全 文 ：麻花艽愈伤组织培养过程中龙胆苦苷含量的变化
王海涛，尹 瑶，何 涛*
(青海大学生态环境工程学院 /青海大学高原作物种质资源创新与利用国家重点实验室培育基地，青海 西
宁 810016)
摘要 目的:研究麻花艽愈伤组织培养过程中龙胆苦苷含量的变化，为通过愈伤组织培养或细胞悬浮培养生
产龙胆苦苷奠定基础。方法:通过生物量测定，确定愈伤组织的生长曲线;采用染色体压片和原生质体观察，确定
不同生长时期愈伤组织中的细胞分裂指数;并通过 HPLC 法测定不同生长时期愈伤组织中龙胆苦苷的含量。结
果:愈伤组织生长曲线呈“S”型，生长周期为 33 d，可分为 4 个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰退期;每一
时期的细胞分裂指数分别为 22. 18%、54. 23%、67. 55%和 26. 97%，各时期对应的龙胆苦苷含量分别为 7. 92、
15. 01、25. 02 和 14. 04 mg /g DW。结论:龙胆苦苷的积累与愈伤组织的增殖呈同步趋势，在稳定期达到最大值。
关键词 麻花艽;愈伤组织培养;细胞分裂指数;龙胆苦苷
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)03-0372-03
收稿日期:2013-10-04
基金项目:国家自然科学基金(30960161，31360095);国家重点实验室培育基地开放课题(2011-02)
作者简介:王海涛(1987-)，男，在读硕士研究生，专业方向:药用植物细胞工程;Tel:0971-5310086，E-mail:wanghaitao6488@ 126． com。
* 通讯作者:何涛，Tel:0971-5310086，E-mail:hetaoxn@ yahoo． com。
麻花艽 Gentiana straminea Maxim. 又名“麻花
秦艽”，为龙胆科龙胆属多年生草本植物。主要分
布于青海、西藏、甘肃、四川等省区，生长在海拔
2 500 ～ 4 700 m 的山坡、河滩、草地和灌丛〔1〕。以根
和花入药，具有清热利胆、舒筋止痛的作用，主要用
于治疗风湿性关节炎、低热、肺结核和黄疸型肝炎等
症〔2〕。龙胆苦苷是麻花艽的重要活性成分之一。
目前，已开发出片剂和针剂，用于临床，疗效显著。
近年来，由于临床用药量的增加和过度采挖，加之种
子萌发率低，造成麻花艽野生资源日趋减少。因此，
对麻花艽开展细胞工程研究则显得尤为重要。
植物细胞培养(Plant cell culture)技术，由于不
受季节限制，生长周期短，且可在人工控制条件下获
得大量有用次生代谢产物等优点，从而成为解决植
物野生资源不足的一种有效手段，并在药用植物的
保护和利用上得到了广泛的应用〔3〕。目前，已有上
百种药用植物通过这一技术进行了细胞培养研究，
其中就包括一些重要的龙胆科植物〔4-8〕。尽管作为
一种珍稀的药用植物，但有关麻花艽组织培养的研
究还比较少〔9，10〕，而对其培养细胞中次生代谢产物
的研究笔者尚未见报道。为此，该研究以本实验室
已建立的麻花艽愈伤组织细胞系为试验材料，探讨
愈伤组织生长过程中龙胆苦苷含量的变化，旨在为
通过愈伤组织培养或细胞悬浮培养生产龙胆苦苷奠
定基础。
1 材料
供试材料为本实验室已建立的麻花艽愈伤组织
细胞系 CL2011(图 1)，它选自种子萌发无菌苗叶片
外植体脱分化产生的愈伤组织〔11〕。麻花艽 Genti-
ana straminea Maxim. 的成熟种子由中国科学院西
北高原生物研究所提供，采自青海省海北州。
龙胆苦苷对照品(批号:110770-201013)购自中
国食品药品检定研究院。
图 1 麻花艽愈伤组织细胞系
2 方法
2. 1 麻花艽愈伤组织生长的测定 参考 He 等〔11〕
的方法，将麻花艽愈伤组织细胞系 CL2011 转移到
含有 0. 5 mg /L 2，4-D、附加 3%蔗糖和 0. 85%琼脂
的 MS固体培养基上，置于(20 ± 2)℃、光照强度 30
μmol /(m2·s)和光照时间 16 h /d 条件下培养。每
3 d对愈伤组织生物量(鲜重)进行测定，绘制生长
曲线。
2. 2 不同生长时期愈伤组织中细胞分裂指数的测定
2. 2. 1 染色体压片法:分别取不同生长时期的麻
花艽愈伤组织，用卡诺固定液固定，卡宝品红染色，
常规染色体压片，显微镜观察，统计细胞分裂指数。
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.03.012
细胞分裂指数(%)=(分裂细胞数 /观察细胞总数)×
100%
2. 2. 2 原生质体观察法:分别取不同生长时期的
麻花艽愈伤组织，酶法分离原生质体，显微镜观察，
统计细胞分裂指数。
2. 3 不同生长时期麻花艽愈伤组织中龙胆苦苷含
量的测定
2. 3. 1 色谱条件:色谱柱为 Waters 2998 system
(150 mm × 4. 6 mm，5 μm);流动相为甲醇-水
(1∶ 4)，流速为 1. 5 mL /min，检测波长 254 nm，进样
量 5 μL，柱温 25 ℃。
2. 3. 2 对照品溶液的制备及标准曲线的绘制:精
密称取龙胆苦苷对照品 0. 03 g，用色谱级甲醇定容
至 10 mL量瓶中，作为储备液，使用时稀释成梯度为
0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 和 3. 0 mg /mL的溶液。在上
述色谱条件下依次进样，以龙胆苦苷浓度为横坐标，
峰面积为纵坐标，计算回归方程。
2. 3. 3 供试样品溶液的制备:分别取不同生长时
期的麻花艽愈伤组织，于 100 ℃烘干 50 min，研成粉
末，分别称取 30 mg，加入 3 mL甲醇，室温超声处理
1 h，提取物用 0. 22 μm 微孔滤膜过滤，滤液转至离
心管中备用。
2. 4 统计分析 采用 SPSS 软件统计，每一试验重
复 3 次。
3 结果与分析
3. 1 麻花艽愈伤组织的生长动态 麻花艽愈伤组
织经继代后，每 3 d取 1 次样，测定愈伤组织的生物
量，结果见图 2。
图 2 麻花艽愈伤组织生长曲线
如图 2 所示，麻花艽愈伤组织生长曲线基本上
呈“S”型，可分为 4 个时期:延滞期、对数生长期、稳
定期和衰退期。其中，1 ～ 9 d 为延滞期，该期愈伤
组织生长缓慢，可能是刚接种的愈伤组织尚未完全
适应新的环境，不能很好吸收营养物质的结果;9 ～
24 d 为对数生长期，细胞生长迅速，该阶段愈伤组
织鲜重净增长了 7. 36 g;24 d后，愈伤组织的生物量
达到最大值，净增长开始减缓并趋于停止，进入到稳
定期;33 d 以后，由于生物量的增加以及代谢废物
的增加，加上培养基中养分几乎消耗殆尽，阻碍了愈
伤组织的生长，愈伤组织开始褐化直至死亡。
3. 2 不同生长时期愈伤组织中细胞的分裂指数
通过染色体压片和原生质体观察(图 3)，对不同生
长时期愈伤组织中细胞的分裂指数进行了研究，结
果见表 1。
在实际观察中，由于染色体压片时，经常会出现
细胞重叠、解离不充分等问题，导致统计的细胞分裂
指数误差较大。为此，本实验用含有纤维素酶、半纤
维素酶和果胶酶的混合酶液处理愈伤组织，游离出
原生质体，再统计细胞分裂指数，取得了较好的效
果。
如表 1 所示，在 2 种测定方法中，细胞分裂指数
的变化趋势是一致的。延滞期的细胞处于适应新环
境状态，生长比较缓慢，平均分裂指数为 22. 18%;
对数期由于营养充足，空间较大，细胞快速增长，细
胞分裂指数为 54. 23%;稳定期细胞分裂指数为
67. 55%，增长细胞基本等于死亡细胞，细胞总数不
再发生变化;到了衰退期，由于细胞及代谢废物的增
加，阻碍了细胞分裂，这一时期细胞平均分裂指数为
26. 97%。从整体上看，愈伤组织细胞的分裂指数先
上升后下降，与生物量的增长是一致的。
图 3 麻花艽愈伤组织中细胞分裂的观察
A. 染色体压片 B. 原生质体观察
表 1 不同生长时期麻花艽愈伤组织中细胞分裂指数(%)
生长时期 染色体压片 原生质体观察
平均分裂
指数
延滞期 25. 24 ± 3. 11 19. 12 ± 1. 65 22. 18
对数生长期 49. 45 ± 1. 69 58. 01 ± 1. 94 54. 23
稳定期 66. 67 ± 1. 64 68. 42 ± 3. 04 67. 55
衰退期 31. 66 ± 2. 72 22. 27 ± 2. 82 26. 97
3. 3 不同生长时期麻花艽愈伤组织中龙胆苦苷的
含量 通过 HPLC法对不同生长时期麻花艽愈伤组
织中龙胆苦苷的含量进行了测定，结果见表 2。
在麻花艽愈伤组织生长之初，龙胆苦苷就已经
开始合成;以后，随着愈伤组织的生长，龙胆苦苷含
量逐渐增加，生长到 33 d 后，龙胆苦苷含量开始下
降。在 4 个生长时期中，龙胆苦苷含量分别为
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7. 92、15. 01、25. 02 和 14. 04 mg /g DW。其中，稳定
期时，龙胆苦苷含量最高。因此，从麻花艽愈伤组织
中提取龙胆苦苷的最优时间为接种后 27 ～ 33 d。
表 2 不同生长时期麻花艽愈伤组织中龙胆苦苷含量
生长时期 龙胆苦苷含量 /(mg /g，干重)
延滞期 7. 92 ± 2. 14
对数生长期 15. 01 ± 1. 87
稳定期 25. 02 ± 1. 23
衰退期 14. 04 ± 3. 36
4 讨论
在麻花艽愈伤组织培养过程中，龙胆苦苷的积
累与愈伤组织的生长呈同步趋势，即先增加后下降，
这一结果与侯茜等〔8〕在大叶秦艽 Gentiana macro-
phylla Pall. 中的研究一致。Mcgarvey 等〔12〕指出，龙
胆苦苷是一种类单萜物质，它是在植物质体中合成
的，包括叶绿体。笔者推测，麻花艽愈伤组织中龙胆
苦苷的合成直接与细胞中质体的发育程度有关。在
愈伤组织培养初期，细胞中质体数量少且发育不完
全，此时龙胆苦苷的合成量较少;随着愈伤组织的生
长，质体逐渐发育成熟且数量增多，龙胆苦苷开始大
量合成;到了衰退期，由于细胞大量死亡，加之龙胆
苦苷的氧化或酶解，导致龙胆苦苷含量急剧降低。
本研究中，龙胆苦苷含量在稳定期达到最大值，
为 25. 02 mg /g DW，略高于麻花艽亲本植株 23. 4
mg /g DW的含量〔13〕。这一结果建议，利用愈伤组
织培养技术来提取麻花艽药用有效成分是可行的。
同时，在已建立的麻花艽愈伤组织细胞系的基础上，
通过细胞株的筛选、诱导子的添加、培养条件的优化
等措施，进一步提高细胞培养物中龙胆苦苷的含量，
为大规模细胞培养生产龙胆苦苷奠定技术基础。
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2013．
《中药材》杂志为中国科技核心期刊。
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