全 文 ：第31卷 第5期 浙 江 林 业 科 技 Vol. 31 No.5
2 0 1 1年 9月 JOUR. OF ZHEJIANG FOR. SCI. & TECH. Sep., 2 0 1 1

文章编号：1001-3776（2011）05-0057-04

浙江光叶柿优株 SSR 指纹图谱鉴定分析

胡美君 1，应尚蛟 1*，程诗明 2，应光明 1，陈军晓 1
（1. 浙江省永康市林业局，浙江 永康 321300；2. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

摘要：运用 SSR 分子标记技术，对选育的 14 个浙江光叶柿优株进行分子鉴定，确定各自的指纹图谱；采用非加
权平均数聚类分析（UPGMA），以相似系数 0.45进行划分，可以将 14个优株归为 3大类群：10、14、15、19、
25、26、31、32、33、35 号优株归为一类；22、34、36 号优株归为一类；18 号优株单独为一类。只需用 DP4、
DP7两对引物就能将 14个优株鉴定开来。
关键词：浙江光叶柿；指纹图谱；相似系数
中图分类号：S665.2 文献标识码：A

Identification of Diospyros zhejiangensis Plus Trees
by SSR Marker Fingerprinting

HU Mei-jun1，YING Shang-jiao1，CHENG Shi-ming2，YING Guang-ming1，CHEN Jun-xiao1
（1. Yongkang Forestry Bureau of Zhejiang, Yongkang 321300, China; 2. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China）

Abstract: SSR marker fingerprinting was used for indentification of 14 plus trees of Diospyros zhejiangensis in Yongkang, Zhejiang province. The
results showed that the tested D. zhejiangensis could be completely distinguished on genome by SSR markers. The 14 plus trees of D. zhejiangensis
could be divided into three groups at a coefficient of similarity of 0.45 by UPGMA, the one group of number 10, 14, 15, 19, 25, 26, 31, 32, 33, 35, the
second group of number 22, 34, 36 and third group of number 18. Two primers pairs of DP4, DP7 were sufficient to identify 14 plus trees.
Key words: Diospyros zhejiangensis; fingerprintings; coefficient of similarity

浙江光叶柿（Diospyros zhejiangensis）是柿属的一个新种，又称为柿枣，分布于浙江永康、丽水等地。具
有较强的适应性，对土壤要求不严格，树体强壮，树高 7 ~ 10 m，幼树生长旺盛，经济寿命长，可达 100 a以上。
产量高，效益好，一般嫁接苗定植后 3 a就可挂果，管理得当第 4年可达 2 250 kg/hm2，盛产期鲜果平均产量可
达 12 000 kg/hm2。管理比一般柿粗放，病虫害较少，是天然的绿色食品。由于浙江光叶柿未经人工选育，品种
良莠不齐，产量波动幅度较大，加上生产农户未掌握相关栽培技术，整体效益不是十分理想。因此，如何在浙
江光叶柿自然分布区挖掘选育出高产优质品种并加以推广示范成为当务之急[1]。本文在实地调查优株选择基础
上，对各优株进行指纹图谱分析。
1 材料和方法
1.1 材料
本实验的材料来源于浙江省永康市浙江光叶柿全分布区，共 14个样品，见表 1。每个样品分别提取 DNA，
收稿日期：2011-04-18；修回日期：2011-07-05
基金项目：浙江省科技计划项目“柿子良种选育与软腐病防治及产品加工技术研究与示范”（2009C32067）
作者简介：胡美君（1981－），女，浙江常山人，工程师，从事林业技术推广工作；*通讯作者。

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用于 SSR分析。
1.2 DNA 的提取和纯化
由于柿树叶片中含有大量的多糖和酚类等物质，所以 DNA 的
提取采用改良的 SDS-CTAB法，纯化采用MagaZorb试剂盒。
1.3 SSR 引物合成
参考郭大龙等[2]设计，由上海生工生物技术公司合成。
1.4 PCR 扩增体系优化设计
1.4.1 PCR反应体系优化设计 PCR反应参照 Martins 的方法：总
体积 20 µL，10×buffer，20 mM MgSO4，100 mM KCl，80 mM
(NH4)2SO4，100 mM Tris-HCl，0.5%NP-40，Ph（9.0）2 µL，DNA
模板 20 ng，引物浓度 0.2 µM，dNTP 200 µM，TaqDNA聚合酶为 1
U，Mg2+2.0 mM。以此试验方法为基础，设计 PCR反应优化条件[3]。
本试验分别设定了 5个 DNA模板梯度（10、20、40、60、80 ng），Mg2+浓度（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mM），
dNTP浓度（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mM），Taq酶（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0）U，Primer浓度（0.1、0.15、
2.0、2.5、3.0 mM），建立反应最优化体系。反应热循环程序参照Martins的方法。
琼脂糖凝胶电泳：PCR产物（上样 5 µL，加入 3 µL Loading buffer）用 1.5%琼脂糖凝胶电泳（EB染色），
电泳液 1×TAE，电压 70V/cm，电泳 15 min，待电泳过程稳定后，调电压至 100V/cm，电泳 45 min，用自动凝
胶成像系统（BIO-RAD）观察拍照。
1.4.2 PCR 电泳结果的记录 通过一系列 SSR 基本程序的操作后，即得到 SSR 谱带，对谱带进行分析。为了
便于对 SSR电泳结果进行分析，需将 SSR 标记的结果（即谱带）转换成数字形式。对于 SSR 标记，只记录具
有多态的谱带，对于扩增条带的有或无，一般认为强反应带和重复出现的弱带应记为“1”，而不重复出现的弱
带和没有条带的记为“0”，模糊不清或无扩增产物即缺失时记录为“－”，按此方法记录即可得到 SSR 反应
的原始数据。
1.4.3 数据统计方法 在相同片段位置上有带记为 1，无带记为 0。作 0/1矩阵输入 POPGENE1.32软件进行分
析，同时对基因谱带频率进行 AMOVA方差分析。计算个体间的 Nei相似系数，NTSYSpc2.10进行 UPGMA聚
类分析。
2 结果与分析
2.1 SSR 扩增产物多态性
用合成的 SSR引物分别对 14个样品进行 SSR扩增，获得了清晰的扩增条带，而且多态性丰富（见图 1），











表 1 永康浙江光叶柿实验优株情况
Table 1 Information of tested D. zhejiangensis
样品编号 试材名称（优株号） 采集地点
1 10 凌宅村
2 14 凌宅村
3 15 凌宅村
4 18 上溪里村
5 19 上溪里村
6 22 西岸村
7 25 西岸村
8 26 西岸村
9 31 上丁村
10 32 上丁村
11 33 上丁村
12 34 下丁村
13 35 新楼村
14 36 新楼村
表 2 7 对 SSR 引物扩增结果
Table 2 Amplification results of 7 SSR primer pairs
引物 扩增总带数 多态性带数 多态性位点百分率/%
DP1 98 64 65
DP2 98 60 61
DP3 98 64 65
DP4 112 70 63
DP5 112 77 69
DP6 140 71 51
DP7 168 87 52
total 826 493 60.86 图 1 DP1 引物对 14 个优株 SSR 电泳谱带
Figure 1 DNA fragments of 14 samples amplified by
SSR primer DP1

5期 胡美君，等：浙江光叶柿优株 SSR指纹图谱鉴定分析 59

7对引物共检测得到了 826个位点，其中 493个为多态性位点。扩增产物条带大小主要集中于 200 ~ 1 000 bp。
其中，以引物 DP7扩增出条带最多，共检测
到 168个位点，多态性比率 52%，DP5检测
到 77个多态位点，多态位点百分率达 69%，
见表 2。
2.2 14 个优株 UPGMA 聚类分析
采用 NTSYS 软件进行 UPGMA 聚类得
到 14 个浙江光叶柿优良单株遗传距离聚类
图。由图 2可以看出，以相似系数 0.45进行
划分，可以将 14个小柿优株归为 3大类群：
10、14、15、19、25、26、31、32、33、35
归为一类；22、34、36归为一类；18单独为
一类。
2.3 SSR 检测中 7 对引物鉴定效率

表 3 7 对 SSR 引物对浙江光叶柿鉴定结果
Table 3 Identification results of 7 SSR primer pairs
引物优株号 DP1 DP2 DP3 DP4 DP5 DP6 DP7
10 + + +
14 + + +
15 + + +
18 + + + +
19 + +
22 + + + +
25 + +
26 + + + + +
31 + + +
32 + + +
33 + +
34 + + + + + +
35 + + +
36 + + +
鉴别数 4 5 5 11 6 4 11
未鉴别数 11 9 9 3 8 10 3
鉴别效率/% 28.57 35.71 35.71 78.57 42.86 28.57 78.57
以“＋”表示该引物能够鉴定该优株。从表 3可以看出，不同引物鉴定效率不同，其中 DP4、DP7分别能
将 14个优株鉴定出 11 个，鉴别效率达 78.57%，并且只用这两对引物就能将所有的 14 个优株鉴定出来，而不
需要其他的引物组合。
3 讨论
据国家果树种质资源眉县柿圃提供的资料，我国柿树现有栽培品种 396 个（含同物异名）。倪云鹏[4]在我
国柿树主要栽培品种介绍中仅介绍了浙江铜盆柿，包括扁花柿和方柿，根据种质调查就是分布于杭州的扁花柿
和分布于永康的方山柿，对浙江省其他柿品种、类型未见系统的研究报道。浙江省林业科学研究院系统研究了
浙江省千岛无核柿、兰溪大红柿、天台朱红柿、永康方山柿、玉环长柿、永嘉东皋柿等优良品种，调查了浙江
省柿树分布、优株的生长和结实性状，共采集叶、果实样品 33份，研究了浙江省柿树的表型多样性及 DNA水
平分子标记研究；运用表型和分子两种手段对浙江省柿树种质资源进行鉴定。这是国内外首次对浙江省柿优良
种质资源的调查、遗传多样分析、种质鉴定及优良单株选择[4~5]。然而对浙江光叶柿研究始终是个空白。
形态学鉴定具有直观、具体、简单易行的特点，且试验成本较低，当具备某些具体特异识别性状时，可靠
Coefficient
0.02 0.14 0.26 0.38 0.51
0
4
2
9
6
2
4
6

图 2 14 个优株 UPGMA 聚类分析
Figure 2 UPGMA cluster analysis on 14 plus trees
10
0.14
Coeficient
0.26 0.38 0.51
Coeficient
14
25
35
31
15
32
33
19
26
18
22
34
36
0.02

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性高，鉴定较容易[6]。DNA分子标记具有数量多、多态性高、遗传稳定，不受栽培条件、环境变化、组织器官、
发育阶段影响等特点，具有更高的稳定性和可靠性，且实验材料用量少，快速简便。
改良的 SDS-CTAB提取浙江光叶柿叶片总 DNA，并采用 MagaZorb 试剂盒纯化所得的基因组 DNA，能满
足分子标记的 SSR-PCR分析。由于柿树叶片中含有大量多糖、酚类物质和色素，导致提取 DNA比较困难，用
改良的 SDS-CTAB提取后，再用MagaZorb试剂盒纯化不仅速度快，耗时少，成本也比较低，而且所得的 DNA
纯度高，浓度一致。对于分子标记的 PCR分析，是一种理想的方法。
从 UPGMA聚类分析图中可以看出，各优良单株亲缘关系的远近[7]。以相似系数 0.45进行划分，可以将 14
个优株归为 3大类群，其中：10、14、15、19、25、26、31、32、33、35号优株归为一类；22、34、36号优株
归为一类；18号优株单独为一类。其中 18号个体在供试的 14个优良单株中发现存在特异谱带片段，该基因组
究竟起到什么功能作用，有待以后进一步深入研究。

参考文献：
[1] 杨勇，阮小凤，王仁梓，等. 柿种质资源及育种研究进展[J]. 西北林学院学报，2005（20）：133－137.
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[6] 杨勇，王仁梓. 柿属植物及柿品种染色体数目研究[J]. 西北农业学报，1999，3（3）：64－67.
[7] 张立平，林伯年，沈德绪. 葡萄属 RAPD分类研究[J]. 园艺学报，1998，25（2）：191－193.