全 文 ：酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术
检测长叶车前花叶病毒
朱培坤 陆 妙 康
(复 且 大 学 生 物 系 )
利用酶标记抗体与相应抗原进行醋酸纤维膜免疫电泳的技术 , 作者称之为酶标醋酸纤维
膜免疫电泳技术 . 该技术的主要特点是检测灵敏度高 , 本实验检测样品量可达 0 . 3 gn 长叶车
前花叶病毒 ,吸取浓度为 10 0 gn /耐 的抗原 3川 或更少就可以检测 , 样品用 t 少 , 检测结果用
滴加底物显色而观察 , 省略了蛋白质一般 染色方法 , 因此简便快速 , 并且结果便于保存和摄影 .
本工作将酶标醋酸纤维膜免疫电泳与对流免疫电泳 (琼脂糖 )和醋酸纤维膜免疫电泳分别
检侧长叶车前花叶病毒的结果进行比较 , 认为酶标酷酸纤维膜免疫电泳有值得推广的优点 .
本工作首先进行长叶车前花叶病毒抗原 、抗血清及其免疫球蛋白和酶标抗体的制备 (长叶
车前花叶病毒毒源由本室提供 ) . 将温室人工接种长叶车前花叶病毒的青菜病叶捣碎 , 用聚乙
二醉 ( PE G , 分子最 6 0 0 0 )沉淀病毒得粗提液 , 然后超速离心 ( 8 0 , 0 0 0 9 , 1 . 5小时 ) 得部分病
毒液 , 测紫外吸收光谱曲线 , 2 60 n m 处有最高吸收峰 ;电镜观察见大量长叶车前花叶病毒棒状
质粒 , 接种心叶烟产生枯斑 , 接种长叶车前产生花叶症状山 . 将此病毒作为抗原 , 非完全福氏
佐剂法免疫家兔 , 每周一次 , 共六次 . 测抗血清效价为 1 :2 0铭 . 上述抗血清 , 3 多饱和硫酸
按溶液沉淀三次 , 对声 7 .2 、 .0 01 M P sB 搅拌透析 , 除去硫酸按 , 得免疫球蛋白山 . 将辣根
过氧化物酶 (上海东风生化试剂厂 , R , ~ 3 . 0) 溶于浓度为 l gm /已 的免疫球蛋白中 (以 5 : 2
m g / lm 的比例 ) , 加人戊二醛 , 使其终浓度为 .0 “ 拓 , 充分混和后室温放置 4 小时 , 然后对 p H
夕.2 、 0 . 01 M P sB 透析去除残余戊二醛 , 即得酶标液囚 .
使用的醋酸纤维膜规格是 10 x l斗 。 m , 厚度为 10 dnU (上海市湖南化剂室 )
. 按常规方
法浇制琼脂糖板 .
酶标醋酸纤维膜免疫电泳 :
。 . 将长叶车前花叶病毒部分提纯液 , 以 p H .7 2 、 .0 2 M 的硼酸缓冲液进行连续稀释 , 配制
成以下的浓度 : 1 x 10 ,鳍 /nlr 、 1 x 10咭 n g /nlI 、 1 x 1 03 n g /ml 、 1 0 0 n g /ml 、 1 0 n g /nlr .
b
. 将上述醋酸纤维膜 ,先用软铅笔划好点样线 ,酶标抗体样点距膜边 3 c m , 抗原样点与酶
标抗体样点对距 3 c m , 二个样点横距 1 . , c m ; 然后在 p H 8 . 6离子强度 、 0 . 1的巴比妥钠盐酸缓
冲液浸湿 ,取出薄膜 ,用簿纸吸去表面水分 , 微升吸管点样 . 抗体 : 每样点酶标抗体液 10 川 ;抗
原 : 第一样点是对照 , 滴加 10 川健青菜蛋白溶液 , 第二 、三 、 四 、 五样点 , 长叶车前花叶病毒抗
原溶液各 10 产l , 浓度分别为 1 x l o s n g / lm 、 1 x 104 n g /耐 、 l x 1 03 n g / lm 、 1 0 0 n g / lm , 第六 、
七样点分别为 5 产l 、 3 产1, 浓度为 10 0 n g /ml , 第八样点 10 产l 浓度为 10 n g / lm , 第九样点 5产l
本文 19 81 年 2 月 9 日收到 .
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浓度为 1 0 n g /d .
电泳条件 : 电压 1 50 v , 电流强度 18 m A , 电泳时间 1 . 5 小时左右 , 电泳时抗体端接正极 .
电泳毕 , 将此膜在巴比妥食盐洗液中浸洗过夜 (浸洗一小时也能观察 ) , 每 10 0 0 lm 洗液中
有 , 0 耐 0 . I M 、 p H .8 2的巴比妥缓冲液 , 85 9 N acl , 其余皆是蒸馏水 . 浸洗后 , 将薄膜在清
水中漂洗 3一 5 分钟 ,取出后让水滴流干 ,然后滴加底物 3 , 3 ,一二胺基联苯胺盐酸盐 (简称 D A -B
4 H Q
,
7 5 m g D A B一 4H C I溶于 l o 0 lnI PH 7 . 6 、 0 . 0 5 M 的 T ir o H C I缓冲液中 ) 和 H p : ( 0 . 3 % ) ,
性几分钟内就会显示出棕色沉淀线 (图 1 ) . 从图 1 中可以看出 (从左到右 ) 对照 (系青菜健蛋
白溶液 )无棕色沉淀线 ,后为 1 x 10 , n g 、 l o o n g 、 10 n g 、 I n g 、 o . s n g长叶车前花叶病毒抗原样
品量均显示出棕色沉淀线 ( o . 3 gn 长叶车前花叶病毒也显示出淡棕色沉淀线 , 摄影底片未能反
映 ) , 随着浓度的高低显示出棕色的深浅和线条的宽窄 , 并且这些棕色沉淀线总是形成在同一
横线上 , 与酶标抗体样点距离均等同 .
长叶车前花叶病毒抗原与抗体浓度上 , 依常规对流免疫电泳 (琼脂搪 ) 的方法 , 做对照实
验 , 发现其最低检测值为 1 0 0 鳍 样品量 .
长叶车前花叶病毒抗原与抗体浓度上 , 依常规醋酸纤维膜免疫电泳的方法做另一对照实
验 ,发现其最低检测值为 10 0 gn 样品量 (图 2 ) .
图 1 酶标醋酸纤维膜免疫电泳
上端为酶标抗体样点 , 下端为扰原样点 .
图片中的沉淀线系酶标抗体与抗原长叶车前花叶病
毒反应后经底物显色形成 . 1 为对照 , 2 、 3 、 斗、 , 、
` 、 , 、 8、 9样品 t 分别为 l又 10 , 叩 、 1 0 0略 、 10略 、
l 鳍 、 0 . 5 n g 、 0 . 3叩 、 0 . I n ` 、 0 . 0 5 n g
图 2 醋酸纤维膜电泳
图片中沉淀线系抗体与抗原长叶车前花叶病毒反应
后经蛋白质染色后形成 . 从左到右 1、 2 、 3、 呼样品 t
分别是 1火 10 . n g 、 I K 10 , n g 、 10 0 明 、 1 0 n g , 图
2 与图 1电泳条件相同
’ 据此 , 酶标醋酸纤维膜免疫电泳的灵敏度要比醋酸纤维膜免疫电泳和对流免疫电泳高出
二个多数量级 . 在实验中 , 抗原曾点样 l 川 、 2 川也能显色 , 由于用酶底物显色 ,故不必配备蛋
白质染色液和洗脱液 、透明液 .
酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术简便快速 , 容易推广 . 只要制备了纯抗原和其相应的免疫
球蛋白 (抗血清效价不应呀盯于 , 12 ) , 并以此制备好酶标抗体 , 就能在常规电泳仪上进行操作 .
作者认为该技术可用于医疗卫生 、 化验 、动植物检疫等工作 , 也可用于病毒学 , 微生物学 、 免疫
学 、 生物化学 、 医学等学科的科研工作 . 目前 , 正进一步使酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术达到
定 i 的要求 .
致谢 : 王鸣歧教授予以支持 , 沈仁权教授予以帮助 , 电镜室观察长叶车前花叶病毒 , 傅文瑜技师摄影 , 特
此致谢 .
, 考 文 献
[ 1 ] 徐来升等 , 上海农业科技 , 3 ( 19 8 0 ) , 2 8一 3 1 .
1 2 ] 朱培坤 、蔡同润 , 复且学报 (自然科学版 ) , 19 81 , 2 : 192 一 19 8 .
[ 3 ] c 肠.kt M 一 F
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