全 文 ：　第 30 卷第 2 期
2011 年 3 月 　 　 　　　　 　
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Journal of Food Science and Biotechnology
　 　 　　　　　Vol.30　No.2M ar.　2011
　文章编号:1673-1689(2011)02-0261-06
　　收稿日期:2011-01-10
　　基金项目:国家自然科学基金项目(31071582);浙江省自然科学基金项目(Y3080231);浙江省钱江人才计划项目
(2009R10033);浙江省科技计划重点项目(2007C12015)。
作者简介:翁佩芳(1963-),女 , 上海人 ,副教授 , 主要从事农产品加工方面的研究。
＊通信作者:吴祖芳(1963-),男 , 浙江奉化人 ,工学博士 , 教授 , 硕士研究生导师 , 主要从事食品生物技术方面的
研究。 Email:wuzufang06@yahoo.com.cn
SSCP 方法的条件优化与榨菜低盐
腌制微生物多样性分析
翁佩芳1 , 2 , 　吴祖芳＊1 , 2 , 　龚业1 , 2 , 　张 锐1 , 2 , 　沈锡权1 , 2
(1.宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室 ,浙江 宁波 315211;2.宁波大学 生命科学与
生物工程学院 ,浙江 宁波 315211)
摘　要:应用单链构象多态性(SSCP)方法研究榨菜低盐腌制条件下的微生物群落结构与变化。
研究了凝胶质量浓度 、电泳前处理 、银染操作条件对 SSCP 分析方法的影响 。结果表明 ,在凝胶质
量浓度为 22 g/dL 、丙烯酰胺与双丙烯酰胺质量比为 29∶1 ,并加入体积分数 6%的甘油 , 4 ℃条件
下 1×TBE 缓冲液中 250 V 电泳 18 h ,通过强碱性显影液和甲醛作还原剂的银染方法显色 ,可以
获得理想的 SSCP 图谱 。对榨菜低盐腌制不同时期样品的 SSCP 图谱分析结果 ,发现在榨菜腌制
初期优势菌群为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),随后转变为植物乳杆菌(Lactobacil lus
plantarum)和短乳杆菌(Lactobaci llus brev is)占优势;腌制后期主要存在的优势菌群为植物乳杆
菌和 Lactobaci l lus versmoldensis ,结合感官分析证实这些优势乳酸菌对保持制品高品质具有功能
作用。
关键词:榨菜;PCR-SSCP ;电泳图谱;条件优化;微生物多样性
中图分类号:TS 255 文献标识码:A
Optimization of SSCP Condition and Diversity of Microbial Community
in Pickled Mustard Tuber with Low Salinity
WENG Pei-fang1 , 2 , 　WU Zu-fang ＊1 , 2 , 　GONG Ye1 , 2 , 　ZHANG Rui1 , 2 , 　SHEN Xi-quan1 , 2
(1.Key Labo rato ry o f Applied Ma rine Bio technolog y , Minist ry o f Education , Ningbo Univer sity , Ningbo 315211 ,
China;2.Faculty of Life Science and Biotechno log y , Ningbo Univ ersity , Ningbo 315211 , China)
Abstract:M icrobial community and its change s in pickled mustard tuber were investig ated at the
low salinity by using sing le-strand confo rmation po lymo rphism (SSCP)method.Effects o f gel
concentra tion , glycerol addit ion , foret reatment of elect rophoresis and silver staining methods on
SSCP pa ttern w ere also examined in this manuscript.The results demonst rated that an ideal
SSCP me thod w as obtained as the optimum condi tions , gel concentra tion of 22 g/dL at the
crosslinking deg ree o f 29∶1(a rat io of acrylamide and bisacry lamide), g lycerol concentration of
6%, vol tage of 250 V , elect rophoresis buf fe r o f 1×TBE , elect ropho resis at 4 ℃ fo r 18 hours ,
and using si lver staining method of strong alkaline solution and formaldehyde as reducing agent.
Based on the optimized SSCP method for pickled leaching liquid measurement , i t w as found that
the Leuconostoc mesenteroides is the dominant micro org anism in the init ial stage of pickling , then
Lactobaci llus p lantarum and Lactobaci llus brev is g row n up w ith the alterat ion o f envi ronmental
conditions.At the later stage , the dominant microo rganism are Lactobaci l lus p lantarum and
Lactobaci llus versmoldensis , respectively .The contribution o f lact ic acid bacte ria w as confirmed
by microbial communi ty st ructure analysis in pickled mustard tuber w ith low-salinity , which is
carried out by combining the senso ry evaluation method.
Key words:mustard tube r , PCR-SSCP , elect rophoresis pat tern , condit ion optimizat ion ,microbial
diversity
　　传统的榨菜腌制加工由于采用高盐浓度来抑
制微生物繁殖 ,由此加工方式带来的高盐废水对环
境产生污染或带来很高的处理成本 ,不利于现代蔬
菜加工向绿色 、健康与高效益的生产方向发展[ 1-2] ;
研究表明[ 2-3] ,在低盐腌制条件下经合适的生产条
件 ,可改善蔬菜风味 、增进食欲 ,提高腌制菜的营养
价值。其中的微生物(乳酸菌)对蔬菜的保藏与品
质维持发挥重要作用[ 2-4] ,乳酸菌是保持腌制菜较
高营养价值和质地的主要微生物 。但如果条件控
制不当 ,腌制过程中也会出现杂菌污染或过量繁殖
导致产品的劣败[ 5] 。到目前为止 ,在低盐条件下榨
菜腌制保存不同阶段的微生物群落组成 、优势菌群
及变化规律仍不明确 ,研究蔬菜腌制过程中微生物
区系的多样性并揭示其功能可为榨菜加工产业实
现清洁生产新工艺提供微生物学证据 。
环境样品中微生物组成及数量变化测定的传
统方法是采用平板培养方法[ 6-7] ,但由于自然样品
中多种微生物很难培养 ,给这些方法带来很大的局
限性 ,从而造成微生物区系分析的误差 。目前已有
较多的文献报道用分子鉴定方法检测乳酸菌[ 8-10] ,
随着分子生物学技术的发展 ,单链构象多态性(Sin-
gle-S trand Conformation Polymorphism , 以下简写
SSCP)技术也已发展成为一种高通量 、使用简便快
速及准确性较高的方法而被应用于微生物群落结
构等的分析[ 11-13] 。其基本原理是经过 PCR扩增的
DNA 片段 ,经变性解链产生的 DNA单链依据各自
不同的碱基序列进行配对折叠成一定的空间构象 ,
不同碱基序列 DNA 单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶
中电泳时 ,因其构象的差异会引起迁移率的改变 ,
显色后就会得到不同的带型 ,即多态性。因此 ,该方
法在检测基因突变方面有较为广泛的应用 ,但针对不
同来源样品 SSCP 方法的结果也易受各种因素的影
响 ,而出现诸如条带不清 、难以辨认等各种情况[ 14] 。
作者从聚丙烯酰胺凝胶组成与质量浓度 、添加
物 、电泳前处理及银染等方面对 SSCP 方法进行优
化 ,通过优化 SSCP 操作条件 ,旨在研究榨菜低盐腌
制体系的微生物群落结构与优势菌群的变化规律 ,
从而可阐明不同种类乳酸菌在榨菜腌制保藏中所
发生的作用及功能定位 ,为进一步优化生产工艺和
产品质量的控制提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
腌制样品液:榨菜腌制与腌制汁液的制备按文
献[ 3]方法进行。分别取榨菜腌制过程 4个不同时
间点(腌制开始后的第 2天 、5天 、15天 、35 天)的腌
制液 ,记为 1-4号样品。
主要试剂:APS 、T EMED 、丙烯酰胺 , T ris-碱 、
二水二乙胺四乙酸二钠 、氢氧化钠 、碳酸钠和硼酸
等:由生物工程(上海)有限公司提供;N ,N -亚甲基
双丙烯酰胺:由国药集团化学试剂有限公司提供;
二甲苯菁和硝酸银:由 BIO BASIC. INC 提供;甲
醛:由宜兴市第二化学试剂厂提供;以上试剂均为
分析纯 。乙酸 ,化学纯 ,由宜兴市第二化学试剂厂
提供。
乳酸菌检测培养基和细菌平板计数培养基:分
别为 MRS培养基和普通营养琼脂培养基[ 3] ,pH 调
至 6.8 ,115 ℃灭菌 20 min。
1.2　主要仪器与设备
梯度 PCR仪和 5424型高速离心机 ,德国汉堡
Eppendo rf;WD-9405B 型水平摇床 、DYY-8C 型电
泳仪 、24EN 型制胶器等 。北京六一仪器厂制造;
LRH-190-S 型恒温恒湿培养箱:广东省医疗器械厂
制造。
1.3　方法
1.3.1　样品总 DNA 的提取与 PCR的扩增　将腌
制液样品用无菌纱布过滤 ,10 000 g 离心 5 min ,去
上清液。用改进的 SDS 高盐提取法提取样品总
262 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 30卷　
DNA 。将样品中加入 500 μL 裂解缓冲液(0.1
mol/L Tris-HC l , 0.1 mol/ L EDTA , 1.5 mo l/L
NaCl ,1 g/dL CTAB;pH 8.0), 20 μL 溶菌酶(25
mg/mL),于 37 ℃处理 40 min;加入 5 μL 蛋白酶 K
(10 mg/mL)于 37 ℃处理 40 min.;再加入 120 μL
SDS(10 g/dL), 65 ℃处理 2 h;粗提的 DNA 由酚/
氯仿/异戊醇(体积比 25∶24∶1)法提取[ 15-16] 。
PCR扩增采用引物为 f341(5′-CTCCTACGG-
GAGGCAGCAG-3′)及 r533(5′-T TACCGCGGCT-
GCTGGCA-3′),其中反向引物 r533的 5′端采用磷
酸标记 ,由上海英骏生物技术有限公司合成并标
记 。PCR 反应体系为:10 ×PCR Buf fer 2.5 μL ,
dNTP(2.5 mmol/ L)2 μL ,正向引物(10 μmol/ L)
1.0μL ,反向引物(10 μmol/L)1.0 μL , DNA 聚合酶
(5 U/μL)0.25 μL ,MgCl2(25 mmol/ L)2.0 μL ,模板
DNA 1.0 μL ,用超纯水补足反应总体积至 25 μL。
1.3.2　加热变性与酶切　经上步扩增得到的 PCR
产物与上样缓冲液(体积分数 95%的去离子甲酰
胺 、10 mmol/ L NaOH 、20 mmol/ L EDTA 和 0.02
g/dL 溴酚蓝及 0.02 g/dL 二甲苯菁)混匀后 ,在高
温下变性数分钟后马上冷却以保持单链构象。酶
切:由λ核酶外切酶 2 μL ,10×buf fer 2 μL ,PCR产
物 30 μL ,37 ℃温浴 4 h。后经 72 ℃灭活 10 min
λ核酸外切酶 ,此酶切过的 PCR产物与上样缓冲液
混匀 ,即可进行点样操作。
1.3.3　凝胶制备与预电泳　实验设计了 3个凝胶
质量浓度(分别为 22 、14 、9 g/dL), 质量浓度为:
(ACR体积/总体积)×30%,其中 ACR(丙烯酰胺
29 g , N , N′-亚甲基双丙烯酰胺 1 g ,水 100 mL ,交
联度为 29 ∶1)。再向其中加入 3.36 mL 的 5×
TBE(54 g Tris碱 ,27.5 g 硼酸 , 20 mL 0.5 mo l/L
的 pH 值为 8.0 的 EDTA ,定容至 1 L), 80%的甘
油 1.032 mL , 10%的A PS 115.2μL , TEMED 12.0
μL ,最后用 ddH2O 使各浓度混合液的体积一致。
在没有样品情况下 250 V电压下预电泳 30 min 。
1.3.4　银染　采用两种不同的银染方法 ,分别为
采用 3 g/dL NaCO 3 200 mL , 加 100 μL 硫代硫酸
钠 ,4 ～ 10 ℃显色 3 min和显影液(NaOH 粉末 6 g ,
37%甲醛 1 mL ,双蒸水 200 mL)显影 ,比较条带显
色效果 。
1.3.5　条带的分离 、克隆与测序　特异条带由 EZ
Spin Co lumn PAG E Gel DNA Ex traction Kit(上海
生工生物公司)进行回收 。取回收的 DNA 1 μL 为
模板 ,以 f341 和 r533 为引物 ,采用前体系和 PCR
程序进行扩增 ,琼脂糖电泳 , PCR产物切胶纯化(纯
化试剂盒由上海生工生物公司提供),按产品说明
书克隆进 T-载体(pMD-18-T ,宝生物(大连)有限公
司)。采用蓝白斑及 PCR方法筛选转化子 , PCR直
接以白斑菌落为模板 ,采用能与 T-载体插入点两侧
特异结合的 M13通用引物进行检测 。每条带选取
2 ～ 3个克隆 ,同样以 M13通用引物进行测序 ,测序
由上海英骏生物技术有限公司完成。通过 Blast软
件 ,将测序获得的序列与 GenBank 进行比对 ,得到
相似性大小 。
2　结果与分析
2.1　凝胶质量浓度对 SSCP结果的影响
聚丙烯酰胺在凝胶中的不同比重会影响凝胶
中水分的质量分数 ,从而直接导致泳动率的改变 。
试验设置 3个质量浓度 9 ,14 ,22 g/dL ,取榨菜腌制
液 1 ～ 4号样品 ,分别以总 DNA 扩增产物作为样品
进行垂直电泳 ,实验结果见图 1。
从图 1可以看出 , 9 g/dL 的凝胶条带分散 ,颜
色浅淡 ,虽然分离度较好 ,但条带模糊不清 ,不易于
观察 ,凝胶本身韧性不好 ,容易在显色过程中破碎 ,
影响结果分析 ,也增加了操作难度;14 g/dL 的条带
较多 ,但分离效果欠佳 ,难于分辨;22 g/dL 的凝胶
分离效果较为理想 ,条带也较清晰 ,多样性好 ,条带
有较好的可读性 。综上结果 ,取 22 g/dL 为最佳的
凝胶质量浓度。
1 、2 、3 、4分别为 1～ 4号样品
图 1　凝胶质量浓度对 SSCP 影响的效果对比图
Fig.1　Ef fect of gel concentration on SSCP results
263　第 2期 翁佩芳等:SSCP 方法的条件优化与榨菜低盐腌制微生物多样性分析
　　从图 1可以看出 , 9 g/dL 的凝胶条带分散 ,颜
色浅淡 ,虽然分离度较好 ,但条带模糊不清 ,不易于
观察 ,凝胶本身韧性不好 ,容易在显色过程中破碎 ,
影响结果分析 ,也增加了操作难度 。14 g/dL 的条
带较多 ,但分离效果欠佳 ,难于分辨;22 g/dL 的凝
胶分离效果较为理想 ,条带也较清晰 ,多样性好 ,条
带有较好的可读性。综上所述 ,取 22 g/dL 为最佳
的凝胶质量浓度。
2.2　甘油体积分数对 SSCP结果的影响
甘油具有保湿的作用 ,对单链 DNA 在凝胶中
的泳动速度及提高条带的分辨率可能产生影响。
结合文献[ 14] ,设定甘油的体积分数为 6%,以空白
作对照 ,比较条带分离效果 ,结果见图 2 。
1 、2 、3 、4分别为 1～ 4号样品
图 2　凝胶中添加体积分数 6%甘油对 SSCP影响
Fig.2　Effect of 6% glycerol in gel on SSCP results
　　从图 2可以看出 ,加入 6%甘油的凝胶电泳效果
(图 2左侧)明显优于后者 ,不仅条带清晰 ,分离效果
好 ,泳道也较为匀称 ,泳动时间缩短;而对照组未加入
甘油的凝胶条带模糊 ,不利于进一步的回收操作。
2.3　预电泳对 SSCP图谱的影响
预电泳是指将凝固好的凝胶先不直接进行点
样操作 ,而是先放入装有电泳缓冲液的电泳槽中 ,
在没有样品的情况下以电泳时采用的电压电泳一
段时间 。本试验中 ,预电泳时间设置为 30 min ,实
验效果见图 3。
1 、2 、3 、4分别为 1～ 4号样品
图 3　预电泳对 SSCP 图谱结果的影响
Fig.3　Effect of prerunning on SSCP electrophoresis map
　　从图 3可以看出 ,电泳之前经过预电泳处理的
凝胶 ,得到的条带比较直 ,清晰度高 ,效果明显好于
对照组 。通过预电泳处理 ,可能是由于可除去凝胶
中没有聚合的单体及聚合引发剂 ,从而提高了条带
的清晰度。
2.4　银染方法对 SSCP图谱的影响
银染操作是 SSCP 分析方法中最常用的染色方
法 ,该方法不需要对引物或 dNT P 做任何修饰 ,也
不用专门的检测设备 ,结果直观 ,用肉眼即可观察 。
作者采用硝酸银染色法 ,方法之一是其中的还原剂
为甲醛与硫代硫酸钠 ,在银染之前需用甲醛处理 5
～ 10 min;另一方法是每步银染操作前后均插入洗
脱步骤 ,显影液为强碱性 ,还原剂为甲醛 ,显色时间
为 20 ～ 30 min ,实验结果见图 4 。从图 4的 SSCP
图谱结果可以看出 ,采用方法一进行显色时(图 4
左侧),凝胶在显色液中迅速变色 ,背景不断加深 ,
而未见明显的条带 ,约 2 min 后 DNA 条带隐约可
见 ,但此时整个背景已呈青黑色 ,需在强光条件下 ,
才能对条带进行观察 。该方法对水的去离子状态
要求相当严格 ,容易造成聚丙烯酰胺凝胶背景过
深 ,影响判读。而银染操作中插入洗脱步骤 ,强碱
性的显色液 ,显色结果为胶的背景清亮 ,条带清晰
(图 4方法二),有利于结果的判读 ,而且这种方法
对水的要求不严格 ,因此 ,采用方法二银染操作 。
1 、2 、3 、4分别为 1～ 4号样品
图 4　银染方法对 SSCP 图谱的影响效果图
Fig.4　Effect of silver staining method on SSCP electro-
phoresis map
2.5　优化的 SSCP 方法对低盐腌制榨菜过程微生
物群落结构多样性分析
由以上分析 SSCP 图谱效果的重要影响因素的
实验结果 ,对各因素进行优化组合 ,试验条件为凝
胶质量浓度为 22 g/dL 、丙烯酰胺与双丙烯酰胺质
量比为 29∶1 ,并加入体积分数 6%的甘油 , 98 ℃变
性 10 min ,4 ℃条件下 1×TBE 缓冲液中 250 V 电
泳 18 h ,使用强碱液作显色剂。对在最适工艺条件
下制作的低盐腌制榨菜不同阶段样品(样品 1 ～ 4)
进行微生物群落结构及变化分析 ,试验结果见图 5。
　　实验结果获得的 SSCP 图谱条带较清晰 ,达到
了理想的效果。然后根据条带的相对亮度 、丰度等
结合 1.3.5方法来分析不同腌制阶段的微生物种
类及其变化 ,经过 Blast软件和 Genbank 序列比对
结果 , 共检测到的微生物分别有肠膜明串珠菌
(Leuconostocmesenteroides)、植物乳杆菌(Lactoba-
264 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 30卷　
1 、2 、3 、4分别为 1～ 4号样品
图 5　优化的 SSCP方法下样品的微生物群落分析结果
Fig.5　Performance of microbial community at the opti-
mum operating condition of SSCP method
cil lus plantarum)、短乳杆菌(Lactobaci llus brevis)
、Lactobaci llus versmoldensis 、毕赤酵母属(P ichia
sp.)、伊萨酵母(Issatchenk ia sp.)(这些菌种其相
似性均达到 100%)和弧菌属 (Vibrio sp.)(相似性
达 95%)等 。根据被选择条带的信息(丰度 、亮度
等)得到在腌制发酵初期 ,肠膜明串珠菌为主要的
优势菌群。随着腌制环境条件的变化 ,出现了植物
乳杆菌和短乳杆菌。在腌制保存后期起主导作用
的微生物为植物乳杆菌和 Lactobaci llus versmol-
densis 。这些实验结果可为进一步分析榨菜低盐腌
制过程中质量品质维持相关的乳酸菌类型及功能
提供基础。
3　讨　论
以前研究表明[ 12] , SSCP 分析对于小于 400 bp
的 PCR产物最有效 ,而本试验所采用的 DNA 来自
低盐腌制体系的各个腌制时期 , 其片段长度均为
200 bp左右 ,适合进行 SSCP 法分析 。凝胶的组成
及配比直接影响到电泳结果 ,主要是引起凝胶中水
分质量分数的改变 , DNA 单链在低浓度的凝胶中
泳动速度较快 ,可能会造成条带模糊 ,只有在合适
的凝胶质量浓度下各单链的迁移速度差异较大 ,可
使条带清晰 ,显示出多态性。从甘油添加对 SSCP
效果影响结果 ,表明甘油具有加快泳动速度和去除
杂带的作用 ,甘油具有保湿作用 ,因此凝胶中甘油
的加入减少了凝胶中水分的损失 ,保证泳道通畅 ,
同时也加快了条带的泳动速率 ,缩短了电泳时间。
另一方面 ,低体积分数的甘油能够稳定单链 DNA
的三维结构 ,从而提高条带的分辨率 , 这与文献
[ 17]报道的结果一致。银染操作是 SSCP 图谱获得
的必经步骤 , 采用甲醛与硫代硫酸钠为还原剂显
色 ,容易造成聚丙烯酰胺凝胶背景过深 ,影响判读 ,
同时该方法对水的去离子状态要求相当严格;而每
步银染操作前后均插入洗脱步骤 ,显影液为强碱
性 ,还原剂为甲醛 ,在这样的条件下可能是被固定
剂固定到凝胶的核酸与银染剂中的银离子结合较
牢固 ,再通过还原剂将银离子还原 ,从而发生银棕
色显色反应 ,标示出核酸的位置 ,形成较清晰的条
带 ,显色效果较理想。
由不同腌制时期样液的 SSCP 图谱分析结果 ,
榨菜腌制初始阶段 ,附着在榨菜鲜头上具有兼性和
厌氧性微生物 ,在菜体切割处理及在盐的作用下 ,
榨菜表面渗出的汁液非常适宜肠膜明串珠菌的生
长繁殖 ,肠膜明串珠菌作为优势菌群起到了发酵起
动剂的作用 ,它产生二氧化碳和酸很快使 pH 值下
降 ,阻止了其他有害微生物的生长;同时 ,肠膜明串
珠菌能将多余的糖转化为甘露醇和葡聚糖。这种
腌制环境条件的改变 ,随后其它乳酸菌按一定的顺
序生长 。中期过程以植物乳杆菌快速生长繁殖 、产
酸 ,在榨菜腌制中起主导作用 。短乳杆菌能够发酵
戊糖 ,使产品具有独特的风味 。整个腌制过程经感
官品评产品口感脆嫩 、风味浓郁。在腌制后期可发
酵性碳水化合物全部被利用完后 ,加上腌制环境
pH 值太低 ,乳酸菌的生长繁殖就会受到抑制 ,发酵
的结果是产生乳酸和乙酸 。另外 ,蔬菜原料的缓冲
能力和可发酵性碳水化合物的含量是控制乳酸发
酵 、酵母发酵程度的重要因素。
4　结　语
1)聚丙烯酰胺在凝胶中的质量浓度控制在 22
g/dL 时具有较好的分离效果 ,条带清晰具可读性;
在凝胶中添加体积分数 6%甘油其泳道匀称 ,可缩
短电泳时间 。
2)经 250 V 、30 min的预电泳处理的凝胶 ,得
到的条带比较直和清晰度高 。银染操作时每步均
插入洗脱步骤 ,显色液为强碱性 ,还原剂为甲醛 ,显
色时间为 20 ～ 30 min ,凝胶显色后条带较清晰 。
3)榨菜腌制液 SSCP 分析方法的优化条件为
凝胶质量浓度 22 g/dL ,加入体积分数 6%的甘油 ,
在 98 ℃变性 10 min ,4 ℃条件下 1×TBE缓冲液中
经 250 V电泳 18 h ,使用强碱液作显色剂。经优化
的 SSCP 方法分析不同阶段腌制液样品的结果:得
到榨菜不同腌制阶段(前 、中与后期)的优势菌种分
别为肠膜明串珠菌 、植物乳杆菌和短乳杆菌 ,最后
阶段为植物乳杆菌和 Lactobaci llus versmoldensis。
致谢:本项目部分得到教育部留学回国基金的
资助一并致谢。
265　第 2期 翁佩芳等:SSCP 方法的条件优化与榨菜低盐腌制微生物多样性分析
参考文献(References):
[ 1] 赵红丽 , 夏洁如 , 李一男 , 等.榨菜产业发展现状及前景[ J] .中国酿造 , 2008 , 20:11-13.
ZHAO Hong- li , XIA Jie-ru , L I Yi-nan , et al.Development of mustard tuber industr y[ J] .Chinese Brewing , 2008 , 20:11
-13.(in Chinese)
[ 2] 吴祖芳 , 刘 璞 , 翁佩芳 , 等.榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进展[ J] .食品与发酵工业 , 2005 , 31(8):73-76.
WU Zu-fa ng , LIU Pu , WENG Pei-fa ng , et al.Key technologies and development o f lactic acid bacteria application in
pickled mustard tube r processing[ J] .Food and Fermentation Industry , 2005 , 31(8):73-76.(in Chinese)
[ 3] 吴祖芳 , 刘 璞 ,翁佩芳.传统榨菜腌制加工应用乳酸菌技术的研究[ J] .食品工业科技 , 2008 , 2:101-103.
WU Zu-fang , L IU Pu , WENG Pei-fang.Study on applica tion of lactic acid bacte ria techno log y to the pr ocessing of tradi-
tio nal picked mustard tuber[ J] .Sci Tech Food Industry , 2008 ,(2):101-103.(in Chinese)
[ 4] 施安辉 , 周波.蔬菜传统腌制发酵工艺过程中微生物生态学的意义[ J] .中国调味品 , 2002 , 5:11-15.
SH I An-hui , ZHOU Bo.The micro-eco log ical significance of the traditional g reenstuff pickling pr ocess[ J] .Chinese Condi-
ment , 2002 , 5:11-15.(in Chinese)
[ 5] 刘 玲 , 吴祖芳 , 翁佩芳 , 等.乳酸菌低盐腌制榨菜脆性与果胶含量的关系研究[ J] .中国食品学报 , 2009 , 9(4):137-
142.
LIU L ing , WU Zu-fang , WENG Pei-fang , e t al.Study on the Re lation between pectin content and brittlene ss of low salt
pickled mustard tuber by lactic acid bacte ria[ J] .Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology , 2009 , 9(4):
137-142.(in Chinese)
[ 6] 燕平梅 , 柴 政 ,薛文通 , 等.培养和非培养方法分析发酵白菜卤乳酸菌的多样性[ J] .微生物学报 , 2009 , 49(3):383-388.
YE Ping-mei , CHAI Zheng , XUE Wen-to ng , et al.Lactic acid bacteria dive rsity in fermented cabbage estima ted by cul-
ture-dependent and-independent methods[ J] .Acta Microbiological Sinica , 2009 , 49(3):383-388.(in Chinese)
[ 7] 吴 蕊 , 田洪涛 , 孙纪录 , 等.泡菜中乳酸菌优良菌株的分离鉴定及发酵性能的研究[ J] .食品研究与开发 , 2009 , 30(2):
51-54.
WU Rui , T IAN Hong-tao , S UN Ji-lu , et al.Isolation , Identifica tion and fermentation charac ter istics study o f lactic acid
bacte ria f rom pickling vege table[ J] .Food Research and Development , 2009 , 30(2):51-54.(in Chinese)
[ 8] 杭晓敏 , 范小兵 ,张和春 , 等.DNA 指纹图谱在乳酸菌分类鉴定中的应用[ J] .中国微生态学杂志 , 2005 , 17(5):327-
328.
HANG Xiao-ming , FAN Xiao-bin , ZHANG He-chun , et al.The application of DNA fingerprinting in the identification of
Lactic acid bacteria[ J] .Chinese Journal of Micrecology , 2005 , 17(5):327-328.(in Chinese)
[ 9] 李海星 , 曹郁生.用于乳酸菌鉴定的几种分子生物学方法[ J] .江西科学 , 2004 , 22(5):393-396.
LI H ai-xing , CAO Yu-sheng.Molecular bio lo gical me thods for identification of lac tic acid bacteria[ J] .JiangXi Science,
2004 , 22(5):393-396.(in Chinese)
[ 10] 赵文静 ,李 妍 ,高鹏飞 , 等.实时荧光定量 PCR技术在乳酸菌定量检测中的应用[ J] .食品与生物技术学报 , 2009 , 28(4):
433-437.
ZHAO Wen-jin , L I Ye , GAO Peng-fei , et al.Application of real-time fluorescent quantitative PCR in quantitative detec-
tio n o f lactic acid bacteria[ J] .Journal of Food Science and Biotechnology , 2009 , 28(4):433-437.(in Chine se)
[ 11] Schw ieger F and Tebbe C C.A new approach to utilize PC R sing le strand conforma tion po lymorphism for 16S rRNA
gene-based microbial community analysis[ J] .Applied and Environmental Microbiology , 1998 , 64(12):4870-4876.
[ 12] H ayashi K.Recent enhancements in SSCP[ J] .Biomolecular Engineering , 1999 , 14:193-196.
[ 13] 周铭涛 ,高 洪 ,肖 鹏 , 等.PC R-SSCP技术应用研究进展[ J] .动物医学进展 , 2009 , 06:90-93.
ZHOU Ming- tao , GAO Hong , XIAO Pen , et a l.Advance in PCR-SSCP and its application[ J] .Progress in Veterinary
Medicine , 2009 , 14:193-196.(in Chinese)
[ 14] 鲍立新 ,李建政 ,赵 焱 , 等.厌氧活性污泥微生物群落的 SSCP 分析条件优化[ J] .科技导报 , 2008 , 02:28-31.
BAO Li-xin , L I Jian-zhen , ZH AO Yan , et al.Optimization of single-strand confo rma tion polymo rphism techno lo gy fo r
analy zing micr obial community of anae robic ac tivated sludge[ J] .Science &Technology Review , 2008 , 02:28-31.(in Chi-
nese)
[ 15] 赵阳国, 任南琪 ,王爱杰 ,等.SSCP技术解析硫酸盐还原反应器中微生物群落结构[ J] .环境科学, 2005 , 26(4):171-176.
ZHAO Liang-guo , REN Nan-qi , WANG Ai-jie , et al.Mic robial community str ucture analyzed by single-strand conforma-
tio n polymo rphism technique in sulfate-reducing reacto r[ J] .Chinese Journal of Environmental Science, 2005 , 26(4):171
-176.(in Chinese)
[ 16] 刘小琳, 刘文君.生物陶粒与生物活性炭上微生物群落结构的 PCR-SSCP技术解析[ J] .环境科学 , 2007 , 28(4):924-928.
LIU Xiao-ling , LIU Wen-jun.Microbial community structure in bio-ceramics and bio log ical activ ated ca rbon ana lyzed by
PC R-SSCP technique[ J] .Environmental Science, 2007 , 28(4):924-928.(in Chinese)
[ 17] 王爱杰 ,阚洪晶 ,于振国 , 等.SSCP技术分析活性污泥微生物群落结构的条件优化及检验[ J] .微生物学通报 , 2008 , 07:
1164-1169.
WANG Ai-jie , KAN Hong-jing , YU Zhen-guo , et a l.Optimal conditions and valida tion o f sing le-strand confo rmation po l-
ymo rphism technology fo r the ana ly sis of microbia l communitie s in activ ated sludge[ J] .Microbiology , 2008 , 07;1164-
1169.(in Chinese)
266 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 30卷