全 文 ：第 2期
2006年 3月 华东师范大学学报(自然科学版)Journal of East China Normal Unive rsity (Natural Science)
No. 2
Mar. 2006
　收稿日期:2004-12
　基金项目:国家“十五”“ 211 工程”重点学科建设子项目
　第一作者:朱慧(1968 -),女 ,副教授.
　通讯作者:陈季武 , 男 ,副教授.
文章编号:1000-5641(2006)02-0136-05
*简报*
留兰香非精油组分清除自由基和活性氧的研究
朱　慧 , 　陈季武 , 　胡　斌 , 　秦海燕 , 　张　军
(华东师范大学 生命科学学院 , 上海　200062)
中图分类号:Q 505　　文献标识码:A
　　越来越多的疾病如肿瘤 、炎症 、白内障 、糖尿病和心脑血管疾病的发生与发展 ,经研究证明与自由基直
接或间接作用有关[ 1 ～ 2] .为了减轻或消除过量自由基对人体的损伤 , 急需筛选天然无毒的自由基清除剂.
因此 ,从植物中寻找清除自由基的有效药物已引起国内外广泛重视.
我国有丰富的植物资源 ,留兰香就是其中引人注目的一员.留兰香又名绿薄荷 、香花菜 ,为唇形科薄荷
属植物 Mentha S picat L 的全草 , 是一种芳香植物 , 味辛甘 , 性微温 , 为辛凉解表之品 , 主要以香料用于糖
果 、饮料 、牙膏和烟草中 ,也供医药用 , 作驱风及芳香兴奋药.药理研究表明:留兰香具有疏风理气 、抗炎 、止
血 、杀菌 、抗虫和止痛的活性[ 3 ～ 4] .正因为留兰香有如此多的食用价值和药用功效 ,所以留兰香得到了较多
的研究 ,但研究主要集中于留兰香精油组分 , 尚未重视研究留兰香非精油组分 , 更未见到留兰香非精油组
分清除自由基和抗氧化的报道.为此 , 本研究以留兰香非精油组分为材料 ,采用六种化学发光体系和两种
比色体系 ,检测留兰香非精油组分清除多种自由基 、活性氧以及对 DNA 的保护作用. 旨在从自由基生物学
的角度探讨留兰香抗氧化和抗病的机理 ,为进一步开发利用留兰香提供新的实验依据.
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　试剂　鲁米诺(3-氨基邻苯二甲基酰肼)、黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶系 Sigma 产品;二苯代苦味肼基自
由基(DPPH )系日本东京化成工业株式会社产品;DNA 系上海东方仪器公司生化部产品;其余试剂均系
国产分析纯.
1. 1. 2　药物　留兰香非精油组分(the components o f none ssential oils in Mentha spicata L. , CNOM SL),
由上海交通大学陈灵和姚雷教授惠赠.
1. 1. 3　仪器　SHG-1 型生物化学发光测量仪(上海技术监督局工厂产品);721 型紫外可见分光光度计
(上海第三分析仪器厂).
1. 2　实验方法
1.2.1　DNA损伤的化学发光体系　按文献[ 5]报道,采用 Vit. C-CuSO4-H2O2-Phen-DNA的化学发光体系.
1. 2. 2　H 2O 2 的化学发光体系　按文献[ 6] 报道 ,采用 H2O2-鲁米诺-OHˉ 化学发光体系.
1. 2. 3　二苯代苦味肼基自由基(DPPH )比色体系　按文献[ 7]报道操作 ,其抑制率为
抑制率(%)=(A 0 - A样) / A 0×100%.
其中 , A0为2. 5 mL DPPH 乙醇溶液与 0. 5 mL 三蒸水混合液在517 nm 处吸光值;A样为 2. 5 mL DPPH
第 2 期 朱慧 ,等:留兰香非精油组分清除自由基和活性氧的研究
乙醇溶液与 0. 5 mL试样混合液在 517 nm 处吸光值.
1. 2. 4　产生 O 2 的化学发光体系　一是按文献[ 8] 报道 ,采用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-鲁米诺产生 O 2 的化
学发光体系.体内如心脏往往存在较多的黄嘌呤氧化酶 ,体内代谢过程中也会产生大量的黄嘌呤或次黄嘌
呤 ,所以黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶催化下产生 O 2 ;二是按文献[ 9]报道 , 采用邻苯三酚自氧化产生 O 2 的化学
发光体系 ,这是一种非酶类反应体系.
1. 2. 5　产生 OH 的化学发光体系　按文献[ 10] 报道 ,采用 CuCl-Phen-H 2O 2 产生 OH 的化学发光体系 ,方
法上稍加修改:在测量管中分别加入 50μL 2×10 - 3 mol / L CuCl溶液 , 50 μL 1. 5×10 - 3 mol / L邻菲罗啉和
800 μL 不同浓度的样品溶液 (对照管以碳酸缓冲液代替), 测本底值 ,然后加入 100μL 1%浓度的 H2O2启
动发光 ,延迟 10 s后测 CP10 s ,绘发光动力学曲线并计算抑制率.
1. 2. 6　Fe2+诱发脂蛋白 PUFA 过氧化比色体系　按文献[ 11]报道 , 采用以 Fe2+诱发卵黄磷脂 C-2 位上的
极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)过不饱和脂肪酸(PUFA)的过氧化模型.
1. 2. 7　羟氨自氧化产生过氧亚硝基的化学发光体系　按文献[ 12]报道 , 其操作步骤如下:配成 100 m L羟
胺为 0. 01 mol /L , NaOH 为 0. 5 mol / L , EDTA 为 0. 001 mo l /L的反应液 , 20 ℃激烈搅拌约 2 ～ 3 h ,使体系
产生过氧亚硝基[ 12] , 至其 302 nm 吸收峰达到最大值后停止搅拌 ,将混合液用 MnO 2粉末于冰浴中过滤 ,以
消除过氧化氢对实验的影响. 然后取0. 1 m L药物与 0. 86 mL , 0. 1 mol / L(pH 10)的碳酸缓冲液混匀 , 加40
μL过氧亚硝基溶液启动发光 ,延迟 10 s后测 CP10 s 的发光.
2　结　　果
2. 1　留兰香非精油组分对 OH 引起的 DNA 损伤的保护作用
CuSO4-Phen-VitC-H2O 2-DNA化学发光体系生成 OH , OH 损伤 DNA , 产生一晚于 Phen 本身氧化发
光信号的迟滞化学发光 ,该发光峰代表 DNA 损伤产物发光 ,实验结果如图 1 ～ 2 所示.从图 1 可以看出 ,留
兰香非精油组分能使发光峰明显下降 ,峰位明显后移 , 且浓度越大 , 作用越强. 峰值下降 ,说明留兰香非精
油组分能有效抑制 DNA 损伤 ,即作用于链反应之前的过程 ,清除了启动链反应的活性物质 OH , 因此 , 留
兰香非精油组分在该体系中起到了预防型抗氧化剂的作用;峰位后移 , 说明留兰香非精油组分能延迟
DNA 损伤 ,即清除了链延伸自由基 , 起到了断链型抗氧化剂的作用.
图 1　留兰香非精油组分对 OH 引起 DNA 损伤的保护作用
留兰香非精油组分浓度(μg /mL):a:0;b:1;c:2;d:5;e:10
Fig. 1　Effect of CNOMS L on preventing DNA damage caused by OH .
The concentration o f CNOMSL(μg /mL):a:0;b:1;c:2;d:5;e:10
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2. 2　清除 H2O2 的作用
H2O2 能在有氧和碱性条件下氧化鲁米诺产生化学发光.而留兰香非精油组分能明显抑制本体系的化
学发光 ,其抑制发光 50 %的浓度(IC50)为 50 ng /m L , 所以低浓度的留兰香非精油组分就能有效地清除
H2O2(如图 3 所示).
2. 3　清除 DPPH 的作用
DPPH 是一种稳定的有机自由基 ,国外已把此体系作为筛选抗氧化剂的体系[ 13] .本实验表明 ,留兰香非精
油组分能有效地清除 DPPH ,且对 DPPH 的清除作用呈量效关系,其 IC50为44. 32 μg /mL(见表1).
表 1　留兰香非精油组分对 DPPH 的清除作用
Tab. 1　Effect o f CNOMSL on scavening DPPH
留兰香非精油组分 /μg 0 5 10 25 50
A 532值 0. 54±0. 001 0. 53±0. 00 0. 50±0. 003 0. 40±0. 005 0. 21±0. 001
抑制率 /% 0 1. 85 7. 41 25. 93 61. 11
2. 4　清除 O 2 的作用
如图 4 所示 ,留兰香非精油组分能明显抑制由黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-鲁米诺产生的 O 2 所引起的化学
发光 ,量效关系显著 , 其 IC50约为 0. 065 μg /mL.
如图 5 所示 ,留兰香非精油组分能清除邻苯三酚自氧化所释放的 O 2 ,其 IC50为约为 440 μg /mL , 且量
效关系显著 ,表明留兰香非精油组分能比较有效地清除 O 2 .
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第 2 期 朱慧 ,等:留兰香非精油组分清除自由基和活性氧的研究
图 6　留兰香非精油组分清除 OH 的作用
F ig . 6　Effec t o f CNOMSL on scavenging OH
　　由于留兰香非精油组分在黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-
鲁米诺体系中清除 O 2 的作用远大于邻苯三酚自氧化
体系中的清除 O 2 的作用 ,表明留兰香非精油组分不仅
能直接清除 O 2 ,而且可通过抑制黄嘌呤氧化酶来消除
O 2 .
2. 5　对 OH 的清除作用
如图 6 所示 ,在 CuCl-Phen-H2O 2 产生 OH 的化学
发光体系中 ,留兰香非精油组分能有效地清除 OH , 随
着留兰香非精油组分浓度的增加 ,清除的作用增强 , 量
效关系显著 ,其 IC50约为 27. 5 μg /mL.
2. 6　抑制脂质抗氧化作用
目前一般认为 ,本体系氧化机理是 Fe2+使 LOOH
进一步氧化产生 LO 和 LOO ,再引发 PUFA 发生链式反应 , 导致脂质过氧化[ 11] . 留兰香非精油组分的 IC50
约为 190μg /mL 左右 ,可见留兰香非精油组分在一定浓度下能有效地抑制 Fe2+诱发的脂蛋白 PUFA 过氧
化 ,且量效关系明显(如表 2 所示). 提示留兰香非精油组分是通过清除 LO 和 LOO 而抑制 PUFA 过氧化
的.
表 2　留兰香非精油组分抗脂质过氧化作用
Tab. 2　Effect o f CNOMSL on inhibiting lipid per oxidation
留兰香非精油组分 /μg 0 100 200 500 1000
A 532值 1. 095±0. 007 0. 85±0. 15 0. 53±0. 04 0. 47±0. 01 0. 34±0. 03
AOA /% 0 22. 37 51. 60 57. 08 68. 95
2. 7　对于过氧亚硝基的清除抑制作用
从图 7 中可以看出 ,在羟氨自氧化产生过氧亚硝基(ONOO_)的体系中 ,留兰香非精油组分能十分有效
地清除 ONOO_ ,清除率随浓度增大而增大 ,其 IC50约为 2. 1 μg /m L.
3　讨　　论
图 7　留兰香非精油组分清除过氧化硝基的作用
Fig. 7　Effect of CNOMSL on scaveng ing ONOO_
活性氧是一类化学性质非常活泼的含氧物质 , 包
括 OH , O 2 , H2O2和 LOOH 等.在正常代谢情况下 , 机
体会产生低水平自由基 , 由体内的抗氧化酶或抗氧化
剂维持自由基代谢平衡.当机体失衡时 ,往往会产生过
量的自由基和活性氧 , 造成蛋白质变性 、酶失活 、DNA
降解 、生物结构受损和最终导致机体病变. 所以人类的
多种疾病 ,包括癌症 、炎症 、帕金森症和老年痴呆症以
及衰老都与自由基和活性氧有密切关系[2 , 14] . 例如 , 在
炎症反应时 , 均有 O 2 等自由基产生 , 急性炎症中 O 2
等自由基含量增加高于慢性炎症[ 14] . 本研究表明 , 留兰
香非精油组分能有效地清除 O 2 等自由基 ,所以提示留
兰香防治炎症等几种疾病的机理之一可能就是留兰香
非精油组分有效地清除自由基和活性氧的作用. 这为留兰香非精油组分的药理研究增加了新的资料.
有文献报道 ,脂质过氧化损伤与肿瘤和衰老等疾病的发生和发展密切相关[ 2] . 而 DNA 的氧化损伤在
癌症和衰老等疾病的发生和发展过程中起着重要的作用 , OH 一直被认为是引起 DNA 损伤的重要因素 ,
脂质过氧化在自由基介导的 DNA 损伤中的作用也不容忽视[ 5 , 15] . 本研究显示留兰香非精油组分能有效地
抑制脂质过氧化 ,抑制 OH 引起的 DNA 损伤 , 提示留兰香非精油组分能够在一定程度上减轻自由基和活
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性氧对机体的上述危害.
近年来的研究表明 ,活性氮 ON 和 ONOO_等对机体造成的损伤 , 主要是由 ONOO_所引起的 , 从某种
意义上说 , 强氧化剂 ONOO_的危害性高于 OH [ 16] ,而留兰香非精油组分能有效地清除 ONOO_ , 可减轻或
消除 ONOO_的危害. 由此可知 ,留兰香非精油组分能有效地清除 ONOO_ , O 2 , OH , LO , LOO , H2O2
和 DPPH 等自由基和活性氧 ,是有效的 、多功能的自由基清除剂,并具有抗脂质过氧化及保护 DNA的功能.
据文献报道 ,留兰香含有多种组分 , 包括 5-羟基-3′, 4′, 6 , 7-四甲氧基黄酮和 5 , 6 , 4′-三羟基-7 , 8 , 3′-三
甲氧基黄酮[ 4] ,这些黄酮都具有酚羟基 , 而酚羟基往往是清除自由基和活性氧的活性基团. 留兰香中究竟
哪类组分清除自由基和活性氧最有效还有待于深入研究.
上述研究结果可为进一步综合开发利用留兰香非精油组分提供理论依据.
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