全 文 ：收稿日期:2007-12-20
基金项目:华南热带农业大学科技基金资助(Rnd0710)
作者简介:陈萍(1977-),女,硕士,在职博士生,讲师
神秘果为山榄科(Sapotaceae)神秘属(Synsepalum)
常绿灌木,是一种稀有的种质资源,原产于西非,自然
分布在西非至刚果一带,在印度尼西亚的丛林中也有
发现,自20世纪60年代起先后引入我国海南、广东、
广西、福建等省区种植。由于神秘果果肉中含有的神秘
果素为一种糖蛋白,能改变人的味觉,因此用其可制成
酸性食品的助食剂,或制成可满足糖尿病患者需要甜
味的变味剂。神秘果果肉中同时还含有丰富的维生素
C、钾、碘、柠檬酸、琥珀酸、草酸等物质,种子中含有天
然固醇及钠、钾、钙、镁等矿物元素。此外,神秘果还是
一种有趣的观赏植物[1]。目前,国内外对神秘果还未进
行深入的分子学生物研究。为此,我们开展了不同
DNA提取方法比较试验,以期寻求适合于提取神秘果
DNA的有效方法,为神秘果种质资源的分子鉴定评价
工作提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
神秘果的新鲜叶片采自原华南热带农业大学园艺
学院果园内。试验用的主要生化试剂有巯基乙醇、氯
仿、异戊醇、无水乙醇、PVP-40、乙酸铵等,均为国产分
析纯及分析纯以上纯度;主要仪器设备有H-8数显恒
温 水 浴 锅 、UV-1601PC紫 外 可 见 分 光 光 度 计 、
UNIVERSAL-32R高速冷冻离心机 (德国产品)、
GAS7401X胶凝成像系统(英国UVI公司产品)。
试验用的 2×CTAB提取缓冲液组成:100mmol/L
Tris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA,1.4mmol/LNaCl,
2%CTAB,5%PVP,β-巯基乙醇 [2];1×CTAB提取缓冲
液组成:50mmol/LTris-HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA,1%
CTAB,20mmol/L,β-巯基乙醇;SDS提取液组成:50
mmol/LTris-HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0),140
mmol/LNaCl,5%SDS,5%PVP[3-4],5%的β-巯基乙醇;
TE缓冲液为:10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/L
EDTA(pH8.0)。配好的提取液和缓冲液经高压灭菌后
备用。
1.2试验方法
试验共设6种不同DNA提取方法处理,各种方法
的提取步骤如下:
神秘果基因组DNA提取方法比较研究
陈 萍,杨通顺,王 欢
(海南大学园艺园林学院,海南 儋州 571737)
摘 要:在CTAB法及SDS法的基础上设计了6种提取方法,比较了不同方法对神秘果幼嫩叶片DNA的提取效果。结
果表明:改进的 SDS法,通过提高提取缓冲液中重要成分的含量,与二次纯化的方法相结合,提取的 DNA无明显降解、杂
质少,OD260/OD280值为1.62,接近标准值,是有效提取神秘果基因组DNA的方法。
关键词:神秘果;DNA;提取方法
中图分类号:S667.9 文献标识码:B 文章编号:1004-874X(2008)03-0026-03
StudyonextractionmethodsofmysteriousfruitgenomicDNA
CHENPing,YANGTong-shun,WANGHuan
(ColegeofHorticultureandLandscapeArchitecture,HainanUniversity,Danzhou571737,China)
Abstract:GenomicDNAofleavesofmysteriousfruitwasextractedbymeansofsixdiferentmethodsofCTAB,SDSandal
kindsofimprovedmethods,TheextractionDNAofthesemethodshasbeencompared.Theresultshowedthat:theSDSimprove
method,increasedtheimportantcontentofextractionbuferandusedmethodoftwopurificationitwasanefectivewaytosolve
alkindsofproblem,degradationwaslitle.impuritywaslitle.ThatwasthebestmethodsincetheDNAextractedbyithadthe
bestOD260/OD280ratio,itwas1.62orso。
Keywords:mysteriousfruit;DNA;extractionmethod
广东农业科学 2008年第3期26
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2008.03.034
方法1:参照段中岗等[5]的CTAB改良法并作适当
改动,即于装有 0.2g鲜叶的离心管中加入 2×CTAB
500μL、β-巯基乙醇5μL,轻轻颠倒混匀,然后置于
65℃水浴中30min;加入等体积的氯仿-异戊醇 (24∶
1),轻轻颠倒混匀,室温下静置 30min;4℃、12000
r/min下离心10min,取上清液,加入等体积的异丙醇,
轻轻颠倒混匀,-20℃下放置1h;4℃,12000r/min下
离心 5min,弃去上清液,并用 70%乙醇清洗沉淀,室
温下晾干后加入 TE缓冲液 150μL,37℃下放置 30
min;加入2倍体积的无水乙醇和 1/10体积的 3mol/L
NaAc(pH5.2),-20℃下放置2h;4℃,10000r/min下
离心 10min,取出沉淀,晾干,加入 TE缓冲液 30μL,
置于4℃下保存备用。
方法2:提取DNA时,加入提取缓冲液后,除再加
入PVP(用量为 1%～2%)去除色素和加入 10%SDS120
μL使蛋白质充分变性外,其他操作步骤与方法 1相
同。
方法3:提取DNA时,加入提取缓冲液后,除再加
入PVP(用量为1%～2%)去除色素外,其他操作步骤与
方法1相同。
方法 4:参照牛建新等[4]的方法稍作改动,即于装
有备用材料的离心管中加入经 65℃预热的 SDS提取
缓冲液 500μL和 β-巯基乙醇 6μL,轻轻摇匀,于
65℃水浴下放置 15min;加入等体积的氯仿-异戊醇
(24︰1),轻轻摇匀;4℃,12000r/min下离心10min;
取上清液,重复前 2个步骤 1次;取上清液,加入 0.7
倍体积-20℃预冷的异丙醇,轻轻摇匀,于-20℃下静置
15min;4℃、8000r/min下离心5min;弃去上清液,用
70%乙醇清洗沉淀,室温下晾干后加入 TE缓冲液30
μL,于4℃保存备用。
方法5:提取DNA时,在第1次水浴后,加入1/10
体积冰冻的5mol/LKAC,混匀,置于冰块上 30min。
并在方法4的基础上增加再提纯步骤(即用氯仿-异戊
醇抽提后,加入 2倍体积的无水乙醇和 1/10体积 3
mol/LNaAc(pH5.2)沉淀 DNA,其他步骤与方法 4相
同。
方法6:提取DNA时,在第1次水浴后,省略加入
了 1/10体积冰冻的 5mol/LKAC及混匀后置于冰块
上30min的步骤,而其他步骤与方法5相同。
各种提取方法的DNA样本制备结束后,吸取样本
溶液 10μL,移入 3mL蒸馏水中,然后转入分光光度
计的石英比色杯中,于紫外分光光度计260nm和280
nm处测量紫外吸收值(OD值),根据测定结果计算神
秘果鲜叶中的DNA含量,同时根据OD260/OD280值判断
DNA的纯度,计算公式为:DNA(ng/μL)=50×OD260×
301。此外,对各处理 DNA样本采用 0.8%琼脂电泳凝
胶(内加核酸染料),70V恒压电泳 2h,在凝胶成像系
统上观察电泳结果并拍照。
2结果与分析
2.1不同提取方法的DNA纯度比较
OD260/OD280值一般用以衡量 DNA纯度,其比值为
1.8～1.9时表明DNA纯度最好。将6种方法提取的神
秘果 DNA置于全自动紫外分光光度计 260nm、280
nm波长处进行检测,各DNA样品的 OD值检测结果
表 1。从表 1可见,方法 5的 OD260/OD280值为 1.62,比
较接近标准值,说明该方法提取出的DNA纯度最高。
试验结果表明,在提取神秘果 DNA的过程中,加入
SDS缓冲萃取后,采取先用无水乙醇与 NaAc沉淀,再
用高浓度的 KAC在低温的情况下能较好地除去蛋白
质及多糖等物质,从而最终提高DNA的纯度。
2.2DNA电泳成相结果
从6种提取方法的神秘果 DNA电泳结果 (图 1)
可见,方法1和方法3的OD260/OD280值偏低,且浓度偏
低,且条带较弱,说明用这两种方法提取的 DNA产率
表1不同提取方法的神秘果DNA含量测定结果
提取方法
1
2
3
4
5
6
OD260
0.015
0.023
0.015
0.097
0.021
0.081
OD280
0.014
0.015
0.024
0.079
0.013
0.062
OD260/OD280
1.07
1.53
1.17
1.23
1.62
1.31
含量(ng/μL)
225.75
346.15
225.75
1459.85
316.05
1219.05
图1不同提取方法的神秘果 DNA琼脂凝胶电泳结果
1,2和 3,4和 5,6和 7,8和 9,10分别为方法 1、
2、3、4、5、6提取 DNA的电泳结果
27
及纯度均很低,方法2的OD260/OD280比值虽较高,但条
带弱,可能存在DNA降解的现象。方法 4提取的DNA
虽然条带特别亮,但在DNA溶液中可见透明胶状物,
可能与其存有大量的蛋白质及多糖等物质有关;方法
5提取的 DNA条带较明亮,无明显拖尾现象,OD260/
OD280值较高,较接近于 1.8,条带也较亮。方法 6的条
带较模糊,提取效果较差。可见,方法 5是提取神秘果
DNA的有效方法。
3结论与讨论
本试验采用的6种方法都可以提取出神秘果基因
组DNA,但各种提取方法的 DNA产量和纯度存在较
大差别。经分光光度计和电泳分析检测表明,方法5能
较好地除去多糖、多酚及蛋白质杂质,提取的 DNA纯
度较高,效果较为理想,可作为开展神秘果分子生物学
研中提取DNA究的首选方法。
提取植物DNA的方法虽然很多,提取过程中的许
多操作对获得高质量的基因组 DNA均有非常重要的
影响[6-7],但每种方法最关键的 3个步骤是:(1)样品要
充分研磨,破碎细胞壁和细胞膜使DNA释放到提取缓
冲液中,研磨充分的样品可以保证样品与提取缓冲液
充分混匀,增大样品与提取缓冲液的接触面积,使
DNA更加充分释放,从而得到理想的DNA得率。(2)
消除蛋白质、多糖、色素等杂质的污染,其直接关系到
提取的质量,用氯仿/异戊醇抽提时动作要轻柔,以避
免DNA受到外界机械力的剪切而断裂成小片段;吸取
离心的上清液时要使用剪去尖端的吸头且注意不能吸
入中间的蛋白层,否则会严重影响 DNA的纯度。(3)
DNA洗涤要充分,洗涤是为了去除DNA中的小分子
杂质以保证其纯度,洗涤后的DNA样品要充分干燥以
去除残留的乙醇,防止其抑制后续的酶切及 PCR反
应,但必须注意不能过度干燥,否则DNA会很难溶解。
参考文献:
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52.
[2] 栾雨时.生物工程实验技术指南[M].北京:化学工业出版社,
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社,2005:156-159.
[7] 张宁,王凤山.DNA提取方法进展[J].中国海洋药物杂志,2004
(2):40-45.
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目前推广应用的两个“新农科”水稻缓/控释肥产品,其氮
磷钾含量分别为:(1)氮 23磷 7钾 20,总养分含量 50%,可用于
各种类型土壤;(2)氮 24磷 4钾 12,总养分含量 40%,适用于磷
钾含量较高土壤或习惯稻秆回田耕作地区。
1推荐施肥量
根据多年试验示范结果,水稻缓/控释肥推荐施用量为:(1)
目标产量(667m2)≤450kg的常规优质稻,施肥量(667m2用
量)为 35~45kg;(2)目标产量 450~600kg的常规高产稻、杂交
稻,施肥量为 45~55kg;(3)目标产量≥600kg的超高产水稻,
施肥量为 55~65kg。各地使用时可根据目标产量、品种特性、土
壤肥力状况等具体情况进行调整。
2一次性施用
根据各地试验示范结果,该产品按推荐量作基肥一次施用
后不再追肥,可以满足水稻整个生育期的营养需求。但是,在天
气变化影响较大时(如施肥后短期内遇大暴雨,早春持续低温阴
雨天气等)可以采用“大方向,小调整”方针,应适当补充追肥每
667m2稻田补充追施尿素 3~5kg。
3施肥操作
肥料于移栽前、犁翻耙田后撒施,施肥后要求再耙 1~2次,
以达到全层施肥目的,更充分发挥该产品的长效控释效果。
4砂质田施用
砂质田、浅脚田的保肥保水能力较差,建议分次施用,一般
可以60%作基肥施用,其余肥料在移栽后 20~30d施用。
5注意事项
(1)由于缓/控释肥一造水稻只施用 1次肥,因此作“耙尾
肥”施用时要多次、反复、均匀撒施,防止“缺空”而出现水稻植
株群体生长不平衡问题。施肥前必须调节好田间水,施肥后 3d
内避免排水,早稻移栽初期如遇低温天气,建议增加灌水量。(2)
对于每 667m2产量超过 500kg的品种,建议将该产品分 2次
施用,即70%~80%的肥料作基肥,其余在移栽后 30~40d施用。
(3)在推荐用量下,施用“新农科”水稻本缓/控释肥的水稻中期
叶色偏淡,属正常现象,不必追肥。
(510640 广东省农科院土壤肥料研究所)
“新农科”水稻缓/控释肥施用技术
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