全 文 ：河南农业科学，2015，44(8):92-97
Journal of Henan Agricultural Sciences doi:10． 15933 / j． cnki． 1004-3268． 2015． 08． 021
收稿日期:2015 － 01 － 20
基金项目:国家自然科学基金项目(31171982，31372090)
作者简介:李忠爱(1976 －)，女，湖北潜江人，实验师，博士，主要从事植物表观遗传学研究。E － mail:lizhongai@ henu． edu． cn
* 通讯作者:王子成(1974 －)，男，河南邓州人，教授，主要从事植物生物技术与表观遗传学研究。
E － mail:wzc@ henu． edu． cn
土霉素处理对留兰香基因组及其甲基化的影响
李忠爱，郭强梨，王子成*
(河南大学 生命科学学院 植物种质资源与遗传工程实验室，河南 开封 475004)
摘要:以留兰香为材料，研究了土霉素处理对留兰香生长发育和生理生化反应的影响，以及不同浓
度土霉素处理对留兰香基因组 DNA的甲基化水平和模式的影响。在无菌条件下，将留兰香茎段接
种到含 5 种不同浓度 0(对照)、5、10、15、20 μmol /L的土霉素处理培养基上，连续处理 14 d。基因
组 DNA用混合取样法，取 100 株组培苗嫩叶，混合并提取。用 AFLP、MSAP 的方法进行相关的分
析。结果表明，土霉素处理 14 d后，叶绿素含量随着土霉素浓度的升高逐渐降低，丙二醛(MDA)的
合成也呈下降趋势。AFLP分析表明，土霉素处理组与对照组之间未发现特异性片段。MSAP分析
表明，5、10、15、20 μmol /L 土霉素处理后，留兰香全基因组 DNA 甲基化水平分别为 14． 16%、
13． 92%、18． 84%、8． 95%，均低于对照(22． 75%);与对照相比，土霉素处理后 DNA甲基化率分别为
10． 31%、10． 87%、10． 94%、11． 34%，去甲基化率分别为 11． 86%、11． 41%、15． 63%、17． 53%。土
霉素影响了留兰香的生长发育，并引起各项生理生化指标的改变。土霉素未造成留兰香基因序列
的变异，却能引起基因组 DNA甲基化水平降低。
关键词:留兰香;甲基化;土霉素;基因组 DNA
中图分类号:Q945． 78 文献标志码:A 文章编号:1004 － 3268(2015)08 － 0092 － 06
Effects of Oxytetracycline Treatment on Genomic DNA and Its
Methylation of Menthae spicatae L．
LI Zhongai，GUO Qiangli，WANG Zicheng*
(Plant Germplasm Ｒesources and Genetic Engineering Laboratory，College of
Life Science，Henan University，Kaifeng 475004，China)
Abstract:The objectives of this research were to assess the effect of oxytetracycline treatment on the de-
velopment as well as genomic DNA methylation levels and patterns of Menthae spicatae L．． Spearmint
stems were cultured on MS medium supplied with oxytetracycline(0，5，10，15，20 μmol /L，respectively)
for 14 d． Genomic DNA was extracted from leaves． The amplified fragment length polymorphisms(AFLP)
and methylation sensitive amplification polymorphism(MSAP)were used to test the genetic and epigene-
tic stability． When Menthae spicatae L． were treated by oxytetracycline for 14 d，the chlorophyll content
were significantly reduced，whereas the MDA content increased as the concentration of oxytetracycline in-
creased． AFLP technique did not detect any sequence change． MSAP technique showed that the genomic
DNA methylation levels of Menthae spicatae L． were 14． 16%，13． 92%，18． 84%，8． 95% under 5，10，
15，20 μmol /L oxytetracycline stress，which were lower than that of the untreated plants with 22． 75%;
the ratio of methylation and demethylation of Menthae spicatae L． genomic DNA at oxytetracycline concen-
trations of 5，10，15，20 μmol /L were 10． 31%，10． 87%，10． 94%，11． 34% and 11． 86%，11． 41%，15． 63%，
17． 53% ． The growth and physiological and biochemical reactionis of Menthae spicatae L． had changed un-
第 8 期 李忠爱等:土霉素处理对留兰香基因组及其甲基化的影响
der oxytetracycline treatment． Oxytetracycline could not impact the genomic DNA sequence，however，it
could result in the reduction of DNA methylation．
Key words:Menthae spicatae L．;methylation;oxytetracycline;genomic DNA
土霉素是目前使用最多的四环素类抗生素，它
的化学结构十分稳定，因此可长时间在环境中留
存［1］，由此对生态环境造成的影响也引起了环境领
域的普遍关注。据相关报道，中国 2003 年土霉素的
生产量已达到全世界总产量的 65%［2-3］。中国对土
霉素的巨大生产和需求量，必然会导致环境中残留
的土霉素日渐增多［4-5］，最终必将对生态环境造成
不可估量的影响。对土霉素给动植物和人类造成的
影响开展广泛而深入的研究是必要而迫切的，便于
人们更进一步地了解土霉素对环境的危害，也有利
于我们对其进行监控。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式，
对基因的表达有着相当重要的调控作用，基因组甲
基化修饰程度不同会直接影响植物表型的变化［6］。
近些年的研究表明，DNA甲基化很容易受到环境因
子变化(比如盐胁迫、化学刺激、冷热刺激等逆境胁
迫)的影响［7］。研究［8-10］发现盐胁迫、冷胁迫(超低
温保存)以及重金属(镍)对植物表观遗传(DNA 甲
基化)均产生了不同程度的影响。杨金兰等［11］也发
现镉胁迫对萝卜的基因组 DNA 甲基化有一定程度
的影响。Tan 等［12］用甲基化敏感扩增多态性
(MSAP)的方法也发现了玉米基因组 DNA 甲基化
对盐胁迫的相应响应。杜亚琼［13］发现土霉素、二甲
基亚砜、甘露醇、姜黄素 4 种药品对拟南芥基因组
DNA甲基化修饰均产生了不同程度的影响。还有
研究发现，土霉素可通过提高 DNA甲基化水平来对
泡桐的丛枝病起到一定的预防作用［14-15］，四环素类
药物还可以改变一品红的分枝状况［16］，表明四环素
类药物可以对植物的遗传产生某些特定的影响。另
外，在拟南芥的培养基中添加土霉素，也可以导致其
基因组 DNA甲基化发生明显的减少［17］。
目前，人们对于薄荷属植物的相关研究开展得
比较少。有人研究了薄荷属植物花粉形态［18］。有
人对留兰香精油的加工工艺和副产品的综合利用进
行了一些研究［19］。陈小华［20］在 2013 年做了薄荷
品种资源遗传多样性研究及优异种质评价。但是关
于薄荷属植物表观遗传方面的研究还相当少，郭强
梨等［8-9］通过 MSAP 方法分析了薄荷属留兰香的表
观遗传变异，研究了在超低温保存和盐胁迫处理下
的留兰香基因组甲基化变异情况。
近年来，AFLP 技术被广泛地应用于分析同一
种或属间的不同品种的差异性及亲缘关系。梁呈
元［21］用 ISSＲ、AFLP等分子标记技术分析了薄荷属
的 30 多个物种之间的差异。MSAP是在 AFLP技术
的基础上建立起来的，用对甲基化敏感的 MspⅠ和
HapⅡ代替 AFLP分子标记中的高频酶 MseⅠ，可用
来分析基因组 DNA 的甲基化变化。本研究以留兰
香(Menthae spicatae L．)为材料，对其试管苗的茎段
进行土霉素胁迫处理，观察生长发育并采用 AFLP、
MSAP检测处理前后材料的基因组 DNA 变异情况
及基因组 DNA甲基化水平变化情况，为从分子方面
探讨土霉素对植物表观遗传的影响提供新的实验
依据。
1 材料和方法
1． 1 材料
以本实验室自繁的留兰香幼苗为试验材料，选
用继代培养基 MS + 0． 2 mg /L 6 － BA + 0． 02 mg /L
NAA进行增殖培养，pH 值 5． 8，培养温度(25 ±
2)℃，光照时间 12 h /d。
1． 2 方法
1． 2． 1 土霉素胁迫处理 无菌条件下，将留兰香茎
段接种到 0、5、10、15、20 μmol /L的土霉素处理培养
基上，连续处理 14 d。
1． 2． 2 生长及生理生化指标的测定 用直尺测量
茎段长度(即株高)取平均值。叶绿素含量的测定
采用乙醇法［22］;丙二醛(MDA)含量的测定采用硫
代巴比妥酸法［22］。
1． 2． 3 留兰香基因组 DNA的提取 采用 CTAB 法
提取 DNA，参考 Micheli等［23］的方法并略作改动。
1． 2． 4 AFLP分析 AFLP分析参照 Hao等［24］的方
法，略作改动。
1． 2． 5 MSAP分析 MSAP 分析参照 Cervera 等［25］
和李雪林等［26］的方法，并略作改动。
2 结果与分析
2． 1 土霉素胁迫对留兰香生长发育的影响
如图 1 所示，土霉素处理对留兰香的生长产生
明显的抑制作用，茎段生长受抑制的程度随着土霉
素处理浓度的升高而增强。
2． 2 土霉素胁迫对留兰香生理指标的影响
2． 2． 1 叶绿素含量 随着土霉素浓度逐渐增高，
39
河南农业科学 第 44 卷
留兰香叶片由绿色逐渐变为黄绿色。逆境胁迫会
导致植物叶片中叶绿素的破坏与降解［12-13］。由图
2 可知，随着土霉素浓度的升高，叶绿素含量呈降
低趋势。
图 1 土霉素胁迫对留兰香株高的影响
图 2 土霉素胁迫对留兰香叶绿素含量的影响
2． 2． 2 MDA含量 植物在逆境条件下，常会发生
膜脂的过氧化作用，MDA 则是其产物之一，因此
MDA含量多少表明植物对逆境条件反应的强
弱［14］。由图 3 可知，随着土霉素浓度的升高，MDA
含量呈上升趋势，表明土霉素使留兰香茎段的膜脂
过氧化程度增强。
2． 3 土霉素胁迫下留兰香基因组的 AFLP分析
土霉素处理 14 d后，用混合提取法提取叶片 DNA
用于 AFLP检测。6 对引物组合共扩增出 735 条可统
计的条带(图 4)，这些条带中未出现多态性位点，说明
对照与处理组之间的基因组序列保持一致，土霉素胁
迫未诱导出本方法可以检测到的遗传变异。
图 3 土霉素胁迫对留兰香 MDA含量的影响
0—4 依次表示 0、5、10、15、20 μmol /L的土霉素处理
图 4 土霉素胁迫下基因组 AFLP分析电泳谱带
2． 4 土霉素胁迫下留兰香基因组的 MSAP分析
2． 4． 1 土霉素胁迫引起的 DNA甲基化水平的变化
为了检测不同浓度的土霉素对留兰香基因组
DNA甲基化模式的影响，本试验利用 16 对引物组
合，共扩增出 1 066 条带。4 种不同浓度的土霉素均
引起留兰香全基因组 DNA 胞嘧啶甲基化水平的降
低，而且全甲基化比率高于半甲基化比率(表 1)。
由此推测，在土霉素胁迫下，留兰香全基因组 CCGG
位点发生甲基化的方式主要是以双链全甲基化
(CmCGG)为主。另外，留兰香全基因组 DNA 甲基
化水平和盐浓度之间存在显著的剂量效应，即随着
土霉素浓度的升高，留兰香全基因组 DNA甲基化水
平呈下降趋势。MSAP电泳部分图谱见图 5，带型分
布如表 2 所示。
表 1 不同浓度土霉素处理对留兰香基因组 DNA甲基化水平的影响
土霉素浓度
/(μmol /L)
类型Ⅰ /条
比率
/%
类型Ⅱ /条
比率
/%
类型Ⅲ /条
比率
/%
总扩增条
带数 /条
总甲基化
条带数 /条
甲基化条
带比率 /%
0(CK) 146 77． 24 13 6． 88 30 15． 87 189 43 22． 75
5 188 85． 84 23 10． 50 8 3． 65 219 31 14． 16
10 146 75． 26 16 8． 25 11 5． 67 194 27 13． 92
15 168 81． 16 26 12． 56 13 6． 28 207 39 18． 84
20 234 91． 05 16 6． 23 7 2． 72 257 23 8． 95
注:总扩增条带数 =类型Ⅰ +Ⅱ +Ⅲ;总甲基化条带数 =类型Ⅱ +Ⅲ;甲基化条带比率 =总甲基化条带数 /总扩增条带数。
49
第 8 期 李忠爱等:土霉素处理对留兰香基因组及其甲基化的影响
H和 M分别代表 Hpa Ⅱ /EcoＲⅠ和 MspⅠ /EcoＲⅠ酶切;
1—5 分别代表 0、5、10、15、20 μmol /L的土霉素处理;
A表示甲基化增加，B表示去甲基化
图 5 土霉素胁迫下基因组 MSAP分析电泳谱带
2． 4． 2 土霉素胁迫引起的 DNA甲基化状态的变化
用 16 对引物组合在土霉素处理和对照样品 DNA
的 Hpa Ⅱ /EcoＲⅠ(H)和 MspⅠ /EcoＲⅠ(M)酶切产
物中进行选择性扩增，12 种带型分布如表 2 所示。
从表 3可以看出，与对照相比，5、10、15、20 μmol /L
土霉素处理的留兰香全基因组 DNA 甲基化增加(A
型)位点数分别为 20、20、21、22，占总甲基化多态性
扩增 位 点 数 的 10． 31%、10． 87%、10． 94%、
11． 34%;DNA去甲基化(B 型)位点数分别为 23、
21、30、34，占总甲基化多态性扩增位点数的
11． 86%、11． 41%、15． 63%、17． 53%。另外，5、
10、15、20 μmol /L 土霉素处理的留兰香全基因组
DNA 总甲基化多态性比率分别为 23． 20%、
23． 37%、26． 56%、29． 38%，甲基化状态未发生变
化(D 型)比 率 分 别 为 76． 80%、76． 63%、
73． 44%、70． 62%。由此可知，土霉素胁迫处理
后，留兰香全基因组 DNA 的甲基化程度增加，在
扩增的甲基化位点中，土霉素胁迫诱导的去甲基
化位点数高于发生甲基化的位点数(图 6)。同
时，基因组 DNA 甲基化多态性也随之增加。表明
留兰香全基因组 DNA的甲基化和去甲基化之比会
随着土霉素浓度的增加而升高。
表 2 土霉素处理与对照的甲基化状态
酶切a
H M H M
甲基化状态变化
处理前 处理后
差异数量 /条
CK －5 CK － 10 CK － 15 CK － 20 带型
b
0 0 0 1 CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
11 5 5 9 B3
0 0 1 1 CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
2 7 14 9 B4
0 1 1 1 CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
5 4 5 6 B1
1 0 1 1 CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
5 5 6 10 B2
1 1 1 0 CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
0 7 3 1 A2
1 1 0 1 CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
2 1 2 2 A1
0 1 0 0 CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
1 2 2 1 A3
1 0 0 0 CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
17 10 14 18 A4
0 1 1 0 CCGG
GG CC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
2 2 0 1 C
1 1 1 1 CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
140 124 126 132 D1
1 0 1 0 CCGG CCGG
GGCC CCGG
CCGG CCGG
GGCC GGCC
4 11 9 1 D2
0 1 0 1 CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
5 6 6 4 D3
注:a:H和 M分别代表 HpaⅡ /EcoＲⅠ和 MspⅠ /EcoＲⅠ酶切;C和 CC表示甲基化的胞嘧啶;1:有带，0:无带。CK －5、CK －10、CK － 15、CK －
20分别表示处理组与对照组相比，甲基化位点的差异变化。b:A型包括如表所示 A1—A4 4 种与对照相比甲基化增加的带型，B 型则代
表去甲基化产生的带型，C为不定式，D为对照处理，甲基化状态不变。
59
河南农业科学 第 44 卷
表 3 不同浓度土霉素处理对留兰香基因组 DNA甲基化状态的影响
土霉素浓度
/(μmol /L)
甲基化
条带数 /条
总甲基化多态性带型
A型 /条
比率
/%
B型 /条
比率
/%
C型 /条
比率
/%
多态性
条带数 /条
比率
/%
单态性带型
D型 /条
比率
/%
5 194 20 10． 31 23 11． 86 2 1． 03 45 23． 20 149 76． 80
10 184 20 10． 87 21 11． 41 2 1． 09 43 23． 37 141 76． 63
15 192 21 10． 94 30 15． 63 0 0 51 26． 56 141 73． 44
20 194 22 11． 34 34 17． 53 1 0． 52 57 29． 38 137 70． 62
注:甲基化条带数 =类型 A + B + C + D;b:多态性条带数 =类型 A + B + C;总甲基化多态性比率 =类型 A + B + C /总甲基化条带数;单态性比
率 =类型 D /总甲基化条带数。
图 6 土霉素胁迫引起的留兰香基因组 DNA甲基化
和去甲基化的变化
3 结论与讨论
DNA甲基化对植物的生长发育和遗传有重要
的意义，另外 DNA甲基化在基因沉默等方面也起着
至关重要的作用。DNA 甲基化能够在同一物种中
稳定地遗传下去，有些性状例如花形的对称是由
DNA甲基化修饰发生了变异所致，这种性状在同一
物种中可以遗传上百年［27］，充分体现出物种在遗传
上的稳定性。除极少数发现外［28］，逆境胁迫可诱导
基因组 DNA甲基化的模式发生变异，被认为是植物
逆境相应的机制［29-30］，因此被广泛研究。
本研究结果表明，随着土霉素浓度的升高，留兰
香茎段生长逐渐减慢，叶绿素含量逐渐降低，MDA
含量则呈上升趋势。土霉素胁迫对留兰香造成了一
定的影响，留兰香通过调节体内的各种代谢影响细
胞内某些物质的合成，响应土霉素胁迫对自身的
伤害。
AFLP技术分析表明，土霉素处理和对照样品
之间并没有发现特异条带，说明留兰香材料在 DNA
序列上没有发生改变。利用 MSAP分子标记技术进
行检测分析，结果表明，随着土霉素浓度的升高，留
兰香全基因组 DNA的甲基化程度降低，并且全甲基
化比率高于半甲基化比率。由此推测，在土霉素胁
迫下，留兰香全基因组 CCGG 位点发生甲基化的方
式主要是以双链全甲基化为主。另外，随着土霉素
浓度的升高，留兰香全基因组 DNA甲基化水平呈下
降趋势。同时，基因组 DNA甲基化多态性也随之增
加。这种 DNA甲基化模式的变化可能是植物适应
土霉素这种抗生素胁迫的一种机制，这种机制的内
在机理是什么，还需要更深入的研究。
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