全 文 ：正交试验优化虎舌红茎尖离体培养条件
杜敏华 ,张乃群 ,田 龙 ,高宛莉　(南阳师范学院生命科学与技术学院 ,河南南阳 473061)
摘要　采用正交设计及方差分析对影响虎舌红植株离体培养的因素进行优化研究 ,结果表明:最佳愈伤组织诱导培养基为MS+2 , 4-D
0.7 mg/L+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖 28 g/L+琼脂 6.0g/L;不定芽诱导最佳培养基为MS+NAA0.2mg/ L+CPPU0.4mg/L+AgNO3 4.0mg/L+
蔗糖 30g/L+琼脂 6.0g/L ,分化率为 96%,增殖率为 5.5;最佳生根培养基为 1/2MS+NAA 0.4 mg/L+IBA 0.3 mg/L+蔗糖 26 g/L+琼脂
5.0 g/L,生根率为 93%。
关键词　虎舌红;茎尖;正交试验;离体培养;方差分析
中图分类号　Q943.1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2006)19-4865-02
Application of the Orthogonal Design in theOptimization of Culture Condition in Vitro of Artesian mamillata hance
DU Min-hua et al　(College of Biology Science and Technology , Nanyang Normal University , Nanyang, Henan 473061)
Abstract　Orthogonal design and variance analysis were used in the protocol of Artesian mamillata hance.The results showed the best induction medium
was MS+2 , 4-D 0.7 mg/ L+6-BA 0.2 mg+sucrose 28 g/L+agar 6.0 g /L.For adventition buds , the medium was MS +NAA 0.2mg/ L+CPPU0.4
mg/L+AgNO34.0 mg/L+sucrose 30 g/ L+agar 7.0 g/L and differentiation rate was 96% and themultiplication ratewas 5.5.As for the induction of
rooting the only medium was 1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.3 mg/L+sucrose 26 g/L+agar 5.0 g/ L and the rooting rate was 93%.
Key words　 Artesian mamillata hance;Orthogonal design experiment;Culture in vitro;Analysis of variance
　　虎舌红(Artesian mamillata hance)是紫金牛科紫金牛属的
多年生常绿矮小灌木 ,是一种以观赏和药用价值为主 ,具有
多种经济用途的重要植物资源[ 1] 。虎舌红的常规繁殖同许
多植物一样有种子繁殖和扦插繁殖 2种。种子繁殖的实生
苗形状不稳定 ,易变异 ,优良单株不易保存和扩繁。扦插繁
殖往往消耗较多母体材料 ,成活率低 ,繁殖系数低 ,速度
慢[ 2] 。所以常规繁殖无法满足目前虎舌红市场的需要。
目前 ,有关虎舌红组织培养研究报道很少 ,江香梅等采
用虎舌红成年植株的茎段培养成完整的虎舌红植株[ 3] ;卢其
能利用虎舌红的茎段 、芽 、花和叶进行组织培养 ,仅见有芽分
化的最佳培养基为 1/2MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.01 mg/L的
结论报道 ,并未提到是否培养成完整的虎舌红植株[ 4] 。詹选
怀等利用虎舌红的带节茎段 、叶和叶柄也进行了成功的尝
试[ 4] ,但尚未见以虎舌红茎尖为外植体的报道。该试验采用
正交试验法 ,以虎舌红茎尖为试验材料 ,对影响虎舌红愈伤
组织形成和出芽的培养基和培养条件进行了较为系统的研
究 ,从中分析了影响虎舌红茎尖离体再生的主导因素 ,优化
了培养基配方和培养条件 ,达到了快速繁殖的目的 。
1　材料与方法
1.1　取材及培养条件　材料及来源:虎舌红由广西省植物
研究所提供 。
愈伤组织的诱导:取虎舌红茎尖 ,以流水冲洗 30min ,用
75%酒精灭菌 35 s ,0.1%HgCl2 消毒 5 ～ 8min ,取出后用无菌
水冲洗 4～ 6次 ,得无菌材料 ,以MS+6-BA+2 ,4-D+蔗糖 28
g/L+琼脂 6.0 g/L为基本培养基 ,暗处理 15 d后 ,每日光照。
不定芽诱导:取虎舌红无菌芽 ,以 MS+NAA+CPPU+
AgNO3+蔗糖 30 g/L+琼脂 6.0g/L为基本培养基。
生根培养:取虎舌红不定芽 ,以 1/2MS+IBA+NAA+蔗
糖 26g/L+琼脂 5.0 g/L为基本培养基。
　　培养条件:置MGC-350HPX型智能人工气侯箱中 ,光强
基金项目　河南省重大科技攻关项目(0524050006)。
作者简介　杜敏华(1964-),男 ,河南南阳人 ,硕士,副教授 ,从事植物组
织培养研究。
收稿日期　2006-06-29
1500～ 2000 lx ,每日光照 15h ,培养温度(26±2)℃。
1.2　正交试验设计
1.2.1　不定芽诱导及增殖培养 。选择NAA 、CPPU和 AgNO3
等处理因子 ,每个因子取 3个水平 ,选用L9(34)正交表 ,考察
对虎舌红不定芽诱导的影响[ 5, 6]因子水平安排见表 1 。
　　表1 L9(34)正交试验设计
水平 处理
A(NAA)∥mg/ L B(CPPU)∥mg/ L C(AgNO3)∥mg/ L D(CK)
1 0.1 0.4 3.5 1
2 0.2 0.6 4.0 2
3 0.3 0.8 4.5 3
1.2.2　生根培养。根据文献报道[ 7 ,8]及预试验 ,选择NAA 、IBA
和活性碳等处理因子 ,每个因子取 3个水平 ,选用 L9(34)正交
表 ,考察对虎舌红生根的影响[ 9 ,10] 。因子水平安排见表 2。
　　表 2 L9(34)正交试验设计
水平 处理
A(NAA)mg/ L B(IBA)mg/ L C(Socrose)mg/ L D(CK)
1 0.2 0.1 1.0 1
2 0.4 0.3 3.0 2
3 0.6 0.5 5.0 3
2　结果与分析
2.1　不同激素对虎舌红茎尖愈伤组织诱导的影响　在虎
舌红脱分化过程中 ,生长素 2 , 4-D 、NAA起着十分重要的作
用 ,但它们对愈伤组织诱导 、生长和分化的影响却不相同。
在附加 2 ,4-D的培养基中 ,愈伤组织数量多 ,生长快;而附
加NAA的培养基 ,愈伤组织数量明显减少 ,前者可为后者 3
～ 4倍 ,甚至更多 ,而且愈伤组织不能分化出再生植株。在
NAA诱导作用下 ,虎舌红茎尖脱分化后 ,只长出少量愈伤组
织 ,便迅速分化出大量不定芽及再生植株。说明 2 , 4-D在
试验的浓度范围内促进虎舌红茎尖脱分化及愈伤组织生
长 ,抑制愈伤组织分化 ,而 NAA 在试验的浓度范围内则促
进愈伤组织分化。
由于虎舌红茎尖对外援激素的反应不同 ,在实际应用
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2006, 34(19):4865-4866, 4868　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　庆 　责任校对　庆
时 ,应根据需要不同 ,选择不同的外源激素 ,若以诱导愈伤
组织为目的 ,生长素 2 , 4-D适宜浓度为 0.7mg/L;6-BA适宜
浓度为 0.2 mg/L。若以获得再生植株为目的 ,则生长素
NAA适宜浓度为 0.1 mg/L;6-BA适宜浓度为 0.8mg/L。
2.2　不定芽诱导及培养系统的建立　在无菌芽接种 6 d
后 ,开始有新芽出现 ,随后大多数培养基中的丛生芽不断增
加 ,并且丛生芽的生长都十分健壮 ,接种 4周后统计分化率
的结果见表 3。
　　表3 虎舌红不定芽诱导试验结果 L9(34)
处理
A B C D
接种数
个
分化数
个
分化率
%
0.1 0.4 3.5 1 74 56 75.3
0.1 0.6 4.0 2 73 53 72.5
0.1 0.8 4.5 3 87 23 26.5
0.2 0.4 4.0 3 75 72 96.0
0.2 0.6 4.5 1 73 64 87.0
0.2 0.8 3.5 2 80 63 79.1
0.3 0.4 4.5 2 81 57 70.9
0.3 0.6 3.5 3 78 48 61.2
0.3 0.8 4.0 1 89 52 58.3
K1 174.30 242.20 215.60 　 220.60
K2 262.10 220.70 226.80 222.50
K3 190.40 163.90 184.40 183.70
k1 58.10 80.90 71.87 73.53
k2 87.37 73.57 75.60 74.17
k3 63.47 54.63 61.47 61.23
R 29.27 26.27 14.13 12.94
F 3.95 3.64 1.89
　注:① K1代表水平 1的总值 , ②k1代表水平 1的平均值。下表同。
　　直观分析表明 ,RA为 29.27、RB为 26.27、RC为14.13、
空列因子 Re为 12.94 , 3种因子对丛生芽诱导产生效应的
大小依次是 NAA>CPPU>AgNO3 ,NAA 、CPPU 、AgNO3 的 R
值均比空列的大 ,说明各因素间的变异是可靠的。可见 ,
NAA 、CPPU 、AgNO3 是影响不定芽分化的主要因子 。
NAA的浓度为 0.2mg/L时的平均相对分化率为29.12 ,
分别是浓度为 0.1、0.3 mg/L的 1.5 、1.38倍 , 3种水平的平
均相对分化率的极差为 9.75 ,表现出明显的差异。CPPU浓
度为 0.4mg/L时和AgNO3 浓度为 4.0mg/L时的水平相对
分化率最高 ,分别为 26.97 、25.2 ,其 3种水平的平均相对分
化率的极差分别为 9.75、8.76和 4.71(表 4)。方差分析表
明 ,FA为 3.95、FB为 3.64 、FC为 1.89 ,3种因子的 F 值均
大于 1 ,说明各因素对试验的影响都显著 ,和直观分析的结
果相一致。因此 , 3 种因子的最佳结合应为 A2B1C2(0.2
mg/L NAA 、0.4 mg/L CPPU 、4.0 mg/L AgNO3),分化率为
96%,且单芽均增殖率为 5.5。
　　表4 虎舌红各因子不定芽的平均相对分化率比较
水平代码 处理
NAA∥mg/L CPPU∥mg/ L AgNO3∥mg/ L CK
1 　　19.37 　　26.97 　　23.96 　24.51
2 29.12 24.52 25.2 24.72
3 21.16 18.21 20.49 20.41
R 9.75 8.76 4.71 4.31
2.3　不定芽诱导生根试验　接种不定芽 6 d开始有根出现 ,
随后 ,大多数培养基不定芽不断生根 ,在接种 4周后统计丛生
芽不断生根 ,在接种 4周后统计丛生芽生根率见表 5。
经NAA 、IBA和活性炭 3个水平 9个浓度组合的正交试
验 ,对实验结果进行直观分析 ,发现 NAA 、IBA的极差分别
为 32.43 、24.27 ,比空列因子 Re大(Re =14.56),而活性炭
的极差为 8.14比 Re小 ,说明活性炭的效应是不可靠的 ,
NAA 、IBA两因素的效应可靠 。
方差分析表明 ,NAA 、IBA的 F 值分别为 4.15、2.68 ,大于
1;而活性炭的 F值为 0.13 ,小于 1。说明NAA 、IBA因子对丛生
芽诱根的影响较大 ,活性炭对从生芽诱根的影响较小 ,可以不
考虑。通过以上分析结果可知 ,各因子的最佳组合为A2B2(0.4
mg/L NAA 、0.3mg/L IBA),生根率为 93%(表 6)。
诱导生根后 ,移栽到珍珠岩和沙土各半的栽培基质中 ,
炼苗 2周 ,然后移栽到土壤中 ,按常规方法管理。35 d后小
苗成活 。
　　表 5 虎舌红不定芽生根诱导试验结果 L9(34)
因子
代码
处理
A B C D
接种数
个
分化数
个
分化率
%
1 0.2 0.1 1.0 1 78 39 50.2
2 0.2 0.3 3.0 2 83 61 73.1
3 0.2 0.5 5.0 3 76 35 46.5
4 0.4 0.1 3.0 3 81 65 79.6
5 0.4 0.3 5.0 1 83 77 93.0
6 0.4 0.5 1.0 2 81 62 76.2
7 0.6 0.1 5.0 2 90 55 61.4
8 0.6 0.3 1.0 3 78 53 66.3
9 0.6 0.5 3.0 1 89 21 23.8
K1 169.80 191.20 192.70 167.00
K2 248.80 219.00 176.50 210.70
K3 151.50 146.00 200.90 192.40
k1 56.60 63.73 64.23 55.67
k2 82.93 73.0 58.83 70.23
k3 50.50 48.73 66.97 64.13
R 32.43 24.27 8.14 14.56
F 4.15 2.68 0.13
　　表 6 虎舌红各因子不定芽生的平均相对分化率比较
水平代码 处理
NAA∥mg/ L IBA∥mg/ L Activated carbon CK
1 18.87 　　21.24 　　 21.41 　 18.65
2 27.64 24.33 19.61 25.08
3 16.85 16.24 22.32 21.38
R 10.79 7.09 2.71 6.43
3　讨论
(1)试验采用正交试验分别选取不同的影响因子进行
试验 ,筛选出虎舌红愈伤组织 、丛生芽和生根培养的最佳培
养基 ,建立了虎舌红离体培养系统 ,为其观赏和药用价值的
开发利用奠定了基础。
(2)与茎段等外植体培养相比用茎尖进行培养 ,形成丛
生芽的比例高 ,因而增殖率高 ,且变异性小。试验选用的无
菌芽茎尖最利于虎舌红的再生 ,可能是由于虎舌红茎尖的
分生能力强 、内源激素水平利于芽分化的缘故 。
　　(3)植物生长调节剂种类和浓度 ,对虎舌红的诱导和分
化有较大影响 。NAA是一种生长素 ,在组织培养中通常被
(下转第 4868页)
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3.3　高产 、优质 、高抗性 、早熟等基因筛选　农作物的不同
性状表型是其基因型决定的 ,是由单一或众多基因相互协同
作用的结果。作物高产 、优质 、早熟等性状可能是质量性状
也可能是数量性状。通过分子生物学方法 ,科研人员已经找
到了很多由单一基因控制的性状 ,但对于发现更多的有用基
因 ,或者鉴定由多基因控制的多态性变化与作物表型的关
系 ,分子生物学方法则有些无能为力 。基因芯片技术为传统
分子生物学研究提供了新的工具和思路 ,使快速发现具有重
要应用价值的新基因以及研究基因表达的差异和多态性成
为可能。通过制作全基因组芯片 ,科研人员可以在多样本大
群体中快速识别与相关性状和功能有关的特殊功能基因 ,比
如与农作物抗逆 、抗病 、高产 、优质 、早熟等相关的基因 ,从而
为新品种选育 、物种改良 、加快育种进程提供基础。
3.4　优良杂种后代选育　在育种工作中 ,从大量的杂交组
合群体中筛选具有目的基因的优良杂合体或者纯合体 ,从而
选育出具有优良性状或者说符合育种目的的目标个体 ,是最
繁重的一步 。但利用基因芯片技术 ,则可以简化传统的育种
程序 ,科研人员只需要制作带筛选目的基因的芯片 ,在试验
室里利用组织培养的植物就能够实现从杂种后代中筛选出
优良个体育成新品种的过程 ,而不再需要从大田中通过辛勤
的劳动和长时间的选择。因此 ,通过基因芯片技术 ,可以改
变传统育种工作模式 ,使作物遗传育种工作变得简单 、高效 、
快速 、精确。
3.5　杂交机理研究　杂交育种在提高作物产量 、改进作物
品质等方面起到了非常重要的作用 ,我国著名杂交水稻之父
袁隆平先生曾通过杂交育种方式培育出高产水稻 。既然通
过杂交可以获得优于亲本性状的后代个体 ,那么研究杂交优
势的分子机理将对充分了解杂交育种理论提供指导。通过
基因芯片技术 ,可以加快该项研究的进程 ,并使该项研究变
得简单方便 。科研人员可以制作杂种后代及父母本的全基
因组芯片 ,通过比较研究 ,既可获得父母本和杂种后代基因
表达的差异 ,找出相关的调控基因 ,从而也能研究清楚杂种
优势形成的分子机理 。
3.6　基因突变分析　基因突变是DNA序列上的核苷酸发生
了改变 ,造成相应基因的功能丧失或改变 ,从而引起相应性
状变化。基因突变在农业研究中具有重要意义 ,通过对突变
的研究 ,对于研究农作物高产 、优质 、早熟 、抗逆性等的分子
机制 ,研究农作物相关性状的调控机理等都是非常有效的。
通过DNA芯片技术 ,可以精确地检测到分子突变 ,并准
确地确定突变位点和突变型 ,它还可以同时检测多个基因乃
至整个基因组的突变 ,从而减少工作时间 ,提高工作效率。
3.7　其他方面　基因芯片具有筛选检测的高通量性 ,一个
基因芯片可以同时检测数百乃至数千个基因 ,所以 ,其用于
检测的优越性是不言而喻的。比如将用于转基因制作时所
用的载体相关信息(如:启动子 、终止子 、抗性基因 、标记基
因)的特异序列制作成芯片 ,则可以大规模快速鉴定某品种
是否为转基因品种[ 4] ;利用生物芯片技术对农作物品种进行
病原体检测 ,可以获得作物品种的相关感染信息[ 5] ,从而可
以指导生产中的防治工作 ,减少损失的发生 。
4　结语
基因芯片技术是刚刚发展起来的一种高新技术 ,随着其
研究的深入 、技术的成熟和制作成本的下降 ,在现代农业中
的应用前景将不可估量 ,对于探索作物分子突变与环境调节
的关系 、农作物疾病的检测与预防 、促进经济作物的品质改
良 、加快育种进程 、研究开发符合人们需求的农作物新品种
等都具有积极的意义。
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(上接第 4866页)
用于诱导细胞的分裂和根的分化 。CPPU为[ N-(2-氯-4-吡
啶基)-N/-苯基脲] ,是一种新型植物生长调节剂 ,在前阶段
试验发现CPPU在刺激细胞分裂 ,诱导芽的分化等方面比
6-BA好 ,因此 ,首次应用于紫金牛属植物 ,丛生效果较好 。
在不定芽诱导阶段 ,适量添加 AgNO3 对不定芽的增殖起一
定的辅助作用 ,并可一定程度地控制黄化现象[ 11] 。蔗糖对
虎舌红再生体系的构建有一定的影响。蔗糖除起维持渗透
压和提供碳源的作用外 ,其浓度对离体培养过程中器官发
生的影响己有许多报道[ 12] ,不同品种其影响方式也不一
样 ,蔗糖有时能影响丛生芽发生频率。
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