全 文 ：基金项目:中国中医科学院自主课题(Z2013363-865)
作者简介:师玉华，女，博士 研究方向:中药分子鉴定 * 通讯作者:孙伟，男，助理研究员 研究方向:中药分子鉴定 Tel: (010)
84017374 E-mail:wsun@ icmm. ac. com
凉茶药材凉粉草与混伪品的 ITS2 条形码鉴定
师玉华1，马定乾2，张景景2，方广宏3，徐文流4，孙伟1* (1. 中国中医科学院中药研究所，中药鉴定与安全性检测评估北京市重
点实验室，北京 100700;2. 南阳理工学院，河南 南阳 473000;3. 广州王老吉药业股份有限公司，广州 510450;4. 广州王老吉大健康产业有限公
司，广州 510623)
摘要:目的 建立一种准确、快速的凉茶药材凉粉草与其混伪品的 DNA条形码鉴定方法。方法 本实验收集凉粉草及其混伪
品共 5 个物种和 4 个变种的 55 份样本，提取基因组总 DNA，通过 PCＲ 扩增和 CodonCode Aligner 软件拼接注释获得完整的
ITS2 序列，然后应用种内种间 K2P遗传距离和系统进化 NJ树分析进行物种鉴定。结果 凉粉草 ITS2 序列长度为 232 bp，种
内遗传距离为 0，远小于其与混伪物种间的最小遗传距离 0. 210 2 ～ 0. 310 9;NJ 树结果表明，凉粉草独成一支，与其混伪品均
可准确区分。结论 基于 ITS2 序列的 DNA条形码技术能够准确有效地实现凉粉草与其混伪品的快速鉴别，保障凉茶药材凉
粉草的使用安全。
关键词:凉粉草;DNA条形码鉴定;ITS2 序列;混伪品
doi:10. 11669 /cpj. 2015. 15. 005 中图分类号:Ｒ282 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2015)15 － 1282 － 04
Identification of Herbal Tea Ingredient Mesona chinensis and Its Adulterants Using ITS2 Barcode
SHI Yu-hua1，MA Ding-qian2，ZHANG Jing-jing2，FANG Guang-hong3，XU Wen-liu4，SUN Wei1* (1. Institute of
Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation
of Chinese Medicine，Beijing 100700，China;2. Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473000，China;3. Guangzhou Wanglaoji
Pharmaceutical Company Limited，Guangzhou 510450，China;4. Guangzhou Wanglaoji Great Health Industry Company Limited，
Guangzhou 510623，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To establish an accurate and rapid method for identifying Mesona chinensis and its adulterants using the
internal transcribed spacer 2 (ITS2)region as a barcode. METHODS The total genomic DNA from 55 samples representing five
species and four variants including M. chinensis and its adulterants were extracted. The ITS2 regions were amplified，and the complete
ITS2 sequences were annotated by CodonCode Aligner. The intra- and inter-specific genetic distances based on Kimura 2-Parameter
(K2P)and the Neighbor-Joining (NJ)phylogenetic tree were analyzed to identify the species. ＲESULTS The lengths of all the
ITS2 sequences of M. chinensis were 232 bp. The intra-specific genetic distances (0)were far shorter than the inter-specific ones be-
tween M. chinensis and its adulterants (0. 210 2 － 0. 301 9). NJ tree analysis indicated that M. chinensis were accurately differentiated
from its adulterants. CONCLUSION The ITS2 region as an DNA barcode can accurately and effectively distinguish herbal tea ingre-
dient M. chinensis from its adulterants，which provides a quick identifying method to ensure its safe use.
KEY WOＲDS:Mesona chinensis;DNA barcoding;ITS2 barcode;adulterants
药材凉粉草为唇形科凉粉草属植物凉粉草
(Mesona chinensis Benth. )的干燥地上部分。该物种
为一年生草本，又名仙草、仙人草、仙人冻等，主产于
广东、广西、浙江、江西等省，是一味重要的药用和食
用中草药。据《本草求原》、《岭南采药录》等古籍记
载，凉粉草可“清暑热，解藏府结热毒，治酒风”，亦
可“治花柳毒入骨”。现代研究表明，凉粉草含有多
糖、三萜酸、黄酮、维生素和微量元素等成分［1-2］，具
有清热解毒、抗肿瘤、降血糖、抗炎抗菌、增强机体免
疫功能等多重功效［3-4］。目前，凉粉草被广泛应用于
多种凉茶饮品中，民间也常用其煲汤或制成凉粉等
夏日消暑品。随着凉茶饮料销量的不断提高，凉粉
草的需求也日益增大，导致市场上出现了混淆品和
伪品。本实验经调查发现，凉粉草的混伪品主要是
同为唇形科的全草类中草药，涉及药材基原物种包
括溪黄草(Isodon serra Maxim. Hara)、线纹香茶菜
(Isodon lophanthoides Buch. -Ham. ex D. Don H. Ha-
ra)、灯笼草(Clinopodium polycephalum Vaniot C. Y.
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Wu ＆ Hsuan ex P. S. Hsu)、风轮菜(Clinopodium
chinense Bentham Kuntze)和筋骨草(Ajuga ciliata
Bunge)等。唇形科干燥全草外形特征均表现为“茎
四棱，单叶对生”，在缺少花和果实的情况下很难通
过传统外观形态鉴定区分，容易混淆，造成市场乱
象，严重威胁到凉粉草的药用食用安全。现阶段有
关凉粉草药材的鉴定研究多为传统的显微鉴定［5］。
2012 年，张［6］等对不同产地凉粉草进行了 ＲAPD 指
纹图谱构建和遗传相似性研究，为评估凉粉草的种
质资源的遗传多样性鉴定提供了一种有效的分子手
段，但该研究并未涉及凉粉草与混伪品的鉴别，因
此，亟须寻找一种准确、快速的凉粉草药材与混伪品
的鉴定方法。
DNA条形码技术(DNA barcoding)是指利用基
因组中一段公认的、相对较短的 DNA序列来鉴定物
种的分子技术［7-8］。近年来以其高效、准确、抗干扰
性强的鉴定特点而被广泛关注。2010 年，陈等首次
提出核基因片段 ITS2(internal transcribed spacer 2)
作为药用植物标准 DNA 条形码［9］，发现 ITS2 序列
在 6 600 份药用植物样本中扩增效率达 93. 8%，物
种水平鉴定成功率高达 92. 7%，并随后在此基础上
建立了以 ITS2 为核心、psbA-trnH 为辅的中药材
DNA条形码鉴定体系和分子鉴定指导原则［10-12］，为
DNA条形码技术在中药材鉴定领域的应用和发展
提供了扎实的数据基础和可行的方法学指导。目
前，DNA条形码技术已经稳定地用于秦艽［13］、羌
活［14］、升麻［15］和花椒［16］等众多中药材的鉴定中，也
成功实现了凉茶原料药材鸡蛋花与其混伪品的鉴
定［17］。因此，本实验选择 ITS2序列作为 DNA条形码
技术对凉茶药材凉粉草与其混伪品进行鉴定研究。
1 材 料
本实验样本共 54份，包括凉粉草(M. chinensis)
样本 26 份，常见混伪品样本 28 份，涉及物种溪黄草
(I. serra)、线纹香茶菜(I. lophanthoides)4 个变种、
灯笼草(C. polycephalum)、风轮菜(C. chinense)和
筋骨草(A. ciliata)。所有实验材料均经中国医学科
学院药用植物研究所林余霖研究员和中国科学院华
南植物所童毅华博士鉴定，凭证标本保存于中国中
医科学院中药研究所。本实验涉及 ITS2 序列 55
条，其中实验获得序列 54 条，每个物种单倍型均提
交至 GenBank 数据库并获得相应的登录号;Gen-
Bank 下 载 序 列 1 条，为 小 花 线 纹 香 茶 菜
(FJ593380)。实验样本的物种及数量、样本编号、
GenBank登录号及样本来源信息见表 1。
2 方 法
2. 1 DNA的提取
实验样本 40 ℃低温烘干处理，然后取干燥叶片
约 30 mg，用高通量组织研磨仪(宁波新芝)50 Hz研
磨 120 s，加入 800 μL 核分离液(2% PVP，20
mmol·L －1 EDTA，100 mmol·L －1 pH 8. 0 Tris-HCl，
0. 7 mol·L －1 NaCl)清洗 2 次至上清液颜色变浅，其
余参照植物基因组 DNA 提取试剂盒(Cat#DP3112，
BioTeke Corporation，China)提取方法进行。
2. 2 PCＲ扩增、测序及数据分析
ITS2 序列扩增引物 ITS2F:5-ATGCGATACTT-
GGTGTGAAT-3和 ITS3Ｒ:5-GACGCTTCTCCAGAC-
TACAAT-3。PCＲ反应体系为 25 μL:2 × Taq PCＲ
MasterMix 12. 5 μL，2. 5 μmol·L －1正反向引物各 1
μL，DNA模版 2 ～ 3 μL，其余用 ddH2 O 补足体系。
PCＲ反应程序参考陈等文献中方法进行［9］。PCＲ
产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，经纯化用 ABI
3730 测序仪完成双向测序。测序结果运用 Codon-
Code Aligner 4. 2. 7 软件进行序列校对和拼接，采用
基于隐马尔科夫模型的 HMMer注释方法去除 5. 8S
表 1 凉粉草实验样本信息表
Tab. 1 Information of the samples used in this study
Species Sample no. Voucher ID GenBank ID Sample source(in Chinese)
Mesona chinensis 26 YC0757MT01-26 KM280868 Guangdong(广东) ，Guangxi(广西) ，Fujian(福建) ，Jiangxi(江西) ，Hain-
an(海南)
Isodon serra 6 YC0760MT04-09 KM280859-61 Guangdong(广东)
I. lophanthoides var. lophanthoides 2 YC0758MT01-02 KM280864-65 Guangdong(广东)
I. lophanthoides var. graciliflorus 6 YC0759MT03-08 KM280862-63 Guangdong(广东)
I. lophanthoides var. gerardianus 2 YC0759MT01-02 KM280869-70 Guangdong(广东)
I. lophanthoides var. micranthus 1 － FJ593380 GenBank
Clinopodium polycephalum 4 YC0617MT01-04 KM280857 Hunan(湖南) ，Anhui(安徽)
C. chinense 4 YC0759MT01-04 KM280858 Henan(河南) ，Anhui(安徽)
Ajuga ciliata 4 YC0321MT03，07-09 KM280866-67 Guangdong(广东) ，Chongqing(重庆)
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rＲNA 和 28S rＲNA 区［18］，获得完整的 ITS2 序列。
应用 MEGA5. 1 软件进行基于 K2P(Kimura 2-param-
eter)模型的遗传距离分析和分子系统进化 NJ
(Neighbor-Joining)树构建［19］。
3 结 果
3. 1 凉粉草及其混伪品 ITS2 序列特征
本实验共包含 ITS2 序列 55 条。序列分析结果
(表 2)表明，采自广西、广东、江西、福建和海南等不
同主产地的 26 份凉粉草样本 ITS2 序列长度均为
232 bp，序列完全一致，种内尚未发现变异位点，有 1
种单倍型(haplotype) ，同 KM280868;此外，溪黄草
种 ITS2 序列长度为 213 bp，种内发现 2 个变异位
点，单倍型有 3 种，分别为 KM280859-61;线纹香茶
菜 4 个变种 ITS2 序列长度为 222 ～ 229 bp，种内发
现 0 ～ 1 个变异位点;灯笼草、风轮菜 ITS2 长度均为
243 bp，种内未发现变异位点;筋骨草 ITS2 序列长
度为 230 bp，种内发现 1 个变异位点。实验获得
ITS2 序列的 GC 含量为 62. 5%～ 73. 3%不等，均大
于 60%。
3. 2 凉粉草与混伪品的鉴别
本实验通过遗传距离和 NJ 树 2 种分析方法考
察 ITS2 序列是否适用于凉粉草及其混伪品的鉴定。
遗传距离分析结果表明，不同产地的 26 条凉粉草
ITS2 序列种内遗传距离为 0，而凉粉草与各个混伪
品的种间遗传距离范围为 0. 210 2 ～ 0. 310 9，平均
遗传距离为 0. 264 3(表 3)。因此，凉粉草种内遗传
距离 0 远小于其与混伪品物种间的最小遗传距离
0. 210 2。同时，选取凉粉草及其混伪品物种所有
ITS2 序列的单倍型序列共 15 条构建分子进化 NJ
树进行物种聚类分析(图 1) ，结果表明，凉粉草 ITS2
序列独成一支，能够与混伪品物种明显区分;线纹香
表 2 凉粉草及其混伪品的 ITS2 序列特征
Tab. 2 Characteristics of ITS2 sequences of Mesona chinensis
and its adulterants
Species
Sequence
length /bp
Average GC
contents /%
No. of intraspecific
variable site
Mesona chinensis 232 62. 5 0
Isodon serra 213 68. 4 2
I. lophanthoides var. lophanthoides 229 71. 0 1
I. lophanthoides var. graciliflorus 223 72. 0 1
I. lophanthoides var. gerardianus 223 71. 9 1
I. lophanthoides var. micranthus 222 72. 1 0
Clinopodium polycephalum 243 73. 3 0
C. chinense 243 73. 3 0
Ajuga ciliata 230 64. 6 1
茶菜 4 个变种、溪黄草、灯笼草与风轮菜、筋骨草各
自聚为一大支，枝上支持率均为 100%。因此，应用
ITS2 序列能够准确鉴别药材凉粉草与其混伪品。
4 讨 论
凉粉草是我国常用的药食两用植物资源，也是
凉茶饮料的主要原料之一，具有重要的药用和经济
价值，因此凉粉草药材的正品鉴定显得尤为重要。
本实验应用基于 ITS2 序列的 DNA 条形码技术对药
材凉粉草及其常见混伪品进行分子鉴定。
基因组 DNA提取是 DNA条形码技术鉴定的基
础。由于凉粉草富含挥发油和多酚多糖类物质［1］，
本实验首先对其 DNA 提取方法进行了优化。一是
用核分离液清洗研磨好的样品粉末 2 ～ 4 次，去除色
素;二是在 DNA 提取液中加约 5%体积的 PVP-40，
去除多糖多酚类物质。实验结果表明，经上述改良
后凉粉草的 DNA 提取效率大大提高。本实验涉及
凉粉草及其混伪品共 5 个物种和 4 个变种，PCＲ 结
果表明，ITS2 扩增效率达到 100%。序列比对结果
表明，不同产地凉粉草的 26 条 ITS2 序列种内暂未
表 3 凉粉草及其混伪品的种内种间遗传距离
Tab. 3 Intra- and inter-specific distances of Mesona chinensis
and its adulterants
Species K2P genetic distances(average)
Mesona chinensis ＆ M. chinensis 0
M. chinensis ＆ Isodon serra 0. 210 2 －0. 216 3(0. 215 3)
M. chinensis ＆ I. lophanthoides var. lophanthoides 0. 246 3 －0. 253 1(0. 249 7)
M. chinensis ＆ I. lophanthoides var. graciliflorus 0. 261 4(0. 261 4)
M. chinensis ＆ I. lophanthoides var. gerardianus 0. 261 4(0. 261 4)
M. chinensis ＆ I. lophanthoides var. micranthus 0. 255 4(0. 255 4)
M. chinensis ＆ Clinopodium polycephalum 0. 302 2(0. 302 2)
M. chinensis ＆ C. chinense 0. 302 2(0. 302 2)
M. chinensis ＆ Ajuga ciliata 0. 310 9(0. 310 9)
M. chinensis ＆ all adulterants 0. 210 2 －0. 310 9(0. 264 3)
图 1 基于 ITS2 序列的凉粉草及其混伪品 NJ树
Fig. 1 Neighbor-joining (NJ)tree based on ITS2 sequences of
Mesona chinensis and its adulterants
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发现变异位点，只有 1 种单倍型，为凉粉草 DNA 条
形码鉴定提供了数据基础。进一步评估 ITS2 序列
对凉粉草与其混伪品的鉴定能力，K2P 遗传距离分
析表明，基于 ITS2 序列的凉粉草种内遗传距离为 0，
远小于其与混伪品的种间最小遗传距离 0. 210 2，根
据最小距离法判定，ITS2 序列能够准确鉴别药材凉
粉草及其混伪品。NJ 树结果表明，凉粉草独成一
支，表现出很好的单系性，能与其混伪品明显区分，
这也再次证明了 ITS2 序列在不同属物种中具有很
高的鉴别力［9］。此外，NJ 树结果还发现，在凉粉草
的混伪品物种中，香茶菜属的溪黄草与线纹香茶菜
能很好区分;风轮草属的灯笼草与风轮菜聚为一支，
亲缘关系最近;细花线纹香茶菜和狭基香茶菜两个
变种聚为一支，表明这两个变种亲缘关系很近，高蝶
娜等［20］的研究发现，psbA-trnH序列也不能将这两个
变种区别，这证明 ITS2 序列虽然能准确鉴别凉粉草
与其混伪品，但对变种及种下等级的物种鉴别可能
还需寻找特异序列。
综上所述，基于 ITS2 序列的 DNA 条形码技术
能够准确、稳定地鉴别凉粉草与其混伪品溪黄草、线
纹香茶菜 4 个变种、灯笼草、风轮菜和筋骨草，为凉
茶药材凉粉草提供了简单、快速的分子鉴定手段。
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