全 文 ：化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
第 26 卷第 7 期
2014 年 7 月
化 学 研 究 与 应 用
Chemical Ｒesearch and Application
Vol. 26，No. 7
July，2014
文章编号:1004-1656(2014)07-1136-05
HPLC波长切换法同时测定粗茎
秦艽中 6 个成分的含量
宋九华1，2，杨文钰1，孟 杰1，李 瑶1，曾 羽1，成 涛3，陈兴福1*
(1. 四川农业大学农学院，农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室，四川 温江 611130;
2. 乐山师范学院化学学院，四川 乐山 614004;3. 四川回春堂药业公司，四川 遂宁 629000)
摘要:本实验建立了 HPLC波长切换法同时测定云南丽江粗茎秦艽中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙
菜苷、异荭草苷、异牡荆苷 6 种成分的含量，并对各成分含量间的相关性进行分析，为粗茎秦艽药材质量的全
面评价提供了科学依据。采用 Sepax Gp-C18(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)色谱柱，甲醇-0. 1%磷酸为流动相体
系，梯度洗脱，流速 1. 0 mL·min－1，柱温 25℃，检测波长 235 nm(0 ～ 51 min)、270 nm(51 ～ 57 min)、243 nm(57
～ 65 min)、270 nm(65 ～ 80 min)。马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷的量分别
在 0. 01000 ～ 10. 0000、0. 00216 ～ 2. 1600、0. 0480 ～ 48. 0000、0. 0010 ～ 1. 0000、0. 00034 ～ 0. 3400、0. 00026 ～
0. 2600 μg范围内与色谱峰峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为 98. 52% ～ 99. 31%，ＲSD均小于 3. 5%(n
=6) ;对各成分含量间相关性分析发现环稀醚萜苷类与黄酮类组分含量间无相关性，四种环烯醚萜苷类成分
的含量之间存在着显著相关性，两种黄酮类成分的含量之间也存在相关性。该方法简便、快速、准确，重现性
好，更符合中药材复杂体系的多指标质量控制发展趋势，为粗茎秦艽药材的质量控制找到了简便易行的方法。
关键词:HPLC;粗茎秦艽;马钱苷酸;獐牙菜苦苷;龙胆苦苷;獐牙菜苷;异荭草苷;异牡荆苷
中图分类号:O657. 72 文献标志码:A
HPLC with switching wavelength simultaneous determination
of six constituents in Gentiana crassicaulis
SONG Jiu-hua1，2，YANG Wen-yu1，MENG Jie1，LI Yao1，ZENG Yu1，CHENG Tao3，CHEN Xing-fu1*
(1. College of Agronomy，Sichuan Agriculture University，Key Laboratory of Crop Physiology，
Ecology and Cultivation in Southwest，Ministry of Agriculture，Wenjiang 611130，China;
2. Department of Cchemistry，Leshan Normal College，Leshan 614004，China;
3. Sichuan Huichuntang Pharmaceutical Company，Suining 629000，China)
Abstract:To establish an HPLC with switching wavelength method for determination of six components(loganic acid，swertiamarin，
gentiopicroside，sweroside，isoorientin，isovitexin)in Gentiana crassicaulis． Sepax Gp-C18(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)column was
used，the mobile phase was methanol-0. 1% phosphoric acid solution with gradient elution at a flow rate of 1. 0 mL·min－1 ． The col-
umn temperature was set at 25℃，detection wavelength was 235 nm(0 ～ 51 min)、270 nm(51 ～ 57 min)、243 nm(57 ～ 65 min)、
270 nm(65 ～ 80 min)． The six components(loganic acid，swertiamarin，gentiopicroside，sweroside，isoorientin，isovitexin)content in
the ranges of 0. 01000 ～ 10. 0000，0. 00216 ～ 2. 1600，0. 048 ～ 48. 0000，0. 0010 ～ 1. 0000，0. 00034 ～ 0. 3400 and 0. 00026 ～
0. 2600 μg respectively，had a good linearity. The average recoveries were 98. 52% ～ 99. 31%，the ＲSD was less than 3. 5% . There
收稿日期:2013-09-16;修回日期:2013-10-15
联系人简介:陈兴福(1964-) ，男，教授，主要从事川产道地及特色药材生理生态与栽培研究。E-mail:chenxf64@ sohu. com
第 7 期 宋九华，等:HPLC波长切换法同时测定粗茎秦艽中 6 个成分的含量
were significant correlations between the content of the four iridoid glucosides，the content of the two flavone constituents had corre-
lations too. There was no correlations between the flavone constituents and the iridoid glucosides constituents. Conclusion:This meth-
od was simple，rapid，accurate，dependable. And may be use to control quality of Gentiana crassicaulis.
Key words:HPLC;Gentiana crassicaulis;loganic acid;swertiamarin;gentiopicroside;sweroside;isoorientin;isovitexin
秦艽为龙胆科植物秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽
或小秦艽的干燥根［1］，粗茎秦艽 Gentiana crassi-
caulis Duthie ex Burk作为“秦艽”的四种基原植物
之一［2］，主要含有环烯醚萜苷类，三萜、甾醇苷类、
黄酮碳苷及其他化合物等。现代药理学研究表明
秦艽中的环烯醚萜苷类具有抗炎、保肝利胆和抗
菌等作用，黄酮类成分具有抗氧化、降血糖、治疗
心血管疾病等作用［3，4］。一直以来粗茎秦艽中有
效成分的质量控制及品质评价多集中在以龙胆苦
苷为代表的环烯醚萜苷类成分上［5，6］。这种单一
类别成分指标的质量控制模式，难以全面反映秦
艽的真实质量，本文采用 HPLC 波长切换技术同
时测定了云南粗茎秦艽中四个环烯醚萜苷类成分
和两个黄酮类成分的含量。并对各成分含量之间
的相关性进行了研究。该方法简便、快速、准确，
重现性好，更符合中药复杂体系的多指标质量控
制发展趋势，为秦艽药材的质量控制提供科学方
法。
1 实验部分
1. 1 仪器与试药
LC-2010A高效液相色谱仪，配紫外检测器、
四元泵溶剂淋洗系统(日本岛津公司) ;KQ3200E
型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
对照品:马钱苷酸(批号 111865-201102)中国
食品药品检定研究所;獐牙菜苷(批号 111742-
200501)中国药品生物制品检定所;龙胆苦苷(批
号 MUST-12081505)、獐牙菜苦苷(批号 MUST-
12070203)、异荭草苷(批号 MUST-12100902)、异
牡荆苷(批号 MUST-12072501)购自成都曼思特生
物制品有限公司，各标准品纯度均大于 98. 0%。
水为超纯水，甲醇为色谱纯，磷酸、乙醇为分析纯。
秦艽样品材料:为保证研究的药材样品能够
全面代表云南粗茎秦艽的客观性、真实性，按秦艽
种植地海拔高度从低到高的路线，对各乡镇典型
粗茎秦艽生产区域进行产量、质量调查，根据种植
区微生态条件，并按照种植历史、种植面积等情况
布置相应样品采样点，于 2012 年 11 月中旬秦艽
采收季节分别到各采样点采集两年生植株样品 20
份，见表 1。样品由四川农业大学陈兴福教授鉴定
为粗茎秦艽 Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk。
将采集的样品洗净、杀青后于 45℃烘干备用。
表 1 秦艽样品来源信息
Table 1 Sources of Gentiana crassicaulis samples
编号 来源 采集时间 编号 来源 采集时间
1 云南丽江鲁甸村 2012 /11 /7 11 云南丽江安乐村 2012 /11 /9
2 云南丽江鲁甸村 2012 /11 /7 12 云南丽江安乐村 2012 /11 /9
3 云南丽江鲁甸村 2012 /11 /7 13 云南丽江安乐村 2012 /11 /9
4 云南丽江甸东村 2012 /11 /7 14 云南丽江安乐村 2012 /11 /9
5 云南丽江鲁甸村 2012 /11 /7 15 云南丽江安乐村 2012 /11 /9
6 云南丽江杵峰村 2012 /11 /8 16 云南丽江拉美荣村 2012 /11 /9
7 云南丽江杵峰村 2012 /11 /8 17 云南丽江鲁甸村 2012 /11 /10
8 云南丽江杵峰村 2012 /11 /8 18 云南丽江鲁甸村 2012 /11 /10
9 云南丽江杵峰村 2012 /11 /8 19 云南丽江鲁甸村 2012 /11 /10
10 云南丽江杵峰村 2012 /11 /8 20 云南丽江杵峰村 2012 /11 /8
7311
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
1． 2 实验方法
1. 2． 1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取
马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭
草苷、异牡荆苷对照品适量，用甲醇溶解定容，配
制成单一成分的溶液，即马钱苷酸 5. 0000 mg·
mL－1、獐牙菜苦苷 4. 3200 mg·mL－1、龙胆苦苷
9. 6000 mg·mL－1、獐牙菜苷 2. 0000 mg·mL－1、异荭
草苷 1. 3600 mg·mL－1、异牡荆苷 1. 0400 mg·mL－1
的对照品贮备液。分别精密吸取一定量上述对照
品贮备液，用甲醇定容配制成每 1 mL 含马钱苷酸
1. 0000mg、獐牙菜苦苷 0. 216 mg、龙胆苦苷
4. 8000 mg、獐牙菜苷 0. 1 mg、异荭草苷 0. 0340
mg、异牡荆苷 0. 0260 mg的混合对照品溶液。
1． 2. 2 供试品溶液制备 精密称取粗茎秦艽粉
末(60 目)1. 0 g，置于具塞锥形瓶中，准确加入甲
醇溶液 20 mL，称定重量后，超声 50 min，冷却，再
称定重量，用甲醇补足重量，摇匀，用 0. 45 μm 的
滤膜过滤即可。
1． 2. 3 色谱条件 色谱柱:Sepax Gp-C18(150
mm × 4. 6 mm，5 μm) ;流动相:甲醇(A)和 0. 1%
磷酸水溶液(B) ;洗脱程序:0 ～ 35 min，0% ～ 15%
A;35 ～ 55 min，15% A;55 ～ 70 min，15% ～ 40% A;
70 ～ 80 min，40%A。流速 1 mL·min－1，柱温 25℃，
进样量 10 μL. 检测波长:235 nm(0 ～ 51 min，检测
马钱苷酸和獐牙菜苦苷)、270 nm(51 ～ 57 min，检
测龙胆苦苷)、243 nm(57 ～ 65 min 检测獐牙菜
苷)、270 nm(65 ～ 80 min 检测异荭草苷和异牡荆
苷)。混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂色
谱图见图 1
图 1 云南粗茎秦艽 HPLC图
Fig. 1 HPLC figure of Gentiana crassicaulis from Yunnan
A．混合对照品;B．粗茎秦艽样品;C．空白溶剂
1．马钱苷酸(loganic acid) ;2．獐牙菜苦苷(swertiamarin) ;3．龙胆苦苷(gentiopicroside) ;
4．獐牙菜苷(sweroside) ;5．异荭草苷(isoorientin) ;6．异牡荆苷(isovitexin)
2 结果与讨论
2. 1 测定体系的建立及应用
2. 1. 1 提取方法、流动相和检测波长的选择 本
文采用超声波提取法，提取溶剂选择:分别考察了
70%乙醇、甲醇、水 3 种不同提取溶剂的提取效
果，称取 1 号秦艽样品 3 份，分别加入 20 mL 上述
3 种溶液，按 1． 2. 2 项方法制备供试品溶液，按 1．
2. 3 色谱条件进行分析。结果表明以甲醇作溶剂
时各待测成分的峰面积最大，提取效果最好。超
声时间:准确称取 1. 0 g 1 号粗茎秦艽样品 6 份，
分别加入 20 mL甲醇，称定重量，超声提取时间分
别为 20、30、40、50、60、70 min，其他操作与 1． 2. 2
相同，按 1． 2. 3 进行 HPLC 分析。结果表明，超声
50min即可提取完全，因此采用纯甲醇超声提取
50 min作为本实验提取方法;流动相选择:考察了
乙腈-水、乙腈-0. 1%磷酸、甲醇-水、甲醇-0. 1%磷
酸等流动相体系进行梯度洗脱，结果甲醇-0. 1%磷
酸体系各色谱峰之间分离效果最好，且峰形较好，
色谱图基线平稳，故以此作为流动相系统。波长
选择:由于 6 个待测组分的种类不同，本实验利用
可变波长紫外检测器波长切换功能，选择各物质
最大吸收峰处的波长为检测波长，235 nm(0 ～ 51
min，检测马钱苷酸和獐牙菜苦苷)、270 nm(51 ～
57 min，检测龙胆苦苷)、243 nm(57 ～ 65 min 检测
獐牙菜苷)、270 nm(65 ～ 80 min 检测异荭草苷和
异牡荆苷)。从而实现对六个成分的同时测定。
2． 1. 2 线性关系的考查 分别精确移取 1. 2. 1
项的混合对照品溶液 0. 01、0. 05、0. 1、0. 5、0. 8、
1. 0 mL 于 10mL 容量瓶中，用甲醇稀释成 6 个不
同质量浓度的对照品溶液，加上 1. 2. 1 项的混合
对照品原溶液，共计 7 个浓度梯度的混合对照品
工作液，按色谱条件分别进样 10 μL 进行测定，以
8311
第 7 期 宋九华，等:HPLC波长切换法同时测定粗茎秦艽中 6 个成分的含量
进样量 X(μg)为横坐标，峰面峰面积 Y为纵坐标， 绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 2。
表 2 线性关系结果
Table 2 Ｒesult of linear relation
成分 线性回归方程 r 线性范围(μg)
马钱苷酸(loganic acid) Y=1610299. 47 X+ 6674. 11 0. 9995 0. 0100 ～ 10. 0000
獐牙菜苦苷(swertiamarin) Y=1346843. 07 X+ 12904. 71 0. 9997 0. 00216 ～ 2. 1600
龙胆苦苷(gentiopicroside) Y=14229018. 50 X－12248. 24 0. 9995 0. 0480 ～ 48. 0000
獐牙菜苷(sweroside) Y=1447102. 48 X+3801. 79 0. 9992 0. 0010 ～ 1. 0000
异荭草苷(isoorientin) Y=2980145. 36 X－18. 48 0. 9991 0. 00034 ～ 0. 3400
异牡荆苷(isovitexin) Y=2416900. 89 X+2416. 5 0. 9993 0. 00026 ～ 0. 2600
2． 1. 3 精密度试验 精密吸取 1 号秦艽样品供
试品溶液 10 μL，连续进样 6 次，测得马钱苷酸、獐
牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆
苷峰面积的 ＲSD 分别为 2. 3%、2. 7%、1. 9%、
2. 8%、3. 1%、3. 7%。
2． 1. 4 重复性试验 取 1 号样品粉末 6 份，每份
精密称量 1. 00 g，按照 1． 2. 2 项下方法平行制备成
供试品溶液，分别进样 10 μL。结果马钱苷酸、獐
牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆
苷的平均含量分别为 16. 205、3. 233、48. 527、
0. 734、0. 00614、0. 0462 mg·g－1，ＲSD 分别为
3. 2%、2. 7%、2. 9%、3. 6%、3. 1%、3. 3%。
2． 1. 5 稳定性试验 取 1 号样品的供试品溶液，
分别在 0、2、4、6、8、10、12 h 进样 10 μL，测得马钱
苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草
苷、异牡荆苷峰面积的 ＲSD(n = 7)分别为 2. 1%、
1. 8%、2. 6%、2. 8%、2. 3%、2. 2%。结果表明，秦
艽供试品溶液的 6 活性个成分在 12 h内稳定性良
好。
2． 1. 6 加样回收率试验 准确称取已知含量的 1
号粗茎秦艽药材粉末 6 份，每份样约 0. 5 g，分别
置于具塞锥形瓶中，准确加入马钱苷酸、獐牙菜苦
苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、异荭草苷、异牡荆苷的对
照品贮备液 0. 6 mL、0. 2 mL、1 mL、0. 2 mL、2 μL、4
μL按 1． 2. 2 项下方法制备成供试品溶液，采用 1．
2. 3 项的色谱条件进行平行测定，结果 6 种化合物
的平均回收率分别为 99. 31%、98. 82%、99. 27%、
98. 99%、98. 52%、98. 63%;ＲSD 分别为 2. 8%、
3. 0%、3. 1%、3. 26%、3. 50%、3. 44%。
2． 1. 7 样品测定 分别称取采自云南丽江的 20
份粗茎秦艽药材粉末约 1. 0g，按照 1． 2. 2 项制备
供试品溶液，按 1． 2. 3 项色谱条件进行测定，外标
法计算样品中各待测成分的量(n = 3) ，样品测定
结果见表 3。
表 3 粗茎秦艽各成分的含量测定结果(mg·g－1，n=3)
Table 3 Ｒesult of determination of six components in Gentiana crassicaulis
马钱苷酸 獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 獐牙菜苷 异荭草苷 异牡荆苷
含量 9. 964 ～ 19. 473 2. 914 ～ 3. 833 20. 130 ～ 60. 960 0. 354 ～ 1. 507 0. 00107 ～ 0. 00654 0. 00451 ～ 0. 0462
平均值 15. 005 3. 563 47. 525 0. 732 0. 00318 0. 0194
2. 2 样品测定结果分析
采用 HPLC 波长切换法对云南丽江 20 个不
同种植地的粗茎秦艽样品进行了定量测定。结果
马钱苷酸的含量为 9. 964 ～ 19. 473 mg·g－1，獐牙菜
苦苷的含量为 2. 914 ～ 3. 833 mg·g－1，龙胆苦苷的
含量为 20. 130 ～ 60. 960 mg·g－1，獐牙菜苷的含量
为 0. 354 ～ 1. 507 mg·g－1，异荭草苷的含量为
0. 00107 ～ 0. 00654 mg·g－1，异牡荆苷的含量为
0. 00451 mg ～ 0. 0462 mg·g－1。六个指标成分獐牙
菜苦苷的含量相对稳定，另外五种成分的含量差
异均较大，尤其异牡荆苷最大含量是最低含量 10
倍左右。表明粗茎秦艽栽培环境，尤其土壤状况
对其质量影响很大，作为秦艽的药效成分，其种类
及量不同活性亦不同，对其进行栽培种植，需要选
择合适的地域。
马钱干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷、
异荭草苷和异牡荆苷的平均含量分别为 15. 005
mg·g－1、3. 563 mg·g－1、47. 525 mg·g－1、0. 732 mg·
g－1、0. 00318 mg·g－1和 0. 0194 mg·g－1。《中国药
典》2010 年版规定秦艽中龙胆苦苷和马钱苷酸总
量不得少于 2. 5%，本实验研究表明，丽江栽培粗
茎秦艽质量均远远高于药典要求。样品中六种成
分含量均为龙胆苦苷＞马钱干酸＞獐牙菜苦苷＞獐
牙菜苷＞异牡荆苷＞异荭草苷，这与文献报道结果
一致［5］。说明粗茎秦艽根部六种成分的次生代谢
过程具有相似性。与曹晓燕对云南玉龙粗茎秦艽
9311
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
四种环烯醚萜类成分的测定结果比较，马钱苷酸
和獐牙菜苷的平均含量偏高，但龙胆苦苷和獐牙
菜苦苷含量却偏低，相差约一倍左右［5］，这可能与
样品生长的海拔或土壤环境有直接的关系。
麻花秦艽根部不含异荭草苷［7］，本实验从云
南粗茎秦艽根部检测出了异荭草苷，并且发现云
南丽江栽培粗茎秦艽与西藏和玉树生产粗茎秦艽
中异荭草苷含量差异较大［8］，所以粗茎秦艽中异
荭草苷的利用应考虑产地因素。异牡荆苷作为秦
艽的药效成分，具有抑菌、抗肿瘤(用 60 种黄酮化
合物作试验，异牡荆苷是三种最强的抗肿瘤化合
物之一)等生物活性。本实验首次对其在粗茎秦
艽中的含量进行测定，发现云南丽江粗茎秦艽中
异牡荆苷的平均含量 0. 0194 mg·g－1。
2. 3 相关性分析
以所测定的 6 个活性成分色谱峰的峰面积为
变量，通过 spss19 软件计算，得出秦艽中 6 个主要
活性成分含量之间的 Pearson 相关性，其结果见表
4。
表 4 秦艽中六个活性成分含量之间的相关系数
Table 4 Correlation coefficient between six components content in Gentiana crassicaulis
马钱苷酸 獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 獐牙菜苷 异荭草苷 异牡荆苷
马钱苷酸 1 0. 202 0. 552* 0. 700＊＊ －0. 218 －0. 215
獐牙菜苦苷 1 0. 592＊＊ 0. 384 0. 003 －0. 025
龙胆苦苷 1 0. 394 0. 137 －0. 031
獐牙菜苷 1 －0. 296 －0. 197
异荭草苷 1 0. 587＊＊
异牡荆苷 1
* . 在 0. 05 水平(双侧)上显著相关;＊＊. 在 0. 01 水平(双侧)上显著相关
结果表明，粗茎秦艽药材中 4 个环稀醚萜苷
类成分与 2 个黄酮类成分的含量之间均无相关
性，说明粗茎秦艽中环烯醚萜苷类和黄酮类成分
在植物体内的积累规律和生源合成途径存在着明
显差别，这为 GAP 生产中秦艽药材的定向培育提
供了参考。4 个环稀醚萜苷类成分的含量之间具
有显著的相关性。如:马钱苷酸的含量与龙胆苦
苷及獐牙菜苷的含量之间具有显著的相关性，相
关系数在 0. 5 以上，其中马钱苷酸与獐牙菜苷含
量之间具有极显著相关性，相关系数达 0. 7;獐牙
菜苦苷与龙胆苦苷含量之间也存在显著相关性，
相关系数为 0. 592。2 个黄酮类成分异荭草苷与
异牡荆苷的含量之间也具相关性，相关系数为
0. 587。云南丽江粗茎秦艽中环烯醚萜苷类成分
与环烯醚萜苷类成分之间，黄酮类成分与黄酮类
成分之间的含量具有相关性，说明同类活性成分
之间具有相似的次生代谢途径和积累规律。通过
对秦艽中 6 个成分含量之间的相关性研究，为秦
艽药材活性成分的筛选提供了参考，为秦艽药材
的 GAP 栽培过程中活性成分积累提供理论依据，
也为粗茎秦艽的质量控制找到了简便易行的方
法。
参考文献:
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(责任编辑 李 方)
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