全 文 ：第 10 期 杨美玲，等:苦参碱 Fe(III)化合物的合成及其与 HSA相互作用的光谱研究
第 26 卷第 10 期
2 14 年 10 月
化 学 研 究 与 应 用
Chemical Ｒesearch and Application
Vol． 26，No． 10
Oct．，2014
文章编号:1004-1656(2014)10-1557-06
蒌叶乙醇提取物抗氧化及抗疲劳作用研究
纪明慧1，郭飞燕1，王呈文1，陈 忠1，2，舒火明1，3* ，韩采密1
(1. 海南师范大学“省部共建-热带药用植物化学”教育部重点实验室，海南 海口 571158;
2. 海南师范大学生命科学院，海南 海口 571158;3. 海南经贸职业技术学院，海南 海口 571127)
摘要:以 75%乙醇提取蒌叶提取物，运用鲁米诺化学发光体系测定提取物清除羟自由基的能力，并以小白鼠
为研究对象，从运动耐力学和生化指标两方面，考察蒌叶乙醇提取物的抗疲劳活性。结果表明:蒌叶乙醇提取
物对羟基自由基抑制的 IC50为 63. 65μg·mL
－1，其提取物能显著延长小鼠负重游泳时间，明显降低运动后血清
尿素氮水平，具有降低小鼠运动后血乳酸曲线下面积的作用。蒌叶乙醇提取物具有抗氧化和缓解体力疲劳的
作用，其提取物中抗氧化活性成分有较高的热和光稳定性。
关键词:蒌叶;抗氧化;抗疲劳;流动注射化学发光法
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:A
Antioxidation and antifatigue activities of the
ethanolic extract from piper betle
JI Ming-hui1，GUO Fei-yan1，WANG Cheng-wen1，CHEN Zhong1，2，SHU Huo-ming1，3* ，HAN Cai-mi1
(1. Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of the Ministry of Education，Hainan Normal University，
Haikou 571158，China;2. College of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China;
3. Hainan College of Economics and Business，Haikou 571127，China)
Abstract:The 75% ethanol extract from the leaf of piper betle(ELPB)was obtained. ELPB was measured the capability for scaven-
ging hydroxyl radical by luminol chemiluminescence system. And the anti-fatigue effects was studied in two aspects of exercise per-
formance and biochemical indexes by the mice. The results showed that ELPB had good ability to scavenge hydroxyl radicals(IC50
63. 65mg·mL －1). It also prolonged the swimming time to exhaustion of mice compared to the control. It decreased the levels of
blood lactic acid(BLA)and serum urea nitrogen(SUN). ELPB had marked anti-oxidation effect，and also can alleviate physical fa-
tigue in mice. And the antioxidant component from ELPB had high thermal and light stability.
Key words:piper betle;antioxidant;anti-fatigue;flow injection-chemiluminescence method
蒌叶(Piper betle L. )，别名青蒟、芦子、大芦
子、槟榔蒟、槟榔蒌，是一种常见的胡椒科胡椒属
植物［1］，在我国主要分布于云南、广西、海南、台湾
等地。蒌叶有很高的药用价值，在《本草纲目》、
《中药大辞典》和《本草纲目拾遗》中均有记载，蒌
叶根、籽、叶皆入药，具有祛风散寒、行气化痰、消
肿止痒之功效［1，2］。民间用于治疗风寒咳嗽、支气
管哮喘、风湿骨痛、胃寒痛、妊娠水肿，牙痛等，外
收稿日期:2014-02-06;修回日期:2014-05-15
基金项目:海南省自然科学基金项目(213019)资助;海南省大学生科技创新项目(2013116580)资助
联系人简介:舒火明(1961-)，男，教授，主要从事天然产物化学研究。E-mail:Shuhm2000@ sina. com
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
用治皮肤湿疹、脚癣。如今国内外学者对蒌叶的
化学成分和功能进行了一些研究［3-9］。但有关蒌
叶在抗氧化和抗疲劳活性方面的研究报导并不多
见，只见梁辉等人以 DPPH 法及邻苯三酚褪色法
对云南保山产的蒌叶进行抗氧化研究［7］;陈晓珍
等人利用蒌叶提取物或槟榔加蒌叶提取物，研制
了一种防治神经衰弱的药物，该药物具有提神醒
脑，消除疲劳的效用［8］。因此，本文将以小白鼠为
研究对象，从运动耐力学和生化指标两方面，考察
蒌叶乙醇提取物的抗疲劳活性;用 H2O2-鲁米诺化
学发光体系测定蒌叶乙醇提取物对羟自由基的抑
制作用，确定其半数抑制浓度，同时以清除·OH 的
活性为指标，考察温度、光照对其抗氧化活性的影
响。以期增加人们对蒌叶的认识，开发它的潜在
医疗保健功能，进行深加工，有效利用蒌叶丰富的
天然资源，增加经济收入都有积极促进作用和重
要意义。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
蒌叶采自海南万宁，经海南师范大学生命科
学学院钟琼芯老师鉴定为胡椒科胡椒属植物。
试验动物:60 只健壮雄性小白鼠，体重 25 ± 2
g，由广州动物实验中心提供。实验期间全部动物
给予清洁级鼠颗粒饲料和灭菌水自由食用。
鲁米诺(Luminol，分析纯，苏州工业园区亚科
化学试剂有限公司);氢氧化钠(分析纯，广州化学
试剂厂);碳酸氢钠(分析纯，广州化学试剂厂);硫
酸铜(分析纯，北京化工厂);30%过氧化氢(分析
纯，广州化学试剂厂);无水乙醇(分析纯，广州化
学试剂厂);维生素 C(分析纯，天津市四通化工
厂);血乳酸测定试剂盒(南京建成生物研究所);
血尿素氮测定试剂盒(南京建成生物研究所);肝
糖元测定试剂盒(南京建成生物研究所)。
BS-124S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统
有限公司);IFFM-E 型流动注射化学发光仪(西安
瑞迈电子科技有限公司);pHS-3C 型精密 pH 计
(上海康仪仪器有限公司);ＲE52 旋转蒸发仪(上
海亚荣生化仪器厂);循环水真空泵(SHZ-DII，巩
义市予华仪器有限责任公司);LX-600 冷却水循
环机(北京长流科学仪器公司);721 可见分光光
度计(上海菁华科技仪器有限公司);小鼠玻璃游
泳缸(120 cm ×60 cm ×60cm)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 蒌叶乙醇提取物的制备 将 1Kg 洗净、烘
干、粉碎的蒌叶叶子，用 2 000mL75%乙醇浸泡 1
h，加热回流 2 h，过滤，滤渣重复提取 2 次，合并 3
次滤液，在 60℃减压浓缩至棕色浸膏 100 g，浸膏
冷冻干燥，备用。
1. 2. 2 蒌叶乙醇提取物的抗疲劳活性测定 (1)
剂量及分组:游泳实验及各项生化指标(全血乳
酸、肝糖原、血清尿素氮)所用动物均各按体重把
小白鼠分成 4 组，即空白(重蒸水)对照组(CG)，
蒌叶乙醇提取物低量组(LD)，中量组(MD)，高量
组(HD)，每组十五只。根据小白鼠体重，蒌叶乙
醇提取物 50mg /kg 为低量组，100mg /kg 为中量
组，200mg /kg为高量组。小鼠连续灌胃 15d，实验
组给予各组蒌叶乙醇提取物，对照组给予等容量
溶剂重蒸馏水。试验期间小鼠自由摄食及饮水，
每隔 2d 称量一次体重，根据体重调整灌胃量。
(2)负重游泳实验:给药 15d 后，末次灌胃
30min后，置小白鼠于游泳缸(120 cm × 60 cm ×
60cm)中游泳，水深不低于 30cm，水温 30℃，鼠尾
根部负荷体重 4%的铅皮，记录小鼠自游泳开始至
沉入水中 8s 不能浮起时间，记录为力竭时间
(min)。
(3)全血乳酸含量的测定实验:把实验所用离
心管编号后，在各管中加入 0. 3mL蛋白沉淀剂，对
号加入 0. lmL 肝素抗凝剂。
末次灌胃 30min 后，分别从每组小鼠中取出 5
只小白鼠，分别用小针管从内眦采血 100μL后，在
小白鼠不负重的情况下，置于 30℃ 的游泳缸中游
泳 60min后停止，并立即采血，待小白鼠游泳完休
息 20min后，再分别采血 100μL，所有的血样都加
入编好号的试管中，混匀，静置 l0min 后，以 3 500
－ 4 000r·min －1离心 8min，取上清液置冰箱中冷藏
备用。按照试剂盒的方法测定乳酸含量(具体操
作见表 1)，记录并分析数据。血乳酸曲线下面积
参照 2003 年卫生部发布的《保健食品检验与评价
技术规范》中公式:血乳酸曲线下面积 =(5 ×游泳
前血乳酸值 + 15 ×游泳后 0min 的血乳酸值 + 10
×游泳后休息 20min的血乳酸值)进行计算［10，11］。
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第 10 期 纪明慧，等:蒌叶乙醇提取物抗氧化及抗疲劳作用研究
表 1 全血乳酸含量的测定方法
Table 1 The determination method of
whole blood lactate content
空白管 标准管 测定管
蒸馏水 /mL 0. 02 0 0
3mmol·L －1标准液 /mL 0 0. 02 0
上清液 /mL 0 0 0. 02
酶工作液 /mL 1. 0 1. 0 1. 0
显色剂 /mL 0. 2 0. 2 0. 2
各试管混匀后于 37℃水浴反应 10min，然后
各加入 2. 0mL终止液，混和均匀后取样，以 721 分
光光度计在 530mm处，测各管溶液吸光度值。
(4)肝糖原含量的测定实验:将(3)实验小白
鼠取完血后处死，立即取出肝脏，以生理盐水冲洗
干净并用滤纸吸干，准确称取肝脏组织按照试剂
盒说明书的方法进行操作，测定实验小鼠的肝糖
原含量(具体操作见表 2)。
表 2 肝糖原含量的测定方法
Table 2 The determination method
of hepatic glycogen content
空白管 标准管 测定管
蒸馏水 /mL 1. 0 0 0. 9
0. 01mg·mL －1
标准液 /mL
0 1. 0 0
糖元检测液 /mL 0 0 0. 1
显色液 /mL 2. 0 2. 0 2. 0
各试管混匀后置沸水中煮 5min，冷却后用
721 分光光度计于 620nm 波长处，测各管溶液吸
光度值。
(5)血尿素氮含量的测定实验:小鼠连续灌胃
实验 15d后，分别从各实验组中随机取出 5 只小
鼠，于末次给药 30min后，在温度为 30℃的水中不
负重游泳 90min，休息 60min 后拔眼球取血约
0. 4mL，置 4℃ 冰箱约 3h，血液凝固后 2 000r·
min －1，离心 15min，摘眼球取血液 100μL，分离血
清，按照试剂盒的方法测定血清尿素氮含量(具体
操作见表 3)，记录并分析数据。
各试管混匀，置 37℃水浴反应 10min，各试管
加酚显色剂 1mL，碱性次氯酸钠 1mL，充分混匀，
37℃水浴反应 10min，用 721 分光光度计于 640nm
处，测定各管溶液吸光度值。
统计学处理结果用 X ± S 表示，采用
SPSS13. 0 软件进行单因素方差分析处理。
表 3 血尿素氮含量的测定方法
Table 3 The determination method of blood
urea nitrogen content
空白管 标准管 测定管
蒸馏水 /mL 0. 02 0 0
10mmol·L －1BUN
标准液 /mL
0 0. 02 0
待测标本 /mL 0 0 0. 02
缓冲酶液 /mL 0. 25 0. 25 0. 25
1. 2. 3 蒌叶乙醇提取物的抗氧化活性测定 将
蒌叶的乙醇提取物冷冻干燥，取适量提取物加无
水乙醇溶解配制成 0. 04、0. 06、0. 08、0. 1、0. 12、
0. 14mg·mL －1一系列浓度的蒌叶乙醇提取物，同
时配制相应浓度的维生素 C 溶液，用流动注射化
学发光法考察不同浓度的蒌叶乙醇提取物对羟基
自由基的抑制作用，仪器操作步骤参照文
献［9，12，13］，并作适当的改进。
分别配制质量分数为 0. 3%的 H2O2、0. 8 ×
10 －4 mol·L －1的鲁米诺溶液、1. 0 × 10 －5mol·L －1硫
酸铜和 1. 0 × 10 －5 mol·L －1 维生素 C 溶液，以
0. 1mol·L －1的 Na2CO3-NaHCO3 缓冲溶液调节体系
的 pH为 10. 18，各溶液分别按照流动注射化学发
光分析法操作步骤输入各自仪器的管路中，其中
1. 0 × 10 －5mol·L －1硫酸铜和维生素 C 加入量体积
比为 7∶ 4。当主蠕泵中进的是鲁米诺溶液和空白
溶液时，发光强度为空白值 I0，当进的是待测液
时，发光强度记为 I，根据发光信号强度的降低值
(I0 － I)，可以定量分析待测液中的成分清除羟基
自由基的能力。参照文献［9，13］，羟基自由基抑制
率的计算公式如下:
羟基自由基抑制率 =［(I0-I)/ I0］× 100%
1. 2. 4 提取物抗氧化活性的稳定性研究 (1)温
度对蒌叶乙醇提取物抗氧化活性的影响:取 7 份
浓度为 100μg·mL －1的蒌叶乙醇提取物溶液置于
温度为:－10、0、20、30、40、60、80℃的恒温条件下保持
4h，按 1. 2. 3节方法测定各溶液对羟基自由基的清除
能力，并参照文献［14］方法计算活性保存率。
9551
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
(2)光对蒌叶乙醇提取物抗氧化活性的影响:
取 3 份浓度为 100μg·mL －1的蒌叶乙醇提取物溶
液分别置于自然光照下、白炽灯光照下、避光条件
下，每隔一天测定其对羟基自由基的清除能力，连
续测 7d，参照文献［14］方法计算活性保存率。
2 结果与分析
2. 1 蒌叶乙醇提取物的抗疲劳实验结果
2. 1. 1 蒌叶乙醇提取物对小白鼠负重游泳时间
的影响 小白鼠连续灌胃 15d 后，进行负重游泳
实验，考察不同剂量的蒌叶乙醇提取物对小白鼠
负重游泳时间的影响。结果见表 4。
表 4 蒌叶乙醇提取物对小白鼠负重游泳时间的影响
Table 4 Effects of ELPB on weight-swimming time in mice
组别 游泳时间 /min
阴性对照组 95. 77 ± 1. 72
低量组 99. 86 ± 2. 55*
中量组 112. 66 ± 2. 67＊＊
高量组 123. 35 ± 2. 13＊＊
(n = 5，X ± s，注:n为小白鼠数量，X为平均游泳时间，s为标
准偏差)
由表 4 可见，各剂量组小鼠游泳时间均比对
照组延长，低剂量组与对照组值相比有显著差异
(* P ＜ 0. 05)，中、高剂量组均有极显著性差异(＊＊
P ＜ 0. 01)，蒌叶乙醇提取物具有延长小鼠负重游
泳时间作用。疲劳最直接最客观的表现是运动耐
力的下降，在运动中，机体运动能力的降低是由于
体力性疲劳的出现所致，因而延缓体力性疲劳的
出现有助于机体运动能力的保持。运动耐力的提
高是缓解机体体力疲劳的一种宏观表现，是认定
蒌叶乙醇提取物具有抗疲劳功能的必要条件［15］，
即蒌叶乙醇提取物具有缓解小鼠运动疲劳的作用。
2. 1. 2 蒌叶乙醇提取物对小鼠运动后血乳酸含
量及曲线下面积的影响 小白鼠连续灌胃 15d
后，小白鼠不负重游泳，进行全血乳酸含量测定，
考察不同剂量的蒌叶乙醇提取物对小白鼠全血乳
酸含量的影响。结果见表 5。
表 5 蒌叶乙醇提取物对小鼠运动后血乳酸含量及曲线下面积的影响
Table 5 Effects of ELPB on blood lactic acid and area under curve of blood lactic acid in post-exercise mice
组 别
血乳酸含量 /mmol·L －1
游泳前 游泳后即刻 游泳后 20min
血乳酸曲线
下面积 /mmol·L －1
阴性对照组 10. 08 ± 1. 19 23. 52 ± 1. 32 18. 20 ± 0. 51 585. 20 ± 21. 67
低量组 9. 52 ± 0. 48 22. 96 ± 1. 75 18. 48 ± 1. 45 576. 80 ± 24. 61
中量组 10. 64 ± 0. 50 19. 57 ± 0. 43 15. 40 ± 0. 97 500. 75 ± 16. 30＊＊
高量组 11. 48 ± 1. 27 18. 48 ± 0. 84 15. 96 ± 1. 45 494. 20 ± 23. 13＊＊
(n = 5，X ± s，X为平均乳酸含量或血乳酸曲线下面积，s为标准偏差)。
由表 5 可见，中、高剂量组小鼠运动前后三个
时间点血乳酸曲线下面积与阴性对照组值相比均
有极显著差异(＊＊P ＜ 0. 01)，表明蒌叶乙醇提取
物具有降低小鼠运动后血乳酸曲线下面积的作
用。乳酸堆积是机体疲劳的原因之一，在肌肉收
缩初始和剧烈收缩时，会产生大量乳酸，使肌肉中
乳酸浓度上升，pH 值下降，导致疲劳发生。减少
乳酸的生成或加快其清除速率均能增强抗疲劳作
用［15-17］。
2. 1. 3 蒌叶乙醇提取物对小鼠肝糖原含量的影
响 小白鼠连续灌胃 15d 后，进行小白鼠肝糖原
含量测定，考察不同剂量的蒌叶乙醇提取物对小
白鼠肝糖原含量的影响。结果见表 6。
表 6 蒌叶乙醇提取物对小白鼠肝糖原含量的影响
Table 6 The effect of ELPB on liver glycogen levels for mice
组别 肝糖原含量 /mg·g －1肝
阴性对照组 12. 01 ± 1. 20
低量组 12. 75 ± 0. 27
中量组 12. 89 ± 0. 43
高量组 13. 45 ± 0. 73
(n = 5，X ± s，注:n为小白鼠数量，X为平均肝糖原含量，s为
标准偏差)。
由表 6 可见，不同剂量组给药后，小鼠肝糖原
含量与对照组值比较均无明显增加(P ＞ 0. 05)，实
验结果表明该样品无增加小鼠肝脏糖原储备作
用。肝糖原含量是反映疲劳程度的敏感指标之
0651
第 10 期 纪明慧，等:蒌叶乙醇提取物抗氧化及抗疲劳作用研究
一，提高肝糖原贮量可维持长时间运动的血糖浓
度，延缓中枢疲劳和外周疲劳的出现［10，17］。
2. 1. 4 蒌叶乙醇提取物对小鼠运动后血清尿素
氮含量的影响 小白鼠连续灌胃 15d 后，小白鼠
不负重游泳，进行运动后血清尿素氮含量测定，考
察不同剂量的蒌叶乙醇提取物对小白鼠运动后血
清尿素氮含量的影响。结果见表 7。
表 7 蒌叶乙醇提取物对小鼠运动后血清尿素氮含量的影响
Table 7 The effect of ELPB on the content of blood
urea nitrogen levels for mice
组别 血清尿素氮含量 /mmol·L －1
阴性对照组 6. 89 ± 0. 67
低量组 4. 22 ± 0. 51*
中量组 3. 33 ± 1. 00＊＊
高量组 2. 33 ± 0. 33＊＊
(n = 5，X ± s，注;n为小鼠数量，X为平均尿素氮，s为标准偏
差)
由表 7 可见，给小鼠灌不同剂量的蒌叶提取
物，各剂量组小鼠游泳 90min 后血清尿素氮均低
于对照组值，中剂量组和高剂量组与阴性对照组
值相比均有极显著差异(＊＊P ＜ 0. 01)，低剂量组
有显著差异(* P ＜ 0. 05)，蒌叶乙醇提取物可以减
少疲劳小鼠血清尿素氮产生。机体尿素氮(BUN)
含量随劳动及运动负荷的增加而增加。机体对负
荷适应能力越差，尿素氮增加越明显，尿素氮含量
的变化可说明体内含氮物质分解代谢状况，也是
评价机体在特殊条件下体力运动符合承受能力的
一个较为灵敏的指标［10，17］。
2. 2 蒌叶乙醇提取物对羟基自由基的抑制作用
配制不同浓度的蒌叶提取物溶液和 Vc 溶液，
考察其对羟基自由基的抑制活性。实验结果如图 1
所示。由图中可见，随着蒌叶乙醇提取物浓度和 Vc
溶液浓度的增加，其对羟基自由基的抑制率也增
加。活性部位对羟基自由基成剂量依赖性，有较强
的抑制作用，量-效关系明显。通过 IC50计算软件可
以计算出蒌叶乙醇提取物和 Vc 对羟基自由基半抑
制率分别为 63. 65、104. 75μg·mL －1，蒌叶乙醇提取
物对羟基自由基的抑制能力高于 Vc，因此充分显示
了蒌叶具有清除羟基自由基的高效性能。
据文献报导，蒌叶富含挥发油，其挥发油中主
要化学成分为酚类化合物［2，3］;朱芸等人对蒌叶的
化学成分分析结果表明，蒌叶乙醇提取物中含有
4-丙烯基-苯邻二酚，胡椒碱，胡椒次碱等成分［4］，
其中一些酚类化合物和生物碱都具有很强的抗氧
化活性［18-22］，这些化合物与羟基自由基之间很容
易进行一系列反应，阻断了羟基自由基对鲁米诺
的氧化［12，13］，因而鲁米诺的发光强度降低，其降低
的幅度越大，羟基自由基被阻断或清除的程度就
越高，说明蒌叶乙醇提取物的抗氧化性越强。
图 1 提取物和 Vc溶液对羟基自由基的抑制率
Fig. 1 The scavenging ratio on hydroxyl radical(·OH)
of ELPB and Vc
2. 3 抗氧化稳定性研究
2. 3. 1 温度对蒌叶乙醇提取物抗氧化活性的影
响 实验结果见图 2。由图 2 可知，当温度在 － 10
－ 40℃时，蒌叶乙醇提取物的抗氧化活性成分较
稳定，对羟基自由基的抑制率基本不变，活性保持
率在 99%以上。当温度升到 80℃时提取物对羟
基自由基的抑制率有下降的趋势，但变化不大，活
性保持率为 89. 38%，因此，蒌叶乙醇提取物有较
高的热稳定性。
图 2 温度对提取物抑制羟基自由基活性的影响
Fig. 2 Effects of temperature on hydroxyl radical(·OH)
scavenging activities of ELPB
1651
化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
2. 3. 2 光对蒌叶乙醇提取物抗氧化活性的影响
实验结果见图 3。
不同光照环境下，蒌叶乙醇提取物对羟基自
由基的抑制作用结果见图 3，从图中可以看出，白
炽灯照对蒌叶乙醇提取物抗氧化活性有一定的影
响，白炽灯照到 7d时，活性保持率为 81. 73%。在
自然光照和避光条件下，蒌叶乙醇提取物对羟基
自由基的抑制率随时间的延长呈下降趋势，但在
7d时间里，活性保持率仍然保持在 90%以上，故
蒌叶乙醇提取物对自然光有很好的稳定性。 图 3 光照对提取物抑制羟基自由基活性的影响
Fig. 3 Effects of light on hydroxyl radical(·OH)
scavenging activities of ELPB
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(责任编辑 罗 娟)
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