mei-mei， YANG Jian-xiong* ， REN Wei
(College of Life Science，Shaanxi Normal University，X i’an 710062，China)
ABSTRACT:AIM To evaluate protective effect of Salvia plebeia extract (SE)on mitochondrial injury in rats．
METHODS Malondialdehyde (MDA) ，mitochondrial swelling，ATPase activity and protein carbonyl content
along with superoxide anion generation were measured to investigate the effects of SE on damaged rat liver mitochon-
dria induced by Fe2 + -Vc． RESULT SE showed to inhibit the rat liver mitochondrial swelling and the oxidation of
thiol groups． It also protects mitochondria membranes by scavenging superoxide anions and scavenging lipid free
radicals as well as maintaining ATPase (one of membrane-bound enzymes)activity obviously． CONCLUSION
SE shows remarkable effect on damaged to rat liver mitochondria．
KEY WORDS:extract from Salvia plebeia R． Br．;mitochondria;antioxidant activity
荔枝草为唇形科鼠尾草属植物雪见草 Salvia
plebeia R． Br．的全草，二年生直立草本，性平，味辛，
无毒，在我国和印度分布非常广泛。国内外研究表
明，荔枝草的化学成分主要是黄酮类、二萜类和木酚
素类化合物［1-2］，具有止咳平喘、祛痰及抗组胺、抑菌
及抗氧化作用［3-4］。但对其在保护线粒体方面的作
用尚未见报道，本实验用多种方法研究荔枝草提取
物对大鼠肝线粒体损伤的保护作用，为探索荔枝草
药理作用的机制提供理论依据。
1 材料和方法
1． 1 动物与材料 SD 大鼠，雄性，体质量(200 ±
2)g，由陕西省中医研究院实验动物中心提供，实验
动物生产许可证号:陕医动字 008-01 /025。2，4-二
硝基苯肼(DNPH)、抗坏血酸(Vc)、没食子酸、芦
丁、福林酚试剂、水饱和酚，购自美国 Sigma 公司。
其余试剂均为国产分析纯。荔枝草全草购买于安徽
省中药材市场，经鉴定为 Salvia plebeia R． Br．，保存
在 4 °C冰箱内备用。
1． 2 荔枝草提取物的制备 准确称取已干燥的荔
枝草全草 50 g，加 10 倍量体积 70%的乙醇 80 ～ 82
°C回流提取 1． 0 h，重复 3 次，合并所得提取液，
60 °C旋转蒸发，然后依次用等体积的石油醚和乙
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酸乙酯萃取 4 次，弃醚相，将所得到的水相(SE1)和
乙酸乙酯相(SE2)部分经减压浓缩后置于 60 °C 烘
箱烘干至恒质量。
1． 3 荔枝草提取物中有关成分的分析 以芦丁为
标准品，采用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色体系吸
光光度法测定总黄酮;以没食子酸为标准品，采用福
林试剂法测定总酚;以葡萄糖为标准品，采用苯酚-
硫酸法测定多糖。
1． 4 大鼠肝线粒体的制备 参照文献［5］方法进
行，以牛血清白蛋白为标准品，通过 Lowry 法来测量
线粒体悬浮液中蛋白质。
1． 5 线粒体损伤模型的建立 在本实验中，主要采
取 Fe2 + -Vc体系［6］和 Fe2 + -H2O2 体系
［7］产生·OH，
·OH可以使线粒体膜结构蛋白质和脂质过氧化，
损害线粒体膜的通透性，造成 ATP合成功能障碍。
1． 6 对肝线粒体脂质过氧化的影响 根据文献
［8］稍作修改，1． 0 mL 的肝线粒体悬浮液(蛋白含
有量为 0． 50 mg /mL)中加入 1． 0 mL 不同质量浓度
的 SE溶液(0． 05，0． 10，0． 20，0． 30，0． 40，0． 50
mg /mL) ，混匀后加入 6 mmol /L 的硫酸亚铁溶液
100 μL和 60 mmol /L的过氧化氢溶液 40 μL，37 °C
孵育1． 0 h，然后加入 15%(w /v)的 TCA 溶液 1． 0
mL，摇匀后加入 0． 67%(w /v)的 TBA 溶液 1． 0 mL，
摇匀，沸水浴中 15 min，冷却后 3 000 r /min 离心 10
min，取上清液测 A532 nm，空白不加 TBA，对照不加
样。
1． 7 对肝线粒体肿胀度的影响 3． 0 mL 的肝线
粒体悬浮液(蛋白质含有量为 1． 0 mg /mL)中加入
0． 40 mL不同浓度的 SE 溶液(0． 05，0． 10，0． 20
mg /mL)混匀后，再加入 0． 50 mmol /L的硫酸亚铁溶
液 0． 40 mL和 0． 50 mmol /L 的 Vc 溶液 0． 40 mL 激
发反应，测定不同时间的 A520 nm
［9］。
1． 8 对肝线粒体中蛋白质羰基水平的影响 参照
文献［6］的方法稍作修改，1． 5 mL 的肝线粒体悬浮
液(蛋白含有量为 0． 70 mg /mL)中加入 1． 0 mL 不
同浓度的 SE溶液，摇匀，依次加入 0． 50 mmol /L 的
FeSO4 溶液 0． 20 mL 和 0． 50 mmol /L 的 Vc 溶液
0． 20 mL，混匀后加入 10 mmol /L 的 DNPH 溶液(溶
于 2． 0 mol /L 的盐酸中)0． 20 mL，置于黑暗中反应
1． 0 h，每 15 min涡旋 1 次。反应完毕后，加入 20%
的 TCA 0． 20 mL，冰浴 10 min来沉淀蛋白质腙衍生
物，4． 0 ℃下 12 000 r /min离心 10 min，弃上清，所得
到的沉淀用 1． 5 mL 乙醇和乙酸乙酯混合物(体积
比为 3 ∶ 1)洗涤 3 次，最后的沉淀溶于 3%的 SDS溶
液(溶于 pH6． 8 的磷酸钠缓冲液)中，在 37 °C 孵育
15 min后测 A370 nm。空白对照不加 DNPH 溶液，用
等体积的盐酸代替。羰基浓度用摩尔消光系数 ε
= 22 000 L /(mol·cm)来计算。含羰基量用每 1
mg蛋白中含有多少 nmol的羰基来表示。
1． 9 对线粒体中 ATP酶活性的影响 线粒体损伤
用上述的 Fe2 + -Vc来诱导，ATP 酶的活性用每毫克
蛋白质每小时中新生成的无机磷的量(μmol)来表
示［10］。
1． 10 对线粒体中 O2 －·生成的影响 根据文献
［11］稍作修改，0． 20 mL 的肝线粒体悬浮液(蛋白
含有量约为 0． 50 mg /mL)中加入 1． 0 mL 不同浓度
的 SE 溶液，混匀后加入混合溶液(100 μmol /L
NBT，0． 25 mol /L 蔗糖，10 mmol /L Tris – HCl (pH
7． 4)和 2． 0 mmol /L 磷酸钾)2． 6 mL，室温下孵育
1． 0 h，然后加入 5． 0 mmol /L 的琥珀酸盐溶液 0． 20
mL，测 A595 nm，样品对 O2 －·的清除率 = (1 － A样 /
A对照)× 100%。
2 结果与讨论
2． 1 提取物得率及有关成分分析 实验所得 SE1
和 SE2 分别为 4． 741 和 4． 675 g，得率分别为9． 48%
和 9． 35%，SE1 中总黄酮、总酚和多糖质量分数分
别为 21． 59%、0． 29%和 20． 06%，SE2 中总黄酮的
质量分数为 92． 09%。
2． 2 荔枝草提取物对脂质过氧化的影响 自由基
使线粒体、微粒体和溶酶体等亚细胞结构的膜上多
聚不饱和脂肪酸过氧化，使线粒体、微粒体功能障
碍，导致细胞功能失调甚至破裂、死亡或凋亡。
FeSO4与 H2O2 诱导肝线粒体膜脂质过氧化物 MDA
生成，可作为·OH诱导脂质过氧化的特征。
实验结果见表 1，在所检测浓度范围内，SE 均
表现出较强的抑制脂质过氧化的能力，且呈显著的
剂量依赖性关系，在 0． 10 ～ 0． 40 mg /mL 范围内，
SE2 的抑制率略高于 SE1，但在较高质量浓度(0． 50
mg /mL)时，两者抑制脂质过氧化的能力相当，其抑
制率分别为 96． 25%和 95． 12%。
2． 3 荔枝草提取物对线粒体肿胀度的影响 据文
献报道，Fe2 + -Vc 诱导鼠肝线粒体膨胀的原因是由
于膜脂质过氧化作用，使膜构造改变，膜的屏障功能
丧失，膜内外离子交换发生障碍。线粒体氧化损伤
后发生肿胀，表现为其悬液浑浊度下降，在 A520 nm降
低，抑制肿胀，则使其 A520 nm趋于稳定。
由图 1 可以看出，随着时间的延长各组在
A520 nm下降，说明线粒体膜被氧化损伤发生了肿胀，
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其中正常组变化不大(9． 69%) ，阴性对照组下降幅
度最大(32． 44%) ，加样组下降趋势减缓，说明 SE
可以抑制·OH 所导致的氧化损伤，线粒体肿胀减
轻，而且呈明显的量效关系。在所检测的时间范围
内，SE1 在 0． 10 和 0． 20 mg /mL 时的变化分别为
22． 12%和 17． 47%，SE2 在 0． 10 和0． 20 mg /mL时
的变化分别为 20． 15%和 16． 67%，由此可知，SE2
抑制线粒体肿胀的能力略好于 SE1，并且随着浓度
的增大，两者的抑制能力逐渐增强。
表 1 SE抑制脂质过氧化的能力 (x ± s，n = 3)
Tab． 1 Liver mitochondria lipid peroxidation assay
of SE (x ± s，n = 3)
样品浓度 /(mg /mL) SE1 抑制率 /% SE2 抑制率 /%
0． 05
0． 1
0． 2
0． 3
0． 4
0． 5
31． 37 ± 4． 28
50． 51 ± 6． 72
66． 40 ± 2． 25
66． 67 ± 3． 47
81． 67 ± 0． 81
95． 12 ± 0． 82
45． 5 ± 3． 16
58． 75 ± 4． 25
76． 75 ± 1． 26
79． 75 ± 2． 49
83． 25 ± 3． 61
96． 25 ± 1． 52
图 1 SE对线粒体肿胀度的影响 (x ± s，n = 3)
Fig． 1 Effects of SE on mitochondrial membrane
swelling (x ± s，n = 3)
2． 4 荔枝草提取物对蛋白质羰基水平的影响 蛋
白质羰基的产生是蛋白质分子被自由基氧化修饰的
一个重要标记，由于这一特征具有普遍性，因而通过
测定羰基可判断蛋白质是否被氧化损伤，从而评价
SE对线粒体的抗氧化活性。
从表 2 可以看出，经 Fe2 + -Vc诱导后，大鼠肝线
粒体中蛋白质羰基含有量明显增多，说明线粒体受
到了氧化损伤，加入 SE 后，蛋白质羰基含有量下
降，且呈现浓度依赖性趋势，即受试物浓度越高，蛋
白质羰基含有量越低。相比较而言，SE2 降低蛋白
质羰基的能力明显强于 SE1，SE2 在 0． 20 mg /mL时
可使蛋白质羰基含有量下降为 8． 23 nmol /mg，而
SE1 在该浓度时只能使其下降为 28． 23 nmol /mg，
SE2 在 0． 40 mg /mL时即可使蛋白质羰基水平恢复
至接近正常水平，SE1 则需在 1． 0 mg /mL 时才能达
到类似效果。
表 2 SE对蛋白质羰基水平的影响 (x ± s，n = 3)
Tab． 2 Effects of SE on mitochondrial protein carbonyl
groups (x ± s，n = 3)
样品名称 SE加入量 /(mg /mL) 蛋白质羰基 /(nmol /mg)
阴性对照
SE1
SE2
正常
—
0． 20
0． 40
0． 60
0． 80
1． 00
0． 05
0． 10
0． 15
0． 20
0． 30
0． 40
—
34． 81 ± 3． 23
28． 23 ± 1． 84
23． 20 ± 1． 26
13． 33 ± 0． 89
9． 96 ± 1． 45
6． 96 ± 0． 54
28． 23 ± 1． 54
21． 04 ± 2． 14
11． 86 ± 1． 03
8． 23 ± 0． 94
7． 09 ± 0． 35
6． 41 ± 0． 42
3． 26 ± 0． 31
2． 5 荔枝草提取物对 ATP酶活性的影响 肝脏是
能量代谢的重要器官，含有丰富的线粒体，而线粒体
是细胞有氧呼吸的基地和能量供应的场所，细胞生
命活动约 95%的能量来自线粒体。ATP 是机体内
各种生理活动最直接的供能物质，它的产生依赖于
ATP酶的活性。ATP酶是生物体内广泛存在的一种
重要的膜酶，其主要参与细胞内外阳离子的转运及
能量的供应，对维持细胞的正常功能十分重要。
实验结果(见表 3)表明，经 Fe2 + -Vc 处理后，线
粒体 ATP酶活性下降，每毫克蛋白质每小时新生成
的无机磷量，由正常时的 6． 03 μmol 下降到 3． 01
μmol，约下降了 50%，加入荔枝草提取物进行保护
后，ATP酶活性显著增强，且在所检测浓度范围内呈
量效关系，即受试物的浓度越高，酶活性越强。SE1
在 1． 0 mg /mL 时可使 ATP 酶的活性恢复到接近正
常水平，而 SE2 在 0． 40 mg /mL 时就可达到相似的
效果，这充分说明 SE2 在线粒体受损时对 ATP酶活
性影响较大，也就是说其对线粒体损伤的保护能力
要强于 SE1。
2． 6 荔枝草提取物对 O2 －·生成的影响 线粒体
经 Fe2 + -Vc诱导受到损伤时，会产生自由基，主要是
O2 －·，本实验测定 SE 对线粒体损伤时产生的
O2 －·有无清除作用。结果如图 2 所示:在 0 ～ 0． 50
mg /mL范围内，SE对 O2 －·的清除能力随着浓度的
升高而增强，且 SE2 清除能力较 SE1 强，SE2 在
0． 50 mg /mL时清除率可达 80． 06%，半数清除浓度
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IC50为 0． 29 mg /mL，而 SE1 在同浓度时清除率只有
68． 65%，半数清除浓度 IC50为 0． 36 mg /mL。
表 3 SE对 ATP酶活性的影响 (x ± s，n = 3)
Tab． 3 Effects of SE on mitochondrial ATPase
activity (x ± s，n = 3)
样品名称 SE加入量 /(mg /mL) ATP酶活性 /μmol
阴性对照
SE1
SE2
正常
—
0． 20
0． 40
0． 60
0． 80
1． 00
0． 05
0． 10
0． 20
0． 30
0． 40
—
3． 01 ± 0． 49
3． 99 ± 0． 86
4． 50 ± 1． 02
5． 28 ± 1． 63
5． 60 ± 1． 42
5． 66 ± 2． 51
3． 47 ± 1． 71
4． 31 ± 1． 62
4． 71 ± 1． 54
5． 28 ± 2． 69
5． 90 ± 2． 77
6． 03 ± 1． 26
图 2 SE对线粒体超氧自由基生成的影响 (x ± s，n = 3)
Fig． 2 Effects of SE on mitochondrial superoxide anion
generation (x ± s，n = 3)
3 结论
实验结果表明，SE可以有效地抑制线粒体损伤
时的脂质过氧化反应和线粒体膨胀，降低蛋白质羰
基的量，恢复 ATP 酶的活性，清除线粒体中产生的
O2 －·，并且呈现良好的量效关系。SE2 和 SE1 抑
制脂质过氧化反应和线粒体膨胀的能力均随着浓度
的增大而增强，相比较而言，SE2 的作用稍强于
SE1;在所检测浓度范围内，SE2 对受损线粒体中蛋
白质羰基含量和 ATP 酶活性的影响比 SE1 要显著
的多;SE1 和 SE2 对线粒体中产生的 O2 －·都有很
强的清除作用，其半数清除浓度分别为 0． 36 和
0． 29 mg /mL。SE2 的效果较好，可能是该提取物中
黄酮含有量较高所致。这一结论为其在生物体内药
理作用的机制提供一定的依据，同时也为其作为抗
氧化药物或食品抗氧化剂提供参考。
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