全 文 ：西北林学院学报 1 9 9 5 , 1 0 ( 4 ) : 6 8~ 7 1
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河北杨体细胞抗盐性变异系的同工酶鉴定 `
李周岐 郭军战 李建梅 ’ 杨秀平
(西北林学院林学系 , 71 2 10 陕西杨陇 ;第一作者 : 男 , 3 岁 ,讲师 )
摘 要 以河北杨体细胞杭盐性变异来再生植株试 管苗为材朴 , 来用聚丙烯耽胺凝胶电
泳方法 ,对 7 个变异 来及其对照系的过乳化物晦同工畴 、 脂晦同工晦 、 苹果酸脱氮畴同工
峰 、 谷氛酸脱盘畴同工峰 、 异村稼酸脱盆峰同工峰 `乳酸脱氮晦同工畴进行 了分析 . 结果表
明 , 每个变异 来与对照来至少在一个畴讲上存在变异 ,从而 证明 : 7 个变异来均来突变体 .
关键词 河北杨 ; 突变体 ; 同工晦
分类号 5 7 2 2 · 3 1
以河北杨优树无性系一年生枝条为外植体诱导愈伤组织 , 以 N a CI 为选择剂 , 通过一步选
择和多步选择程序 , 从经两种不同诱变处理 ( . O C叮一射线和 EM )S 及未经诱变处理的愈伤组
织材料中进行了体细胞抗盐性突变体离体筛选 ,得到 7 个变异系〔` , 。 然而 ,这些变异系是生理
适应的结果还是真正遗传突变 , 尚需鉴定 。 关于鉴定突变体的标准 , 国际上未有统一定论 , M a -
ils
a (3) 认为 ,能证明在变异的细胞中有变化了的基因产物 , 可以做为突变的证据之一 。 酶是基因
的产物 , 是 D N A 遗传信息表达的结果 , 作为突变体鉴定的一个方面 ,本研究对河北杨体细胞
抗盐性变异系及其对照系进行了同工酶分析 。
1 材料与方法
1
.
1 供试材料
以河北杨 (尸。加 lu : he 介 t’ea s,’s H u et Cho w )体细胞抗盐性变异系及其对照系再生植株试管
苗为材料 。
1
.
2 试验方法
1
.
2
.
1 材料的培养 . 把变异系及其对照系再生植株试管苗剪成带一个腋芽的小段 ,插于生根
培养基 , 培养 Zod 后取其茎叶部分用于分析 。 以变异萦及其对照系试管苗的幼叶为外植体在脱
分化培养基上诱导愈伤组织 ,愈伤组织在扩繁培养基上继代培养 15d 后用于分析 。
生根培养基为 l/ ZM S + N A A O . 02 m g · L 一 ’ + 1 . 5 %蔗糖 , 脱分化培养基为 M S + BA .O
3m g
·
L
一 ’
+ N A A o
.
o 7m g
·
L
一 ’
+ 2
.
4 一 D o . Zm g 二 L 一 ` + 2 . 5%蔗糖 , 扩 繁培养基为 M S +
BA o
.
3m g
·
L
一 `
+ N A A o
.
o 7m g
·
L
一 `
+ 2
、
4一 D o . l m g · L 一 ’ + 2 . 5%蔗糖 .
培养条件 : 以 日光灯为光源 , 照度 3 o 0 lx ,每 日光照 12 士 hl ,培养室温度 25 士 1℃ 。
. 收稿 日期 1 9 9 5一 0 6一 1 2
, 本研究为国家 “ 七五 ”攻关项 目 .
二 西北林学院水土保持 系 95 届毕业生 。
4 期 李周岐等 : 河北杨体细胞抗盐性变异系的同工酶鉴定
1
.
2
.
2 晦液的制备 每系号分别称取茎叶材料 0 . 69,加 0 . 6m L PH S
.
o 的 T ir s一 H a 提取液 ,
称取愈伤组织材料 1 . 7 8 9 ,加 1 . 78 m L p H S . o 的 T ir s 一 H a 提取液 ,冰浴研磨 , 。℃下提取 hl ,
4 o or / m in 下离心 15 m in ,倒出上清液加等体积 40 %蔗糖备用 。
,1
.
2
.
3 同工晦分析 采用聚丙烯酞胺凝胶垂直平板电泳 , 凝胶浓度为 10 % 、 p H 值为 8 . 8 , 电
极缓冲液为 pH S . 3 的 I M T isr 一 H G , 37 ℃温箱中染色 ,待酶带清晰后 , 用蒸馏水漂洗 2一 3 次 ,
7 %乙酸脱色 ,记录酶谱 ,拍照并制成干板 。 共分析了苹果酸脱氢酶 、 谷氨酸脱氢酶 、异柠檬酸脱
氢酶 、乳酸脱氢酶 、 过氧化物酶 、 醋酶 6 种同工酶 ,重复 3 ~ 5 次 ,谱带表现稳定 。 由于每种同工
酶在上述两种材料中活性强弱不同 ,所以 , 以活性较强的一种材料的谱带为准进行分析 。 其染
色液组成如下⑦ :
苹果酸脱氢酶 : l m o lD L一苹果酸钠盐溶液 ( p H 7 · o ) s m L 、 N A D 2 5m g 、 N B T 1 5m g 、 PM S
i m g
、
0
.
Zm o l T ir s一 H C I溶液 ( p H S . o ) l o m L 、无离子水 3 5m L .
谷氮 酸脱氢酶 : L一谷 氨酸 钠 6 0 0 m g 、 N A D 3 o m g 、 N B T 3 o m g 、 p M S s m g 、 o · Zm o l T r is一
H C I溶液 ( p H S . o ) 5 0m L 。
异柠檬酸脱氢酶 : 0 . l m o l 异 柠檬 酸钠盐 溶液 ( p H 7 . o ) s m L 、 T r i s 一 H C I 溶液 ( p H S · o )
1 0m L
、 无离子水 3 2m L 。
乳酸脱氢酶 : l m o l D L一乳酸钠盐溶液 ( p H 7 . o ) s m L 、 N A D 2 5m g 、 N B T 1 5m g 、 PM S l m g 、
0
.
Zm o l T r is一 H C I溶液 ( pH S . o ) l o m L 、 无离子水 3 5m L 。
过氧化物酶 : 醋酸联苯胺溶液 s m L 、 3% H 20 2 Zm L 、无离子水 93 m L 。
醋酶 : 坚固蓝 R R 盐 3 0功 g 、 p H 6 . 4 磷酸缓冲液 30 m L , 2% p一醋酸蔡醋溶液 l m L 。
一ù
2 结果与分析
2
.
1 苹果酸脱氢酶同工酶谱
从 图 1 可以看出 , 苹果酸脱氢酶同工
酶总共分离出 4 条酶带 , 其中 R f 为 0 . 0 68
和 0 . 1 0 2 的 2 条酶带为 7 个变异系及其对
煦系所共有 , 变异系 L 。 缺 R , 为 .0 0 05 的
酶带 , 变异系 L : 缺 R , 为 0 . 9 95 的酶带 , 从
酶的活性来看 ,变异系 L 7R , 为 0 . 0 05 的酶
带 活性较弱 , 为二级带 , 而在 W 。 、 L , 、 L Z 、
L 3
、
L ;
、
L
。 中为 一级带 , 变异 系 L : 和 L 6 fR
为 0 . 10 2 的酶带活性较弱 , L : 为二级带 、
L
. 为三级带 , 而在 W 。 、 L , 、 L : 、 L ` 、 L S 、 L 7 中
为一级带 。
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
留吕 吕男弓 吕吕召 告舀吕 吕吕
住.0
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. 2刀困 口2 石 2 匡刀久 月 叱乙口刀
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图 1 苹果酸脱氢酶同工酶酶谱
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.
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n z y m呛ar m s of M D H
2
.
2 谷氨酸脱氢酶同工酶谱
从图 2 可以看出 ,谷氨酸脱氢酶总共分离出 2 条酶带 , 其中 R , 为 0 . 1 54 的酶带为 7 个变
异系和对照系所共有 ,变异系 L 。 缺 R , 为 0 . 1 30 的酶带 。 从酶的活性来看 ,变异系与对照系之
间没有变异 .
西北林学院学报 1 0卷
2
.
3异柠橄酸脱氮酶同工酶谱
从图 3可以看出 , 异柠橄酸脱氢酶总共分离出 2 条酶带 , 其中 R , 为 0 . 09 的酶带为 7个变
异系及其对照系所共有 ,变异系 L . 缺 fR 为 o : 9 95 的酶带 . 从酶的活性来看 ,变异系 L S R , 为
0
. ” 5的酶带活性较弱 , 为三级带 ,而在 W o 、 L : 、 L : 、 L : 、 L . 、 L , 中为二级带 。
2
.
4 乳酸脱氮酶同工酶谱
从图 4 可以看出 ,乳酸脱氢酶总共分
离出 3 条酶带 , 从酶带数和酶的活性来看 ,
变异系与其对照系均无变异 。
.2 5 过载化物曲同工酶诺
从图 5 可以看出 ,过氧化物酶同工酶
总共分离出 12 条醉带 , 其中 R ` 为 。. 167 、
0
.
2 3 6
、
0
.
3 9 3
、
0
.
6 2 1
、
0
.
6 7 1
、
0
.
7 2 9
、
0
.
7 7 9
、
0
.
1 5 4
仁二二目 ` 二二翻 ` 二二二 ` 二二二 , ` 二二二刁 ` `二二刁 `二二二 J口皿翻. 口口刀国 口目口 . . 2 口困 口口 2刀 . 口口 . 口二,口 目口口口
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图 2 谷扭酸脱盆蔺同工醉曲谱
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0 9 0 `二: 二 仁二二J ` 二二 , e 二 : 二 C : 二 j 己二口 仁二二口 口二二二 0 . 0 6 7 召口口 口出口二 口盆盖1困 口口皿翻 口口盆刀
七二二二】 七二二二 J 仁二二口 仁二二 j l: 二: 二
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L : L
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图 3 异柠一酸脱红醉同工曲阵谱
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8 2 1
、
0
·
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、
0
.
9 5 0 的酶带为 7 个变异系
及其对照系所共有 。 变异系 L : 、 L 3 、 L 。 、 L ,
比对照 系 W。 多 1 条 R , 为 0 . 7 5 0 的二级
带 , 变异系 L , 、 L : 、 L . 、 L : 比对照系 W o 多 1
条 R , 为 0 . 879 的三级带 . 从酶的 活性来
看 ,同一 R `值的酶带在变异系与对照系之
间无变异 。
2
.
6 醋酶同工酶谱
从图 6 可以看 出 , 醋酶同工酶总共分
离出 6 条酶带 , 其 中 R , 为 0 . 2 2 3 、 0 . 2 9 6 、
.0 70 3
、
.0 75 7 的 4 条酶带为 7 个变异系及
其对照系所共有 。 变异系 L : 、 L ` 、 L S 、 L . 比
对照系 W。 多 1 条 R f 为 0 . 142 的酶带 ,变
图 4 乳酸脱且陇同工曲酶谱
F咭. 4 T he i枕川寸m 例犷 . m . of L D H
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
口皿. 目 月翻翻口 吕. 口口 . . 目 . 日. . 翻 . . . 吕. . . . . 侣 . 口月
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图 5 过载化物陇同工醉酶谱
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.
5 T h e i袱 n z丫m o 盯 a m s of 件m x id a se e n “帅 e s
异系 L : 比对照系 W。 多 1 条 R . 为 。 . 7 97 的酶带 。 从酶的活性来看 ,同一 R ; 值的酶带在变异系
与对照系之间无变异 。
3 结论
M a ilz
。闭认为 , 真正的高等植物的细胞突变体 , 必须在 D N A 一级结构上发生能遗传的变
4 期 李周岐等 : 河北杨体细胞抗盐性变异系的同工醉鉴定
化 ,这种变化不是由于遗传分离或遗传重
组引起的 。具体地讲 ,对能分化成植株的细
胞株 , 其变异性状应在此植株的后代或由
此植株产生的培养细胞中表现出来 ,对不
能分化成植株的细胞株 , 应能找到基 因产
物变化的证据一直接的如组成蛋白质的氨
基酸发生改变 , 间接的如调节酶的反馈敏
感性发生了改变 。 除此之外 ,都只能算作表
型变异体 ,而不能算作突变体 . 据此 , 由于
在 6 种同工酶酶谱上 , 每个变异系与对照
. , . . . . 口 . . 翻 . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . 口 . . . . . . 皿口
七二二二 侣二 , 口二二 七二二: `二目 侣二二 1
仁二二, 仁二二 ` 二二 仁二二 `二二 己二二
亡二口 口二二 仁二二 C二二 亡二二 亡二二
. . . .
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一 L . L . L一 L ,
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`.划目,臼,曰心.J7月了-心移心勺05,19曰心山7t了.目.0
图 6 西醉同工醉醉谱
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系至少在一种醉谱上出现变异 ,从而证明 7个变异系 L : 、 L : 、 L : 、 L . 、 L 。 、 L 。 、 L , 均系突变体 。 当
然 , 酶谱上的这些变异与抗性的关系如何 ,有待研究 .
本文承 , 王妹清教授审阅 , 特此致谢 。
参 考 文 献
李周岐 ,周志华 ,辐军战娜 · 河北杨体细脸扰盐性突变体离体沛选的研究 . 西北林学院学报 , 1 9 95 , 1。 ( 3 ) : i ~ 7
胡能书 , 万国资 . 同工醉技术及其应用 . 长沙 : 湖南科学技术出版社 , 1 9 85 , ” ~ 84
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