全 文 ：云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University，2013，28 (6) :898 － 901 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 － 390X;CODEN YNDXAX E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2013 － 05 － 19 修回日期:2013 － 06 － 07 网络出版时间:2013 － 11 － 13 04∶55
* 基金项目:云南中烟工业有限责任公司科技项目 (2012JC07)。
作者简介:赵明富 (1975 －) ，男，云南宣威人，博士，副教授，主要从事植物病理学工作。
E-mail:zhaomingfu@ 163. com
＊＊通信作者Corresponding authors:陈微 (1979 －) ，女，云南玉溪人，博士，工程师，主要从事卷烟原料研究。
E-mail:kibchenwei@ 126. com;陈兴 (1983 －) ，重庆合川人，博士，工程师，主要从事卷烟生化研究。
E-mail:chenxinzi1111@ 163. com
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20131113. 1655. 201306. 898_021. html
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004 － 390X (n). 2013. 06. 024
侵染美国薄荷的小西葫芦黄花叶病毒的检测与鉴定*
赵明富1，彭 晟1，杨 莹2，孙 媛1，陈 微2＊＊，陈 兴2＊＊
［1． 云南农业大学，农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南 昆明 650201;
2． 红云红河烟草 (集团)有限责任公司，云南 昆明 650202］
摘要:为明确侵染美国薄荷，引起花叶、叶片扭曲畸形等症状的病毒病原，对采集于云南石林烟庄的美国薄
荷采用电子显微镜观察和 ＲT-PCＲ 技术检测。在电子显微镜下观察到大小约 760 nm 线状病毒粒子。提取总
ＲNA，利用马铃薯 Y病毒科特异性简并引物 (Sprimer /M4)进行 ＲT-PCＲ扩增，获得约 1 700 bp片段。经测序
和序列分析，结果表明:该片段含有 1 680 个核苷酸，包含部分 NIb 基因 (621 bp)、完整 CP 基因 (837 bp)
和 3-UTＲ区 (210 bp)。序列同源性分析的结果显示与小西葫芦黄花叶病毒 (Zucchini yellow mosaic virus，
ZYMV)分离物 (AF127929)的 CP氨基酸序列同源性高达 98%，与 ZYMV分离物 (L31350)CP氨基酸序列
同源性高达 93. 5%，表明侵染美国薄荷，引起花叶、叶片扭曲畸形的病毒病原为小西葫芦黄花叶病毒
(ZYMV)。
关键词:美国薄荷;小西葫芦黄花叶病毒;ＲT-PCＲ
中图分类号:S 435. 672 文献标志码:A 文章编号:1004 － 390X (2013)06 － 0898 － 04
Detection and Identification of Zucchini yellow mosaic
virus infecting Monarda didyma L．
ZHAO Mingfu1，PENG Sheng1，YANG Ying2，SUN Yuan1，CHEN Wei2，CHEN Xing2
［1. Key Laboratory of Agro-biodiversity and Pest Management of Education Ministry of China，Yunnan Agricultural
University，Kunming 650201，China;2. Hongyun-Honghe Tabacco (Group)Co.，Ltd.，Kunming 650202，China］
Abstract:In order to ascertain the viral pathogen of infecting Monarda didyma L. which showing the
symptom of mosaic，leaf curling，and deformation，the diseased samples from Tobacco finca of Stone
forest in Yunnan province were collected and detected with TEM and ＲT-PCＲ. Filamentous particles
with the length of 760 nm were detected under TEM from diseased M. didyma L. samples. Then Zuc-
chini yellow mosaic virus (ZYMV)was detected in the diseased samples from M. didyma L． by ＲT －
PCＲ with genera-specific degenerate primers of Potyviridae (Sprimer /M4) ，and the 3 end of the ge-
nome (1 680 bp)of the virus was cloned and sequenced． Sequence analysis indicated that this frag-
ment contained partial Nib gene (621 bp) ，coat protein gene (837 bp)and 3-UTＲ (210 bp) ，the
CP amino acid sequence of ZYMV BH isolate described in this work shared high identity of 98% with
ZYMV isolate (AF127929) and 93. 5% with ZYMV isolate (L31350) ，respectively． The results
show ZYMV is the viral pathogen of inducing he symptom of mosaic，leaf curling，and deformation of
M． didyma L．
Key words:Monarda didyma L. ;Zucchini yellow mosaic virus;ＲT-PCＲ
美国薄荷 (Monarda didyma L. )也叫马薄
荷，原产于北美，为唇形科多年生草本植物，叶
芳香，可从其幼叶中提取香料，或将其花朵取下
阴干作薰香剂、茶叶、饮料［1］。
近年来，美国薄荷成为我国引种成功的一种
多年生常绿耐寒宿根花卉及香料植物，在各地苗
圃及天然花园中均有种植，其花朵色泽鲜艳且天
然芳香最引人瞩目，但是随着种植面积扩大及种
植年限增长，薄荷锈病、白粉病、菌核病、茎枯
病、病毒病等病害也日趋严重，严重影响其观赏
价值及挥发油含量［2 － 6］。虽然已经解决了一些真
菌病害问题，但病毒病害的鉴定工作一直没有很
好开展，从 2011 年起，我们结合电镜技术和 ＲT-
PCＲ技术对云南石林印象烟庄苗圃出现的美国薄
荷花叶畸形病毒病进行检测和鉴定，结果表明 4
个病样的病原均为小西葫芦黄花叶病毒 (Zucchini
yellow mosaic virus，ZYMV) ，为国内首次报道
ZYMV侵染薄荷属植物。
1 材料与方法
1. 1 美国薄荷病样收集
病害调查选在 2011 年和 2012 年夏季 (6—8
月) ，这一季节气候相对湿润，植株生长茂盛，
同时发病也重，在温室及田间观察有病毒侵染症
状的美国薄荷，拍照并收集病样带回实验室以作
提纯病毒粒子和提取总 ＲNA备用。
1. 2 ZYMV病毒粒子电镜观察
取症状明显的薄荷病叶进行病毒粒子提纯，
病毒粒子提纯参照 ZHAO 等［7］描述的方法，提纯
的病毒粒子用浸出法在电子显微镜观察:用铺有
Formver膜的电镜铜网蘸取病毒粗提纯液，用吸水
纸吸干，加 1 滴 2% 磷钨酸 (pH 7. 0)负染
1 min，吸干，待干燥后用 JEM-1200EXII 透射电
镜观察，并用 GATAN CCD相机拍照。
1. 3 病样总 ＲNA抽提和 PCＲ扩增
病样总 ＲNA抽提采用北京百泰克生物技术
有限公司离心柱型通用植物总 ＲNA提取试剂盒，
具体方法按厂家说明操作。PCＲ 扩增引物为马
铃薯 Y 病 毒 科 特 异 性 简 并 引 物 (Sprimer /
M4)［7］。
抽提所得总 ＲNA用于 cDNA 第一链合成，合
成所用下游引物为 M4T，总体系 20 μL:Total
ＲNA 5 μL，下游引物 M4 1 μL，dNTP Mixture
(10mmol /L each)1 μL，ＲNase Free ddH2O 7 μL，
混匀，65℃孵育 5 min，置于冰上急冷，加入 5 ×
first-strand Buffer 4 μL，M-MuLV Ｒeverse Tran-
scriptase (200 u /μL)1 μL，ＲNase Inhibitor (40 u /
μL) 1 μL。在 30℃，10 min，42℃，60 min，
95℃，5 min条件下进行反转录反应，所得 cDNA
产物用于 PCＲ扩增，采用北京百泰克生物技术有
限公司 2 × Power Taq PCＲ Master Mix 试剂盒，反
应体系参照厂家说明，扩增体系 50 μL，流程如
下:2 × Power Taq PCＲ Master Mix 25 μL，上游引
物 (Sprimer)5 μL，下游引物 (M4)5 μL，模板
2 μL。反应条件:95℃，3 min，95℃，30 s，
56℃ 1 min，72℃，1 min，30 个循环扩增，72℃，
10 min，电泳检测。
1. 4 克隆和序列分析
PCＲ产物直接克隆到载体 pGEM-T Easy vector
(Promega) ，采用 ABI PＲISMTM 377 DNA 自动测
序仪测定 (上海生工) ，序列分析采用 SeqMan 和
MegAlign。
2 结果与分析
2. 1 发病概况及典型症状
温室和大田发病率在 7% ～ 11%，发病薄荷
植株呈花叶症状，叶片畸形，植株细弱 (图 1)。
998第 6 期 赵明富，等:侵染美国薄荷的小西葫芦黄花叶病毒的检测与鉴定
2. 2 电镜观察病毒粒子形态
明显症状薄荷病叶提纯后，在电子显微镜下
观察到病线状毒粒子，长 740 ～ 760 nm (图 2)。
2. 3 PCＲ产物电泳检测及测序分析
用引物 Sprimer /M4 扩增产物经电泳检测，条
带大小约 1 700 bp，对目的条带克隆测序分析表
明，用 Sprimer /M4 引物 PCＲ 扩增的薄荷分离物
(BH)3 －末端部分序列长 1 668 bp，包括部分
NIb 基因 (621 bp)、CP 基因 (837 bp)和 3-
NTＲ非编码序列 (210 bp)。与已经报道的小西葫
芦黄化花叶病毒 (Zucchini yellow mosaic virus，
ZYMV)California 分离物 (L31350)、TW-TN3 分
离物 (AF12729)3-UTＲ 核苷酸序列同源性分别
为 96%和 98%，相应区域 NIb蛋白氨基酸序列同
源性均为 96%，CP 蛋白氨基酸序列同源性分别
为 93. 5%和 98% (表 1)。其中 CP 的氨基酸第
215 ～ 217 位存在与蚜传密切相关的保守基
序 DAG。
表 1 BH分离物 3 － UTＲ核苷酸序列、NIb和 CP
基因编码的蛋白氨基酸同源性比较
Tab. 1 Comparison of the nucleotide sequences
identity of 3 － UTＲ and animo acid sequences
identity of corresponding region of NIb and
CP among BH with other ZYMV isolates %
分离物 isolates NIb CP 3-UTＲ
L31350 96 93. 5 96
AF127929 96 98 98
3 讨论
根据不同 Potyvirus属成员 CP氨基酸同源性应
＜80%的分类标准［8］，结合电镜观察到的病毒粒
子形态和病毒基因组 3’-末端序列分析，表明引
起美国甜薄荷花叶的病毒病原为小西葫芦黄化花
叶病毒 (Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV) ，在
国内首次报道 ZYMV自然侵染美国甜薄荷。
ZYMV为马铃薯 Y 病毒属的重要成员，是葫
芦科作物具有毁灭性的重要病毒之一。最早在欧
洲的意大利和法国报道，随后中东、美洲等各地
均有报道。我国台湾、新疆、陕西、浙江、河北
等地也有报道［9 － 14］。ZYMV 除了能侵染葫芦科
外，还可侵染豆科、藜科和苋科等植物，给农业
经济造成重大损失。有报道认为 ZYMV 传播途径
可经桃蚜、棉蚜以非持久性方式传毒。尽管本研
究通过序列分析证明在 CP 基因编码的氨基酸第
215 ～ 217 位存在与蚜传密切相关的保守基序
DAG，然而我们在温室及大田的美国甜薄荷健株
及病株上均没发现任何蚜虫，那么 ZYMV 来自哪
里，以何种方式传播，除了蚜虫还有没有其他潜
在介体?有报道认为种子通常不传播病毒，但也
有报道认为病毒在葫芦科植物中可以通过种传，
种传率在 1% ～ 5%之间。那么在美国甜薄荷上
ZYMV广泛传播的原因又是什么呢?这些有必要
009 云南农业大学学报 第 28 卷
进一步研究。
［参考文献］
［1］宋魁，谭勇，龚昌禄，等． 天然香料植物———薄荷
［J］． 现代农业科技，2009 (1) :105 － 106．
［2］王佳武，王朴，唐永清． 新疆伊犁薄荷病虫害综合
防治 ［J］． 北方园艺，2011 (11) :122 － 123．
［3］王娥梅，刘琨，代建法，等． 薄荷茎枯病发生规律
及防治初探 ［J］． 中国植保导刊，2004，24 (1) :
30 － 31．
［4］潘志金． 薄荷病害的发生及综合防治 ［J］． 安徽农
学通报，2010，16 (9) :139 － 140．
［5］段春芳，杨根华，尼章光，等． 立枯丝核菌 AG － 1
IB引起白菜，薄荷，莴苣叶腐病的研究 ［J］． 云南
农业大学学报:自然科学，2008，23 (3) :422
－ 425．
［6］王小刚，高山林，白雨，等． 薄荷脱病毒苗的农艺
性状和有关生理指标的测定 ［J］． 药物生物技术，
2003，10 (2) :92 － 95．
［7］ ZHAO M F，CHEN J，ZHENG H，et al． Molecular anal-
ysis of Zucchini yellow mosaic virus isolates from Hang-
zhou ［J］． Journal of Phytopathology，2003，151 (6) :
307 － 311．
［8］ VAN ＲEGENMOＲTEL M H V，FAUQUET C M，BISH-
OP D H L，et al． Virus Taxonomy:the Seventh Ｒeport
of the International Committee on Taxonomy of Viruses
［M］． San Diego:Academic Press，2000．
［9］郑光宇，董涛． 在新疆发生的小西葫芦黄花叶病毒
的研究初报 ［J］． 植物病理学报，1991，21 (1) :
72 － 72．
［10］赵荣乐，郑光宇，董涛． 危害新疆西瓜的一种线状
病毒的研究 ［J］． 北京师范大学学报，1998，34
(2) :258 － 263．
［11］康东木，许勇，石正强，等． 西瓜抗小西葫芦黄花
叶病毒中国株系遗传规律的研究 ［J］． 中国农业科
技导报，2002，4 (3) :47 － 49．
［12］勤生，ＲOGGEＲO P，LENZI Ｒ，等． 北方地区小西
葫芦黄花叶病毒的酶联检测和西瓜品种抗病性鉴定
［J］． 果树学报，2002，19 (3) :184 － 187．
［13］ LIN S S，HOU Ｒ F，YEH S D． Heteroduplex mobility
and sequence analyses for assessment of variability of
Zucchini yellow mosaic virus ［J］． Phytopathology，
2000，90 (3) :228 － 235．
［14］朱英芝，陈保善，蒙姣荣． 罗汉果种子传播小西葫
芦黄化花叶病毒的检测 ［J］． 基因组学与应用生物
学，2011，30 (6) :678 － 681．
109第 6 期 赵明富，等:侵染美国薄荷的小西葫芦黄花叶病毒的检测与鉴定