全 文 ：Studies on Mitochondrial of Dracocephalum Moldavica L. Flavonoids
against Myocardial Ischemia / Reperfusion Injury in Rats
YAO Jiaming1, CAO Wenjiang1, YUAN Yong2， HONG Ye1, CHEN Weijun2, WANG Xinchun1,2
(1 School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832002，China； 2 The First Affiliated Hospital，School of Med cine，
Shihezi University，Shihezi 832002，China)
Abstract：To investigate the protective effects of Dracocephalum Moldavica L. total flavonoids (TFDM) in the aspect of
mitochondria against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury (MIRI). MIRI model was induced by ligating of anterior descending
of left coronary artery in rats. Infarct size were observed by Evans Blue-TTC staining and concentration of ATP of myocardial
were measured. The ultrastructure of mitochondria were observed by electron microscopic and activity of mitochondria were
measured. Compared with the I/R group, the TTC staining revealed that the degree of myocardial infarction reduced significantly
of TFDM groups, the levels of ATP of myocardium were raised by TFDM, also TFDM have protected the ultrastructure of
mitochondria. Meanwhile, TFDM showed significantly increase in the effect of activity of mitochondria (P＜0.05 orP＜0.01).
TFDM had protective effect about myocardium and mitochondria.
Key words：DracocephalumMoldavicaL. total flavonoids, Myocardial Ischemia/ Reperfusion Injury, mitochondria, protectiveeffects
DOI:10.13880/j.cnki.65-1174/n.2015.05.014文章编号：10 7-7383(2015)05-0599-05
香青兰总黄酮对心肌缺血 - 再灌注损伤线粒体
保护作用的研究
姚佳茗 1，曹文疆 1，袁勇 2，洪叶 1，陈卫军 2，王新春 1,2
（1 石河子大学药学院，石河子 832002；2 石河子大学医学院第一附属医院，石河子 832008）
摘要 ：为研究香青兰总黄酮（TFDM）对大鼠急性心肌缺血 - 再灌注损伤（MIRI）线粒体的保护作用。采用结扎大鼠左
冠状动脉前降支的方法复制 MIRI 的模型的方法。测定心肌梗死程度和心肌组织内 ATP 的含量，电镜观察线粒体超
微结构变化，检测线粒体活性。结果显示，与模型组比较，TFDM 不仅能够明显减轻大鼠心肌梗死程度，提高心肌
ATP 含量，还能有效保护线粒体的结构完整性，并且 TFDM 能够显著升高线粒体活性（P＜0.05 或P＜0.01）。由此可
知，TFDM 具有保护缺血 - 再灌注损伤的心肌组织以及线粒体的作用。
关键词 ：香青兰总黄酮；心肌缺血 - 再灌注损伤；线粒体；保护作用
中图分类号 ：R284 文献标志码 ：A
收稿日期：2015-05-25
基金项目：国家自然科学基金项目（81360671、81460638、81160525）
作者简介：姚佳茗（1990-），女，硕士研究生，专业方向为中药民族药研究。
通信作者：王新春（1969-），女，主任药师，从事中药民族药研究，e-mail：cwjwxc@163.com。
心血管疾病是威胁人类健康的主要疾病之一[1]。
近年来，心肌缺血-再灌注损伤（myocardial ischemia-
reperfusion injury，MIRI）已受到广大基础和临床工作
者的关注[2-4]。造成 MIRI 的机制有许多，其中线粒体
作为氧化磷酸化产生 ATP 的重要细胞器与 MIRI 的
各个环节都有密切关系[5-7]。
香青兰（Dracocephalum MoldevicaL.）为唇形科
青兰属一年生草本植物[8]，是维吾尔民族药之一，主
要用于治疗心肌缺血、冠心病等心血管疾病[9-10]。其
主要化学成分有黄酮类、挥发油、萜类、氨基酸及多肽
等[11]，黄酮是香青兰的主要有效成分[12]。香青兰总黄
酮（Dracocephalum MoldavicaL.totalflavonoids，TFDM）
第 33 卷 第 5 期
2015 年 10 月
Vol.33 No.5
Oct. 2015
石河子大学学报：自然科学版
Journal of Shihezi University：Natural Science
石河子大学学报 ：自然科学版 第 33卷
对缺血心肌有保护作用，但其作用是否与线粒体保
护作用密切相关。本实验通过对 TFDM 抗 MIRI 线粒
体保护作用的研究，为香青兰临床治疗心血管疾病
提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 仪器
HX-100E 小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公
司）；BL-420E生物机能实验系统（成都泰盟科技有限
公司）；TGL-16H台式高速冷冻离心机（湘仪离心机仪
器有限公司）；Thermo Scientific Varioskan Flash 3001
酶标仪（USA）；UV-2401PC紫外分光光度计（日本岛
津），JEOL-JEM-1230 型透射电子显微镜（日本 JEOL
公司）；EM-UC6型超薄切片机（美国Leica公司）。
1.2 试药
香青兰总黄酮提取物（新疆自治区药物研究所
提供，香青兰总黄酮纯度为 57%，20100708）；复方丹
参滴丸（天津天士力制药股份有限公司，950411）；环
孢素A（Sigma，BCBG7884V）；线粒体/胞浆制备试剂盒
（普利莱基因技术有限公司 C1260）；BCA法微量蛋白
检测试剂盒（南京建成，W041）；ATP含量测定试剂盒
（南京建成，A095）；MTT（Thermo scientific）；DCFH-DA
（Sigma，D6883）Evans Blue（Sigma，502A043）；TTC（Sigma，
531D036）
1.3 动物
雄性 SD 大鼠，体重 200-300 g，由新疆医科大
学实验动物中心提供。合格证号：新医动字第
2003-0001 号。
1.4 实验方法
1.4 .1 分组及给药
SD 大鼠雄性，随机分为 7 组，每组 10 只：假手
术组（Sham）；心肌缺血 - 再灌注组（模型组，I/R）；
香 青 兰 总 黄 酮 低 剂 量 药 物 组（TFDM-L，15
mg/kg/d），香青兰总黄酮中剂量药物组（TFDM-M，30
mg/kg/d），香青兰总黄酮高剂量药物组（TFDM-H，60
mg/kg/d）；环孢素 A 组（CsA，再灌前 20 min 经尾静
脉注射 10 mg/kg）；复方丹参滴丸阳性药对照组
（CSDP，243 mg/kg/d）。各给药组灌胃给药 7 d，对照
组和模型组同时用生理盐水灌胃，并于第 8 天给药
后 10 min 行手术。
1.4 .2 大鼠冠脉结扎（LAD 结扎）致心肌缺血 - 再
灌注模型的建立 [13- 14]
大鼠腹腔注射 25%的乌拉坦（0.5 mL/100 g）麻
醉。仰卧位固定，连接 BL-420E 生物机能实验系统，
监测正常状态下大鼠肢体 II 导联心电图。行气管插
管，切开皮肤，钝性分离胸肌至肋骨，从第四五肋间
隙把胸腔撑开，接呼吸机，切除第五肋。撕开心包
膜，暴露心脏，轻轻取出心脏结扎左冠状动脉前降
支（LAD），观测心电图，以心电图 S-T 段抬高、T 波
高耸或弓背向上抬高为心肌缺血模型复制成功的
标志。缺血 30 min 后，掏出心脏，剪开结扎线，将其
放回胸腔。此时以 ST 段抬高下降，T 波逐渐恢复测
定表示再灌注成功，120 min 后进行取材和相应指
标的测定。
1.4 .3 心肌梗死面积的测定
采用 Evans Blue-TTC 双重染色法计算法分析梗
死面积。再灌注 120 min 后，再次阻断 LAD，从主动
脉逆行注射 1%伊文氏蓝，冲洗心脏，左心室切片，
1%TTC 磷酸缓冲液中避光，37℃恒温孵育 30
min。计算缺血面积百分比（AAR/LV）=（缺血面积 /
左心室面积）×100%。梗死面积百分比（IS/AAR）=
（梗死面积 / 缺血面积）×100%。
1.4 .4 心肌组织 ATP 含量检测
按试剂盒说明书配置工作液并严格操作。工作
液及待测样品加完后室温静置 5 min，在 636 nm 处
测吸光度值。
1.4 .5 线粒体的制备
100-200 mg 心肌新鲜组织，剪碎加入预冷的
Mito Solution 研磨。将匀浆液 800×g 离心 5 min 4
℃。收集上清液，重复上一步骤。上清液 10，000×g
离心 10 min 4℃，沉淀加入 0.2 mL Mito Solution，
12，000×g 离心 10 min 4℃。线粒体沉淀在管底
并立即使用。
1.4 .6 电镜标本制备
样品于 2%的戊二醛液固定 24 h 以上，经 0.1%
磷酸缓冲液漂洗，1 %锇酸固定，再用磷酸缓冲液冲
洗。用50%、60%、70%、90%丙酮脱水各15 min，100%
丙酮脱水10 min，两次。用环氧树脂812包埋剂进行
常规包埋，在37℃温箱中过夜，于 45℃温箱中放置
12 h，60℃放置24 h。超薄切片，硝酸铅-醋酸双氧
铀电子染色，JEOL-1230透射电镜下观察。
1.4 .7 BCA法测定蛋白浓度
心肌线粒体蛋白含量的测定采用 BCA 蛋白定
量检测法。按试剂盒说明书配置工作液。将蛋白标
准液稀释成不同浓度，按说明书要求加入试剂，旋
涡混合。37℃孵育 30 min，用酶标仪在 562 nm 波
长处读取吸光度，绘制标准曲线，根据标准曲线计
算出蛋白浓度。调节样本蛋白浓度至 0.5 mg/mL。
1.4 .8 线粒体活力检测
取新鲜制备的线粒体悬液 50μL，加入酶标板
600
第 5期
微孔中，加入 5 g/L 甲氮甲唑蓝 20μL，30℃继续
孵育 30 min，再加入 50μL异丙醇 20 min 后于酶
联免疫检测仪 570 nm 比色。线粒体活力以加入
MTT 后 OD570 表示。
1.4 .9 统计学方法
采用 SPSS 17.0 统计软件处理试验数据。所有
数据都用均数±标准差（X±S）的形式表达，组间比
较采用单因素方差分析（ANOVA） 及t检验，P＜
0.01、P＜0.05 表示具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 TFDM对心肌梗死面积的影响
除假手术组，各缺血-再灌注组心肌AAR/LV无
统计学意义（P>0.05），且比值均 > 30％，证明模型建
立成功。与假手术组比较，模型组 IS/AAR明显升高
（P<0.01）。与模型组比较，香青兰高、中剂量组均可以
显著降低心肌梗塞面积（P<0.01）。丹参滴丸组及mPTP
抑制剂环孢素A组心肌梗死面积亦有所下调（表1）。
表 1 香青兰总黄酮预处理对大鼠 MIRI后心肌及线粒体的保护作用 X±S,n=10
Tab .1 Protection of TFDM on myocardia in MIRI rats X±S,n=10
2.2 TFDM对心肌组织 ATP 含量的影响
结果见表 1，与假手术组相比，模型组心肌组织
ATP 含量明显下降（P＜0.01），说明缺血再灌后线粒
体受损，ATP 含量降低。与模型组相比，香青兰总黄
酮高剂量组、环孢素 A 组和丹参滴丸组能够明显提
高心肌组织 ATP 含量（P＜0.01）；与环孢素 A 组比
较，香青兰总黄酮低剂量组具有显著性差异（P＜
0.05），其保护作用低于环孢素 A 组，中、高剂量组
以及复方丹参滴丸组与环孢素 A 组比较没有显著
性差异，说明三者对心肌组织 ATP 含量的影响与环
孢素 A 相似。
2.3 TFDM对线粒体微观结构的改变
如图 1 所示，假手术组（图 1a）线粒体外膜光滑，内膜
褶皱呈嵴，嵴形状规则，线粒体光密度居中。模型组
（图1b）线粒体明显肿胀，嵴突紊乱、断裂或消失，空泡
样变甚至溶解至无正常结构。香青兰总黄酮高剂量组
（图1e）、环孢素 A组（图 1f）以及复方丹参滴丸组（图
1g）线粒体轻度肿胀，基质基本完整，颗粒部分消失，少
部分断裂，较I/R组比线粒体损伤程度明显减轻。香
青兰总黄酮低剂组（图1c）超微结构改变与I/R组相
似，病变稍轻，中剂量组（图 1d）较之低剂量组线粒体
形态有所好转（图1 a-g）。
注：与假手术组比较，++表示 P＜0.01；与模型组比较，*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01；与环孢素A组相比较，＃表示 P＜0.05。
e：香青兰总黄酮高剂量组 f：环孢素 A 组 g：复方丹参滴丸组
图 1 透射电镜下观察心肌线粒体的结构改变（×20000）
Fig .1 Effect of TFDM on ultras tructure of mitochondria（×20000）

       



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a：假手术组 b：缺血模型组 c：香青兰总黄酮低剂量组 d：香青兰总黄酮中剂量组
姚佳茗 ，等 ：香青兰总黄酮对心肌缺血 -再灌注损伤线粒体保护作用的研究 601
石河子大学学报 ：自然科学版 第 33卷
2.4 TFDM对线粒体活力的影响
结果见表 1、图 2，与假手术组相比，模型组线粒
体活力明显下降（P＜0.01），说明缺血再灌后线粒体
受损，活力减低。与模型组相比，香青兰总黄酮中剂
量组与丹参滴丸组线粒体活力下降幅度较小（P＜
0.05），香青兰总黄酮高剂量组和环孢素 A 组能够
明显抑制线粒体活力的降低（P＜0.01），起到保护线
粒体的作用。各给药组除香青兰总黄酮低剂量组
外，与环孢素 A 组相比没有明显差异。
图 2 香青兰总黄酮预处理对大鼠线粒体活力的影响
（x±s，n=10）
Fig .2 Effect of TFDM on Activity of mitochondria
(x±s，n=10)
注：与假手术组比较，++表示 P＜0.01；与模型组比较，*表示
P＜0.05，**表示P＜0.01；与环孢素A组相比较，＃表示P＜0.05。
3 讨论
能量是心肌缺血 - 再灌注过程中保持心肌细胞
结构完整，维持正常功能的重要保障。线粒体功能
障碍在心肌缺血 - 再灌注损伤（MIRI）中占有重要
地位。缺血 - 再灌注时线粒体极易受到损伤，并在
整个病理过程中起着中心枢纽作用。环孢素 A
（CsA）是一种特异性线粒体通透性转换孔（mPTP）的
开放抑制剂，大量实验证明[15]，再灌注时给予 CsA，
对缺血再灌过程中的心肌，尤其是线粒体，具有保
护作用。故本实验选择了 CsA、复方丹参滴丸为阳性
药物：通过复方丹参滴丸与香青兰总黄酮和 CsA 的
实验结果对比，证明香青兰总黄酮和 CsA 对缺血心
肌有保护作用；通过线粒体通透性转换孔的抑制剂
CsA 预处理组，和香青兰总黄酮预处理组的实验结
果作对比，证明香青兰总黄酮对缺血心肌的保护作
用可能与保护线粒体功能有关，来评价 TFDM 在线
粒体方面对 MIRI 的保护作用。
再灌注在改善心肌供血的同时又加重了单纯心
肌缺血所造成的损伤，可致心肌梗死的出现。本实
验结果表明，与模型组比较，TFDM 组能显著降低梗
死面积百分比，有效的保障心脏功能的恢复。CsA 预
处理组与复方丹参滴丸组对缺血心肌的保护作用相
当，验证了 CsA 的心肌保护作用。众所周知，线粒体
是产生 ATP 的主要场所[16]，但在缺氧缺血等病理状
态下线粒体氧化磷酸化受损，ATP 合成不足，能量代
谢发生障碍，导致心肌组织损害。为了评估线粒体
产生 ATP 的能力，本研究检测了各组大鼠在缺血 /
再灌注后心肌组织中 ATP 的含量。实验结果显示，
香青兰总黄酮各剂量组能在一定程度上抑制心肌
组织 ATP 含量的降低，说明香青兰总黄酮可以缓解
急性心肌缺血 / 再灌注损伤所造成的能量供应障
碍。CsA 预处理可以提高心肌组织中的 ATP 含量，
香青兰总黄酮中、高剂量组与环孢素 A 组作用相
当，提示香青兰黄酮对心肌缺血 / 再灌注损伤的保
护作用与线粒体保护相关。
我们利用超薄切片技术，对香青兰总黄酮预处
理后的 MIRI 大鼠线粒体的超微结构进行深入的研
究。与假手术组比较，模型组线粒体的结构发生了
明显的病变，表明心肌缺血再灌注后线粒体受损，
其正常的生理功能严重退化。与模型组比较，复方
丹参滴丸组以及 CsA 组线粒体的形态结构改变不
大，可以维持正常的生理功能，其中 CsA 组对线粒
体的保护作用优于复方丹参滴丸组，证实了 CsA 的
线粒体保护作用。香青兰总黄酮高、中剂量对线粒
体有明显的保护作用。与 CsA 组比较，香青兰总黄
酮高剂量组、复方丹参滴丸组对线粒体的保护作用
与其大致相似。表明 TFDM 在 MIRI 过程中对线粒体
有一定的保护作用。
目前常用 MTT 法检测细胞的活性，代表线粒
体中琥珀酸脱氢酶活性，反应细胞线粒体活力。由
实验结果可知，缺血再灌后线粒体受损，经 TFDM 预
处理的组别线粒体受损程度均有所改善，表明
TFDM 对线粒体起到了一定的保护作用。与环孢素
Ａ 组相比，香青兰黄酮中、高剂量组和复方丹参滴
丸组没有显著性差异，提示香青兰黄酮可以很好的
提高线粒体的活性，维持线粒体正常的生理功能。
综上所述，TFDM 不仅能够明显减轻大鼠心肌
梗死程度，提高心肌 ATP 含量，还能有效保护线粒
体活性以及结构的完整性。TFDM 各剂量组与 CsA
组和复方丹参滴丸组相比，除低剂量组外，没有统
计学差异，说明 TFDM 对 MIRI 具有线粒体保护作
用，这可能是 TFDM 防治 MIRI 的作用机制之一。
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第 5期
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