全 文 ：卜悔负.疫学杂志 1 9 8 5半第 6 卷第 4期 一 2 9 3-
L EC AI E定量检测长叶车前花叶病毒
复旦大学生物系 朱培冲 陆妙康 李侃浮 奚可权 * 王 鸣竣
内容提要 酶标醋酸纤维膜免疫电泳的结果 ,用连接 7 21 型分光光度计的扫描装置 , 进行记录 ,
可获得较好的定量结果 ,从而建立一项抗原抗体新的微量定量的电泳测定方法 。
我们在科学通报上发表的酶标醋酸纤维
膜免疫 电泳技术 ( E o z y m e一 L j n k喊 C e l l u l o s e
A e e taet m em b
r 跳n e Im m u n o 一 e le e七r o Pho r e o i。 ,
简称 E L C A I E ) 〔 1 “ ,简便快速 、 灵敏可靠。 进
一步完善酶 标 醋酸 纤 维 膜免 疫 电泳 技 术
E L CA I E 的定量检测 , 值得探索 。 本文作者
之一曾报道改进的凝胶 电泳扫描装置 , 可以
对醋酸纤维膜电泳等实验结果 进 行 扫 描记
录 〔 , “ 。 将 E L C A工E 的实验结果 , 用上述扫描
装置进行扫描记录 , 表明线性关系好 ,重复性
强 , 为此我们曾将实验结果在科学通报上作
过简报〔幻 。 本文将该项定量检测方法详细发
表 。 作者认为完全有可能建立一项新的微量
扫描检测有关抗原 (或抗体 )的技术 , 应用于
科学研究与生产实践 。
材 料 和 方 法
一 、 长叶车前花叶病毒 ( R jb gr 如。 oM
-
琳 ic V ir u 。 , R M 、 T ) 抗血清及其酶标抗体的
制备川 :
(一 ) R M V 及其抗体的制备 :
将人工接种 R M V 的青莱叶片捣碎 , 加
入适量的聚 乙二醇 ( r E G , 分子量 6 , 0 0 0) 后 ,
用超速离心法纯化得 R M V 抗 原 。 将 R M V
抗原加福氏不完全佐剂 , 免疫家兔 3一 4 次 ,
每次间隔一周 , 所得 R M V 抗血清效价为 1 :
2 , 0 4 8
,按硫酸按沉淀法提取免疫球蛋白 。
(二 ) 酶标抗体的制备 :
将 s m g辣根过氧化物酶溶于 0 . 4m l 0 . 05
形 pH g . 6 碳酸盐缓冲液 , 然后加入浓度为 25
终的戊二醛 0 . l m l ,置于 3 7O C , 保温 2 小时 ,
加入 20 绍 N a CI 0 . l m l后 , 再加入冷无水乙醇
2
.
s m l
, 即刻混匀 , 1 , o o o r pm 离心 1 0 分钟 ,
弃上清液得沉淀 , 在沉淀中加入 20 终冷乙醉
s m l
,
1
, OO0 l’P m 离心 , 10 分钟 ,弃上清液得沉
淀 , 在沉淀中加入 O . 05 M p H g . 6碳酸盐缓冲
液 0 . 5m l , 加入浓度为 Zm g / m l 的 R M V 免
疫球蛋白 o . s m l ,置于 4℃冰箱过夜 , 最后用
少量 K H少0 ` 调 p H 为中性 。
二 、 酶标醋酸纤维膜免疫电泳 l1[ :
(一 ) 标准样点的电泳 : 将 R M V 作 为
抗原 ,用 0 . 2万 p H 7 . 4 .B B . 稀释成下列 6 种
浓度 ( n g加 I ) : 1 0 、 2 0 、 4 0 、 6 0 、 8 0 、 1 0 0 。 标准
样点 (点样量 1如l) 的电泳应重复三次以上 ,
每次底物显色结果分别妥善保存 。 电泳方法
见文献 〔 1 〕 。
(二 ) 感染 R M V 青菜的电泳检测 : 将温
室生长二周左右的青菜分 别 接 种 R MV (浓
度为 50 gn 加 l ) , 每组 3株青菜 , 共 6 组 。 除第
l 组在接种 R M V 后 , 当即冲洒清水 , 立即采
样进行电泳检测外 , 余 5 组分别在接种 R M V
1
、
2
、
3
、
4 和 5 天后采样进行电泳检测 。 电泳
时每株青菜分别称重 , 以重量 ( W )/ 体积 ( V )
为 1 l/ 的比例分别加入 0 . 2M p H 7 . 4 B . B . ,分
别磨碎取汁液 , 进行 电泳 , 各个时间组合的实
验结果 (每 1 0睡 样品汁液中所含 丑M V 的 n g
数 ) , 分别予以保存。
三 、 标准线的绘制 : 将标准样点的 电泳
结果 ,分别剪取各点生成的棕色沉淀线部位 ,
放入 72 1型分光光度计特定的比色皿中 。 比
上海农利院进修人员
2 0 4
电泳结果应对平均值分别计算误差 百分 比 。
本干作标准样在的电泳重享 4次 , 每次电泳结果的扫描峰 , 线性关系甚好 。 现将 4 次电
泳结果的扫描峰值记录见表 1。
表 1 标准样点的电泳峰值面积
一` , 甲 . . 扣如 .一` , . . ~ . . . . 呼 . . , . . . . . - .组 编 号
8021即幻71028即书
色皿中事先盛放适量石蜡油 。 接通电路 , 进
行扫描测定 ,并开启扫描装里附件 , 记录各棕
色沉淀线的相应扫描峰 (函1) 。 `分别逐一测
算扫描峰面积 。 以各组相应各点的平均面积
为纵座标 , 以病毒标准量为横座标 , 绘制标 准
曲线 。
四 、 青菜含毒 t 的求算: 将感 染 RM V
青菜的电泳检测结果 ,予以扫描记录 , 求算峰
形面积 (图 2 ) 。 依次查标准曲线相应各病毒
量点 , 得感病青菜的含毒量 (在 1 0贝样品汁
液中 ) 。
病毒标准量 ( n g ) 1 2 8 4 平均值
810叨邵肠710招肚8哄
峰值面积 ( m m , )
8
。
0() 7
,
7 0 8
.
X()
10 j O 9
。 翻〕 1 0 . 月洲)
1 3
.
40 1 8
.加 1 3 . 7 5
幼 . 8 0 朋 .幻 皿 . 加
40
.
0 8
.
40 幻 . 25
4 5
.
0 4
。
40 4
。
o
如204柳抑姗
各平均值与相应各标准点的百分误差见
表 2 。
表 2 标准样点电泳均值的百分误差
组 编 号
病毒标准盆 ( n g ) 1 2 3 4
2 8 4 5 6 与平均值相比的百分误差
朋加690174102工z289蚁o此」21209652价83n跳,土n舀0CD.101的蛇69n10300习0,占246口。0
.1
图 1 一组标准样点的扫描蜂
1
、
2
、
8
、
4 j 和 6依次代表 1 0 、 2即 、 弓印 、 6 00 、 吕的、
1
, 。印门 9 R M V 抗原量 , 箭头所指是棕色沉淀线的扫描峰
1 2 3 峨 6
图 2 青菜接种 R M V 后 (8 组中的 1组 )
lfn 进行检测的扫描峰 。
6
在不同时
1代表接种后即刻检测的扫描峰 , 2 、 3 、么 5和书 依次
代表接种 1 、留、 8 、 4 、 5 天后检测的扫描蜂
结果 和 讨 论
一 、 标准样点的电泳结果 , 必须重 复 3
次以上 。 将各次结果分别算出平均值后 , 各
表 从息说明 , 有关峰值平均值与相应标
准点峰值相比 , 百分误差在 4% 以下 , 实脸结
果的重复性较强 。
二 、 依据蜂值平均值所绘制的抗原与相
应酶标杭体反应沉淀物的标准线 (图 3 ) , 线
性关系较好 ` 所有标准点值 (图中 x 符号者 )
均分布在所取直线附近 。
飞 三 、 在检泌材料的带毒量时 , 应先取一
已知病毒浓度 。 例如 : 1 0如 g /m l 为探测点 ,
如该探测点峰值与标准点 (也是 1 0 0限 /m l)
峰值基本吻合 ,则说明检测材料所得结果 ,在
用标准曲线查算时是可信的 , 这一步骤是必
要的 , 因为可以防止由不同时间电泳可能造
2 4 1
成的误差 。
四 、 抗原与相应酶标抗体的点样点对距
要合适 , 以免材料点样点和酶及酶标抗体残
留物干扰沉淀线峰值的扫描记录 。 从图 4可
以看到 ,青菜汁液电泳时 , 污染物较多 , 因此 ,
应通过预备实验 , 找出沉淀线分布的较佳区
域 。
表 3 感染 九班 V 青菜的电泳检测结果
. . . . . . . . . . . . . . . .
材 料 编 号
时间 (天 ) 3 平均依
卡 值 (m m Z )
0O泊1823阳307涎63
加田0
02038802 82531274250动87564110543病毒接种后即刻检测
1
2
8
4
5
s卿刚
表 4 病叶青菜的病毒含量
R M V 接种后的夭数 材料所含病毒量 ( n g )
( 3株平均值 )
邱7犯497
州Jt了
接种后即刻检测
1
赢一赢下 工。如 `劝 ’ `摊 蕊
图 3 R M V 抗原与相应酶标抗体反应
沉淀物的标准线 , 纵轴代表扫描峰面积 ,
横轴代表抗原加样量 1
,
3 7 6
图 4 青菜接种 R M V 后不同时间的带毒量 ,
纵轴代表带毒鼠 ,横轴代表接种后检测时间
五 、 各组合的青菜汁液 分 别时 间 电 泳
后 , 所得峰形面积如表 3 。
按上表各平均值乡查标准曲线 , 得 R M V
接种后不同时间所测材 料 的病毒 含 量 (每
1 0闪 汁液中所含 。 g 数 )如表 4 。
将上述数据 , 绘制所测材料所含病毒量
变化折线如图 4。 从这 6组 共 1牙株 青菜 接
种 R M V 后病毒增殖量的变化情况看 , 在接
种 R M v 后的第 1天 , 带毒量最低 , 以后逐步
上升 。 在 3 、天后 , R M V 在青菜植株 中的 增
殖明显加速 , 以整株汁 液 (包 括所加 缓 冲
液 ) 计算为 7 4 7n g 和 i , 3 7 6n g (在 1 0协l 加
样液中 ) 。 R M V 接种后虽经过冲洗 , 但叶片
上还有残 留病毒 。 P o w er J B 等曾报道 〔 , 〕 ,
将 ` T M V 接种烟原生质体 , 接种初期在烟 原
生质体内 T M V 粒子数甚少 , 随后增多 。 中
国利学院微生物学研究所植 物病 毒组 也 报
道 e[J , 烟原生 质体 在接种 油 菜花 叶 病 毒
( Y M V )后 5 小时 , 病毒粒子数在烟原生质体
内最少 , 待 12 小时后病毒量逐渐增多 。 我们
的工作虽然是将 R M V 直接接种于青菜叶片
上 , 但也反映出在接种 R M V 后 , 病毒在植
株内有一最低量 ,然后病毒粒子迅速增多 。在
接种 3 天后 , 病毒的增殖似乎非常快 , 在 5
天后含量已很高 。 我们在其它一些研究工作
中也观察到类似的结 果 〔 7“ 〔幻 。 从 这 些 情 况
看 , 用本文介绍的技术对病毒进行定量检测
彻叼刚120哪
·
2 4仑·
和}研 ’ ,百其结果与国内外有关报道是 、 致的 。
六 、 `多过预备实验 ,获知比笆菠长 ,水工
作以 4 7 0 n m 为宜 。
七 、 本工作向 E L C A 工E 定量检 测 的 完
善化朝前跨出一步 。 如果进一步使 7 21 型分
光光度 计的检测灵敏摩提高 ; 使扫描峰的面
积经过仪器处理同步显示数字 ; 改善薄膜样
品土机测定的加样方法 , 尽量使抗原和酶标
抗体生成的棕色沉淀线在薄膜的最佳区域形
成 ,再加之使用高活性的酶标抗体 ,那么可以
预 不}· , 这项新建立的微量定量检测有关抗原
或抗体的溉。从 E , 有前能在运用领域甲替
代酶联免疫吸附测定 ( E L IS A ) 。 因为它的灵
敏 !蟹甚高 , 它不象 E L IS A 那样使抗原 或 抗
体物理吸附在载体表而 , 从而造成实验结果
的 不孑急定 。
(生物系绘图室陶惠 泞协助续制图丧 , 摄影宝傅文谕 、
姚斌协助拍摄照片 , 特此致谢 )
参 ` 考 文 .献
兰兮岌钾少书整尹’少伙擎x吧甲竺-” 介L, 、几 黔 g n 石 n , y “ o u r n a 1 0 , 、 。 ` e n ` , e ) 0 : u ` 甘 ,
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QU A N T I T A T I V E D EET c T I O N O F R I B G R A s s M o s A I c
。
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W I T n T H E 了E C H N I Q U E O F E N Z Y M E 一 L I N K E D
C E L L U L O S E A C E T A T E M E M B R A致 E I M M U N O 一
E L E亡士R O P H o R E s l s ( E L C A x E )
曰 尸 : 一
z hu 卫e i一ku n ( 朱培冲 ) et 沮 . 、
D “那` 孟, e。 ` of , B ”` 10夕夕 , 几 d a “ U ” `刃e 犷s 云`歹.
,J ’力。 p r e e iP i t in b a n d s ht at 恤 3 b e e n o b t几泣 e d 、 i : in g E L C A I B ( K EX U E T O N G B A L , A
入I曲 t址 y J o u r n 比 1 o f S e ie耽 e , 日( 1 9韶 ) , 6 7 0一 6 7 2 ) il : 、 、 · e b e e n o e a n e d a i , d r coe r dde b y t h e
r e l i t
·
t in g g e l司。 e t r o Pho r 。匀15 宝n就 a l l时 io n w i t h f in e l in e 3 r r e l a t主o n a n d g o od r e P才o d u e ib l。
r e g ul 切 .
卜’ i , ,毗 , a , 七吕 n d肠 r d 1in e h a s b e曲 由氏w n . R ib g r 比。。 M o。晶记 V宜r u s ( R M V ) w a , d i l u t e d i n
0
.
ZM , p H 7
.
2 bo
r i e a e id b u f fe r t o t h e f ol l o w in g e o n e e n t刃: t i o n s ( n g /户l ) : 1 0 , 2 0 , 4 0 , 6 0 , 8 0 ,
2 0 0
. 吕。 r j压l l y d i lu et d R M V a n t i g姐 ( e a七h od e ) a n d t皿 户1 o f t he 叨 z y 坦。 ( H O r s e r a d d is h F 。卜
( )戈 i一3a o e )一 l jn k ed an t ib o d y <
日n ed e ) 滋m p跳 w e r e 肠PP l ied t o the m em b r a n e s eP a r a t e l y . E l e e么r o -
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I ) l一o r o s }日 o f 。七an d时 d ,姗 P I。 功 u : 七 b e e o n d u e t thr e e o r o v e r t h r e e r eP 眼 t掀 l , . T h e r e叭 l t 3 o f
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e o l o u r i n g w i伍 t h e , u b o t r a俪 , w毋 e s 。良n n de a 且d r e co r dde 二` T h o m e几n
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q u a nt j t y
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《 丰 海 免 夜 学 杂 志》 编 样 部
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