全 文 ：微生物学通报 MAR 20, 2009, 36(3): 371~376
Microbiology © 2009 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：重庆市科委自然基金重点项目(No. CSTC 2007BA1005)
* 通讯作者：Tel: 86-23-65120483; Fax: 86-23-65120483; : zhengguoli@cqu.edu.cn
收稿日期：2008-09-19; 接受日期：2008-12-08
研究报告
传统分离培养结合 DGGE 法检测榨菜腌制
过程的细菌多样性
李正国 1* 付晓红 1 邓 伟 1 杨迎伍 1 崔英双 2 赵 平 2
(1. 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心 重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室 重庆 400044)
(2. 重庆涪陵榨菜(集团)有限公司 重庆 408000)


摘 要: 采用传统分离培养和基于 16S rRNA 作为分子标记的变性梯度凝胶电泳(Denaturing gra-
dient gel electrophoresis, DGGE)的方法, 分析榨菜腌制过程中不同时期的可培养细菌数量、多样性
及其群落结构。结果表明, 用传统分离与分子鉴定方法获得 7 个属的细菌类群, 其中乳杆菌属
(Acidobacterium)是优势菌群, 明串珠菌属(Leuconostoc)是次优势菌群。对通过 DGGE 方法得到的
11 条 16S rRNA 优势条带序列进行了比对, 结果表明明串珠菌属(Leuconostoc)的丰度最高, 是腌制
过程中主要的优势菌群, 乳球菌(Lactococcus lactis)是次优势菌。传统分离法与 DGGE 法结合能够
更有效的分析榨菜腌制过程中微生物的多样性及其动态变化, 获得更全面的微生物多样性信息。
关键词: 榨菜(Brassica juncea coss var. tsatsai), 16S rRNA, 传统分离培养, 变性梯度凝胶电泳
(DGGE), 群落多样性
Analysis of Bacterial Diversity During the Processing of Bras-
sica juncea coss var. tsatsai by the Culture-independent and
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Methods
LI Zheng-Guo1* FU Xiao-Hong1 DENG Wei 1 YANG Ying-Wu1
CUI Ying-Shuang2 ZHAO Ping2
(1. Genetic Engineering Research Center, Bio-Engineering College, Chongqing University, Key Lab of Functional Gene and
New Regulation Technologies under Chongqing Municipal Education Commission, Chongqing 400044, China)
(2. Chongqing Fuling Zhacai Group Ltd., Chongqing 408000, China)
Abstract: Both culture-dependent and culture-independent methods, denaturing gradient gel electrophoresis
(DGGE) based on the sequence of 16S rRNA V3 region gene, were used to examine the total bacteria counts,
bacterial diversity and community structure of different periods Brassica juncea saline water samples. The
results showed that 7 genera of bacteria were identified from 19 isolated bacterial populations by the tradi-
tional isolation method, the dominant bacteria in intestine belonged to Acidobacterium. By 16S rRNA V3
region gene DGGE method, 11 distinct bands were obtained from 16S rDNA amplifications. The profile of
DGGE fingerprints of different periods saline water revealed that the most dominant bacteria group was
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2009.03.017
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Leuconostoc in the process of the fermentation. This suggested that a combination of molecular and tradi-
tional culture methods can be used to analyze and monitor the diversity of the process of fermentation mi-
croflora effectively, and that will give us more information of microorganism diversity.
Keywords: Brassica juncea var. tsatsai, Microbial diversity, Traditionaly isolation culture, Denaturing gra-
dient gel electrophoresis (DGGE), 16S rRNA
榨菜(Brassica juncea coss var. tsatsai)是中国特
产, 属于世界 3大酱菜之一, 与欧洲酸黄瓜、西德甜
酸甘蓝一道享誉海内外, 深受人们的喜爱。榨菜作
为一种独特的乳酸发酵蔬菜制品, 在中国有着悠久
的历史, 同时也是重庆的优势农业产业之一, 近年
来得到了迅速的发展。
榨菜腌制工艺的重要环节是榨菜后熟过程, 而
榨菜后熟的实质是微生物的发酵和风味形成。由于
地缘因素, 国外学者对中国榨菜的认识很少, 同内
少量研究主要集中在榨菜的生理[1]、品种改良[2,3]等
方面, 而对榨菜腌制加工过程中微生物群落的研究
鲜有报道。只有少量采用传统微生物学方法对榨菜
腌制过程中的腐败菌进行了分离、鉴定[4,5], 而对榨
菜盐水中微生物区系构成的一些研究主要是对静态
的考察, 因此对于揭示榨菜腌制过程中微生物区系
的多样性有很大的局限性。随着分子生物学技术的
发展, 食品微生物的分子生物学研究进入了一个新
阶段, 人们对于微生物在分子和基因水平的认识不
断深入。16S rRNA存在于所有的原核生物中, 被广
泛用于细菌的系统学研究, 是细菌种类鉴定的一个
重要指标, 特别是利用核糖体 16S rRNA 作为分子
标记的变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel
electrophoresis, DGGE) 技术为不可培养微生物的
分析提供了有力手段, 已经广泛地应用于到环境和
食品(包括腌制蔬菜)微生物的研究中[6,7]。
榨菜虽然加工历史悠久, 但对腌制过程中各时
期的微生物群落变化尚缺乏研究。仅杨王君[8]等通过
传统微生物培养法, 对四川榨菜后熟期间的微生物
种类进行了一定的分析, 但各腌制时期的微生物群
落的变化规律仍不明确。本研究采用分子生物学方法
和常规传统方法相结合, 探讨微生物的动态变化过
程, 进一步揭示榨菜腌制过程中优势菌群组成, 为明
确榨菜后熟机制、质量控制和工艺改进提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 原料：青菜头购于重庆市场, 将青菜头进行
修剪后 , 按传统加工方法加盐在室温下进行腌制 ,
60 d左右基本成熟。
1.1.2 主要试剂和仪器：细菌生化鉴定管(杭州天和
微生物试剂有限公司, 中国); DNA 纯化试剂盒、
LATaq 酶(Bioflux, Japan); pMD-18T(TaKaRa, Japan);
引物合成(上海生工生物技术公司, 中国); UNIQ-10
柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒 (上海生工生物
技术公司, 中国); DGGE 电泳分析系(Bio-Rad, USA),
PCR 仪(Bio-Rad, USA), 高速冷冻离心机(Beckman,
Germany), 核酸测定仪(Beckman, Germany)。
1.2 取样
用无菌取样瓶取各时期榨菜盐水 1 mL~2 mL,
采用血球计数板计数法进行各时期菌数测定; pH测
定采用 DELTA320 pH计(梅特勒-托利多仪器上海有
限公司)[9]。
1.3 微生物分离鉴定
1.3.1 分离、纯化流程：盐水样品采集→稀释→培
养→平板划线分离→鉴定。以无菌生理盐水逐级稀
释样品至 10−8, 取 10−1~10−8稀释液各 0.1 mL, 在不
同的培养基(LB、PDA、MRS及查氏)平皿上涂布接
种, 于 37°C±1°C恒温培养箱中培养 48 h。所有处
理均重复 3 次。然后挑取单菌落, 在分离培养基上
多次划线分离纯化、镜检, 得到纯菌株。
1.3.2 形态学和生理生化特性鉴定：根据《伯杰氏
细菌鉴定手册》第九版[10]及《常见细菌系统鉴定手
册》[11]对所得的优势菌群进行形态和生理生化测定,
并按可数性原则对每个平板上的典型目标菌落进行
计数, 不同菌落与总菌落数的比例为每种菌属的相
对丰度。
1.4 细菌 DGGE 分析
1.4.1 总 DNA 的提取：取盐水样品约 200 mL, 用
无菌纱布过滤。10000 g 离心 5 min, 去上清, 沉淀
用 UNIQ-10 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取
总 DNA。DNA 浓度用核酸测定仪测定。
1.4.2 16S rDNA V3 区的 PCR 扩增：以提取的盐
水细菌总 DNA 为模板 , 用细菌通用引物：P1：
李正国等: 传统分离培养结合 DGGE法检测榨菜腌制过程的细菌多样性 373

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357f-GC(5′-GC-clamp-CCTACGGGAGGCAGCAG-
3′)及 P2：518r (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)进行
扩增, 上游引物 P1 5′端有 40 bp GC 夹(CGCCCGC
CGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG
GG)。为减少非特异性扩增, 采用降落 PCR 进行扩
增。反应体系 25 µL, 反应条件：94°C 预变性 5 min;
94°C 40 s, 65°C 60 s, 72°C 30 s, 每两个循环退火温
度降低 1°C, 当退火温度降至 55°C 后, 再以该温度
扩增 30个循环; 最后 72°C延伸 10 min。所得产物
于 2%的琼脂糖凝胶上电泳。
1.4.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和产物分析：上述
PCR 产物浓缩后, 采用 DGGE 分析系统进行电泳
分离, 8%(W/V)的聚丙烯酰胺(37.5：1, W/W), 以变性
剂尿素与甲酰胺线性梯度范围为 35%~45%。60°C
恒温, 80 V 16 h, EB 染色 15 min~25 min, Versa Doc
2000 凝胶成像系统拍照, 标记 DGGE 图谱中清晰
的优势条带后割胶 , 捣碎后加入 30 µL Sterilized
ddH2O, −20°C浸泡过夜, 离心取上清作为模板进行
PCR 扩增, 引物为带 GC 夹的 P1 和 P2。PCR 反
应程序同 1.4.2 所述。得到的 PCR 扩增产物再以
DGGE 分离。 PCR 产物用纯化试剂盒(Bioflux) 纯
化后与载体 pMD18-T 连接, 转化到 E. coli JM109
中, 用菌落 PCR方法检测阳性克隆。阳性克隆子送
上海生工生物技术公司进行测序。测序结果于 NCBI
上进行比对分析。条带所代表的优势菌属的相对丰
度用每个条带荧光强度与所在泳道所有条带荧光总
强度之比来表示。
2 结果和分析
2.1 微生物数量及 pH 变化
随着发酵过程的进行, 微生物数量种类及 pH
值也相应的发生变化。经过 3 次加盐工艺后, 盐度
明显增高, 但是 pH值却有所下降, 从开始的 6.95下
降至 4.12, 并维持这一水平(图 1A)。微生物总量经
历了一个先急速增加到逐渐趋缓, 并稳定在一定数
量的过程, 其变化可以大致分为 3个时期, 0~12 d的
稳定期, 12 d~30 d的快速增长期以及 30 d~60 d的下
降至平衡时期(图 1B)。
2.2 可培养优势菌群的分离鉴定
从 4种培养基上共获得 34个单菌落, 从中筛选
出 19 个优势单菌落, 并对这 19 个菌落进行常规的
形态学鉴定, 并进行进一步的生理生化实验, 结果
表明(表 1、2)：菌株 B-01、B-09、B-14、B-17符合
明串珠菌属(Leuconostoc)特征; B-02、B-03、B-18具
片球菌属(Pediococcus)特征; 菌株 B-04、B-19 符合
葡萄球菌属特征(Staphylococcus); 菌株 B-05、B-08、
B-12、 B-15 符合乳杆菌属(Acidobacterium)特征; 菌
株 B-06、B-11符合链球菌属(Streptococcus)特征; 菌
株 B-07 符合醋酸杆菌属(Acetobacter)特征 ; 菌株
B-10、B-13、B-16 符合芽孢杆菌属(Bacillus)特征。
其中菌株 B-05、B-08、B-12与总菌落数的比例
最高, 其次是菌株 B-01和 B-17, 通过传统分离方法
得到, 乳杆菌属(Acidobacterium)是榨菜腌制过程中
的最主要优势菌群 , 明串珠菌属(Leuconostoc)是次
优势菌群。这 19 株菌均可在 42°C 生长, 但在最适
生长温度 15°C~37°C; 最适生长 pH 5.0~7.5; NaCl
浓度 7%~8%条件下生长良好。
2.3 细菌总 DNA 的扩增产物变性梯度凝胶电泳
(DGGE)图谱分析
DGGE 是一种相对快速准确的检测细菌群落的
指纹技术。根据 DGGE 的原理, 每一个条带大致与
群落中的一个优势菌群或操作分类单位(Operational
taxonomic unit, OTU) 相对应[12]。对榨菜腌制过程中
不同时期盐水样品细菌的 DGGE 分析图谱见图 2。
结果表明, 不同时期的盐水样品DGGE 图谱存在一
定的差异。为了进一步分析榨菜腌制过程中微生物
的群落结构和多样性, 我们对图 2中标记的 11条较
明显的条带进行了割胶回收、测序。在不同时期的
盐水样品中都出现一条明显的共有条带(标记为 a),
这条优势主带并不随着腌制时期的变化而发生改变,
测序结果表明条带 a 是明串珠菌属(Leuconostoc)。
图谱显示 , 榨菜腌制过程可以大致分为前期 (0~7
d)、中期(12 d~25 d)、后期(30 d~60 d)。中期微生物
变化最激烈, 这也与微生物数量测定结果一致, 而
且用 DGGE方法得到的细菌种群明显多于可培养方
法获得的。
通过分析发现(表 3), 榨菜细菌 16S rDNA V3
区间的序列与现有的数据库中的细菌序列有很高的
相似性, 都在 97%以上, 对分离得到的 11 条优势条
带测序结果显示, 优势细菌主要属于 Leu citreum、
Lactobacillus brevis、Lactococcus lactis subsp. lactis。
明串珠菌属的丰度最高, 是腌制过程中主要的优势
菌群, 乳球菌是次优势菌。在 DGGE 图谱中, 明串
珠菌属一开始就存在, 而在发酵初期, 第 1 至第 4

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图 1 榨菜加工过程中 pH 值和微生物数量的变化
Fig. 1 The change of pH and total microorganism during the processing of Brassica juncea

天, 生长繁殖的速度非常快, 成为优势菌。但由于乳
酸细菌的发酵作用, 酸度增加, pH 值不断下降, 明
串珠菌(条带 a)等受到抑制, 生长趋缓并逐渐稳定。
之后在发酵中期, 第 12 至第 25 天, 乳酸细菌(条带
c、i、j) 开始迅速繁殖成为优势菌, 继续发酵, 酸度
进一步增加。直到发酵后期, 第 40 天, 由于 pH 降
至 4.5 以下, 酸度较高, 乳酸菌也受到抑制, 细菌
总量下降很多。这时榨菜已基本成熟, 色泽、风味
与成熟样品无异。
分子鉴定方法与传统培养方法得到榨菜优势微
生物菌群有一定差异, 两种方法得到的第一优势菌


图 2 榨菜不同时期盐水样品优势细菌的 DGGE 图谱
分析
Fig. 2 DGGE analysis of PCR-amplified 16S rDNA frag-
ments from microflora of Brassica juncea

表 1 生化实验项目测定
Table 1 Biochemical characteristics of bacteria
菌株
Strains
氧化酶
Oxidase
接触酶
Catalase
明胶液化
Gelatineliquefication
淀粉水解
Amylolysis
甲基红
V-P
石蕊牛乳
Litmusmilk
吲哚
Indole
硝酸还原
Nitricacid recovery
B-01 − − − − + as − −
B-02 − − − − + o − −
B-03 − − − − + o − −
B-04 − − − − + as − −
B-05 − − − − + as − −
B-06 − − − − − as − −
B-07 − + − − − as − −
B-08 − − − − + as − −
B-09 − − − − + as − −
B-10 − + + + + a − +
B-11 − − − − + as − −
B-12 − − − − + as − −
B-13 − + + + + a − +
B-14 − − − − + as − −
B-15 − − − − + as − −
B-16 − + + + + a − +
B-17 − − − − + as − −
B-18 − − − − + o − −
B-19 − − − − + as − −
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表 2 糖发酵试验
Table 2 Fermentation of sugar of bacteria
菌株
Strains
B-01 B-02 B-03 B-04 B-05 B-06 B-07 B-08 B-09 B-10 B-11 B-12 B-13 B-14 B-15 B-16 B-17 B-18 B-19
葡萄糖
Glucose
ag a a a ag ag ag ag ag a ag ag a ag ag a ag a a
核糖
Ribose
+ + + + +
− − + + + − + + + + + + + +
半乳糖
Galactose
+
− − + + + − + + + + + + + + + + − +
果糖
Fructose
+ + + + + +
− + + + + + + + + + + + +
阿拉伯糖
Arabinose
+ + +
− + + + + + + + + + + + + + + −
山梨糖
Sorbose
− − − + − − − − − + − − + − − + − − +
枸橼酸盐
Citrate
+
− − + + + + + + + + + + + + + + − +
麦芽糖
Maltose
+ + + + + +
− + + + + + + + + + + + +
木糖
Xylose
+ + + + + +
− + + + + + + + + + + + +
甘露醇
Mannitol
+
− − − + − − + + + − + + + + + + − −
棉籽糖
Raffinose
− + + + + + + + − + + + + − + + − + +
蔗糖
Sucrose
+ + + + + + − + + + + + + + + + + + +
鼠李糖
Rhamnose
+ − − − + − d + + − − + − + + − + − −
初步鉴定
Identifi-
cation
Leu
con
ost
toc
Ped
ioc
occ
us
Ped
ioc
occ
us
Sta
phy
loc
occ
us
Aci
dob
act
eri
um
Str
ept
oco
ccu
s
Ace-
tobact
er
Aci
dob
act
eri
um
Leu
con
ost
toc
Bacill
us
Str
ept
oco
ccu
s
Aci
dob
act
eri
um
Bacill
us
Leu
con
ost
toc
Aci
dob
act
eri
um
Bacill
us
Leu
con
ost
toc
Pedio
coccus
Sta
phy
loc
occ
us
注: +: 阳性反应; −: 阴性反应; a: 产酸反应; g: 产气反应; o: 可变反应; s: 凝结反应; d: 延迟反应.
Note: +: Positive reaction; −: Negative reaction; a: Acid reaction; g: Gas reaction; o: Variable reaction; s: Solidify reaction; d: Delayed reaction.

表 3 榨菜细菌 DGGE 回收条带比对结果
Table 3 Identity of bands obtained from DGGE analysis of Brassica juncea bacterial communities
条带
Bandsa
菌株
Closest relative
相似性(%)
Identityb
编号
Accession no.
a Leu citreum 100 DQ489736
b Uncultured eubacteria 100 EU468438
c Lactobacillus sakei 100 EU755262
d Uncultured eubacteria 98 DQ81014
e Uncultured eubacteria 97 EU468391
f Psychrobacter 100 EF474162
g Uncultured eubacteria 99 EU468410
h W. confuse 100 AY281294
i Lactobacillus brevis 100 EU744192
j Lactobacillus curvatus 100 EU621984
k Lactococcus lactis subsp. lactis 100 AB375442
注: a: 表 3条带为割胶所得; b: 条带系列与基因库中系列的相似性.
Note: a: Bands as shown in Fig. 3 were excised from DGGE gel: b; Percentage of identical nucleotides in sequences retrieved from DGGE gel, and
sequences of closest relative found in GenBank.
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不同, 用分子生物学方法获得较多相对丰度高的优
势菌多是不可培养的细菌, 而用传统方法获得的总
菌落数的比例最高优势菌在分子生物学检测中大多
为低丰度细菌。但两种方法都验证了乳酸类细菌在
腌制发酵过程中的优势地位, 进一步说明乳酸细菌
在榨菜腌制成熟中的重要作用。
3 讨论
利用分子生物学方法(DGGE)和传统分离培养
法对榨菜腌制过程中微生物区系的多样性分析结果
表明, 微生物发酵在榨菜的腌制成熟过程中具有十
分重要的作用。
两种分析方法中都检测到相当高丰度的明串珠
菌属。明串珠菌属是酱腌菜、发酵乳制品、果酒中
常见发酵菌种, 可发酵柠檬酸而产生特征风味物质,
且大蒜、茴香、生姜、辣椒等食品添加香辛料对蔬
菜发酵过程中的肠膜明串珠菌有促生长作用 [13]。
DGGE 图谱中的次优势菌乳球菌, 也是泡菜及腌制
菜的重要发酵菌[14], 对风味品质的形成具有重要作
用。在传统分离培养中发现, 榨菜盐水环境下可培
养的第一优势细菌是乳杆菌属 , 研究证明乳酸杆
菌[15]和酵母菌能在发酵环境中协同作用, 相互促进,
共同推动发酵过程, 有利于风味物质的形成。这些
乳酸类细菌的分离、鉴定, 对于榨菜腌制工艺的改
进具有重要的作用, 可进一步作为发酵启动剂, 应
用于榨菜加工中, 将大大缩短腌制时间, 并形成营
养价值更高、风味更好的成品。
在分子生物学方法中鉴定获得嗜冷杆菌(条带 f),
及相对较高丰度的不可培养菌。嗜冷杆菌污染是现
代乳制品加工过程中最常见的问题, 导致乳及乳制
品风味、品质降低, 缩短保质期, 从而影响产品的质
量及加工过程。在榨菜腌制过程的中后期出现了低
丰度的嗜冷杆菌, 可能是腌制加工过程中出现了污
染。因此, 在榨菜腌制过程防止污染, 对提高腌制成
品品质, 具有十分重要的意义。而这些菌在传统培
养方法中都未曾检出, 表明只有那些适合培养基条
件及培养温度的细菌才能从传统方法中分离出来。
因此, 采用 DGGE 指纹图谱更全面、更真实地反映
食品样品中微生物群落的结构和多样性。
基于 16S rRNA 的 PCR-DGGE技术为我们提供
了一条快速揭示传统食品微生物区系组成的有效途
径。运用 PCR-DGGE 基因指纹图谱技术分析榨菜
的微生物群落结构, 研究传统食品发酵功能微生物
的生态特征与规律, 将其与传统的菌种分离鉴定相
结合, 对判断和鉴定榨菜生产中与特征风味物质相
关的关键微生物、指导生产工艺改进, 具有重要的
理论和实践意义。
参 考 文 献
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