全 文 ：第 33 卷第 6 期
2013 年 12 月
林 产 化 学 与 工 业
Chemistry and Industry of Forest Products
Vol． 33 No． 6
Dec． 2013
doi:10． 3969 / j． issn． 0253－2417． 2013． 06． 018
响应面法优化神秘果叶总三萜的超声波提取工艺
收稿日期:2012 － 11 － 26
基金项目:国家自然科学基金资助项目(21166009) ;海南省高等学校科学研究基金项目(Hjkj2012 － 22) ;海南省高等学校优秀中青
年骨干教师基金项目(无编号)
作者简介:卢圣楼(1987 －)，男，江苏南京人，硕士生，从事天然产物分离的研究;E-mail:lushenglou@ 163． com
* 通讯作者:刘 红(1967 －) ，教授，博士，硕士生导师，主要研究领域为天然产物化学和功能食品开发。
LU Sheng-lou
卢圣楼，刘 红* ，臧文霞，李 芸，张 强，王子欢
( 海南师范大学化学与化工学院，热带药用植物化学教育部重点实验室，海南 海口 571127)
摘 要: 采用响应面法优化超声波提取海南产神秘果叶总三萜的最佳工艺条件。在单因素试验
的基础上，选取乙醇体积分数、提取温度、液料比和超声波作用时间作为影响因子，根据 Box－
Behnken中心组合原理设计 4 因素 3 水平试验，以神秘果叶总三萜的得率为响应值进行响应面分
析。得到超声波提取神秘果叶总三萜的最优工艺条件为: 1． 0 g 神秘果叶，乙醇体积分数 70 %，提
取温度 50 ℃，液料比 30 ∶ 1( mL ∶ g) 和超声波作用时间 33 min，实际得率 0． 92 %，与模型预测值( 0． 94 % ) 基本相符。
关键词: 神秘果叶;响应面法;总三萜; 超声波提取
中图分类号:TQ351; O657． 3 文献标识码:A 文章编号:0253 － 2417( 2013) 06 － 0095 － 06
Optimization of Ultrasound Extraction of Total Triterpenoids from
Synsepalum dulcificum Leaf by Ｒesponse Surface Methodology
LU Sheng-lou，LIU Hong，ZANG Wen-xia，LI Yun，ZHANG Qiang，WANG Zi-huan
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Key Laboratory of Tropical
Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，Haikou 571127，China)
Abstract:The ultrasound extraction process parameters of total triterpenoids from Synsepalum dulcificum leaf from Hainan
province was optimized by response surface methodology． The experiments were arranged according to Box-Behnken central
composite experiment design． Four independent influencing factors of extraction，such as concentration of ethanol，extraction
temperature，the ratio of liquid to solid and ultrasonic time，were considered on the basis of single factor experiments． The results
showed that the optimum ultrasound extraction conditions for total triterpenoids were as follows:concentration of ethanol 70 %，
extraction temperature 50 ℃，the ratio of liquid to solid 30 ∶ 1(mL ∶ g)and ultrasonic time 33 min． The experimental yield
(0． 92 %)was in good agreement with its predicted value (0． 94 %)by model．
Key words:Synsepalum dulcificum leaf;response surface methodology;total triterpenoids;ultrasound extraction
神秘果(Synsepalum dulcificum) ，亦称奇迹果(miracle fruit)或蜜拉圣果，系山榄科神秘果属，常绿灌
木植物，原产于西非热带地区，20 世纪 60 年代引入中国云南、海南、广东和福建等地区种植［1］，属于国
宝级的珍稀植物。神秘果含有奇特的神秘果素，是一种变味糖蛋白，能改变人的味觉，使原本酸度强烈
的食物变成甜味［2］。神秘果除了具有改变味觉功能外，还具有改善胰岛素抵抗［3］与抗氧化［4－5］作用，神
秘果茎的功能成分具有抑制黑色素瘤和降低蘑菇络氨酸酶的功效［6］，神秘果叶具有防治动脉硬化和糖
尿病等生物活性，亦可快速解酒［7］，神秘果种子具有显著降低糖尿病小鼠空腹血糖值，促进胰岛素分泌
的药理活性［8］，因此，神秘果可用于医药和功能食品等领域［9－10］。三萜类化合物具有溶血、抗癌、抗炎、
抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物与抗生育等多种生物活性［11－12］。本试验以海南产神秘果叶总三
萜的得率为指标，在单因素试验的基础上，利用响应面法对神秘果叶总三萜的超声波提取工艺参数进行
96 林 产 化 学 与 工 业 第 33 卷
优化，以期为其在保健食品和药品等领域提供参考。
1 实 验
1． 1 材料、试剂与仪器
神秘果叶采自海南省保亭县，经海南师范大学生命科学学院钟琼芯高级实验师鉴定。试验前，将神
秘果叶洗净，自然晾干，粉碎过 0． 25 mm筛，放入干燥器中备用。齐墩果酸对照品，四川维克奇生物科
技有限公司;香草醛、乙醇、高氯酸和冰醋酸等，均为国产分析纯。
TU－1901 双光束紫外可见分光光度计;800 电动离心机;XO－5200DTS 超声波清洗仪;HH－1 数显
恒温水浴锅。
1． 2 方法
1． 2． 1 标准曲线的制作 参考文献［13］略加修改。准确称取干燥至质量恒定的齐墩果酸对照品
2． 5 mg，置于 25 mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为 100 mg /L的对照品溶液。精密
吸取该对照品溶液 0． 0、0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、0． 6 和 0． 7 mL置于具塞试管中，水浴加热，挥尽乙醇，分别
加入 0． 4 mL新配制的 5 % 香草醛－冰醋酸溶液和 1 mL高氯酸，60 ℃ 水浴加热 15 min后，冰浴冷却，再加
入 5． 0 mL冰醋酸，充分摇匀，室温放置 15 min，于 548 nm处测定吸光度值，随行作空白对照。以齐墩果酸
的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线，得标准回归方程为:A = 0． 013 8c + 0． 087 2，
Ｒ2 =0． 998 7。
1． 2． 2 神秘果叶总三萜的提取 准确称取神秘果叶粉末 1． 0 g，置于 100 mL 锥形瓶中，加入一定体积
分数的乙醇溶液，封口膜密封后置于超声波洗涤器中，按相应提取温度、液料比和超声波作用时间进行
萃取(45 kHz频率固定)。将不同条件下超声波萃取的神秘果叶提取液离心分离，残渣在相同的条件下
提取 2 次，合并上清液。每份样品溶液分别吸取 0． 5 mL置于具塞试管中，挥尽溶剂，以下操作同 1． 2． 1
节，测定吸光度值。按照标准回归方程计算出神秘果叶总三萜得率。计算公式如下:
得率 =提取的总三萜质量
神秘果叶粉末质量
× 100 %
1． 3 单因素试验
1． 3． 1 乙醇体积分数 在液料比 30 ∶ 1(mL ∶ g，下同) ，提取温度 60 ℃，超声波作用时间 40 min 的条件
下，分别考察 50 %、60 %、70 %、80 % 和 90 % 乙醇体积分数对总三萜得率的影响。
1． 3． 2 提取温度 取 1． 3． 1 节选取的最佳乙醇体积分数，在液料比 30 ∶ 1，超声波作用时间 40 min的条
件下，分别考察 30、40、50、60 和 70 ℃ 对总三萜得率的影响。
1． 3． 3 液料比 乙醇体积分数和提取温度采用 1． 3． 1 和 1． 3． 2 节优化的结果，分别考察 20 ∶ 1、25 ∶ 1、
30 ∶ 1、35 ∶ 1 和 40 ∶ 1 对总三萜得率的影响。
1． 3． 4 超声波作用时间 采用 1． 3． 1、1． 3． 2 和 1． 3． 3 节优化的试验结果，分别考察 20、30、40、50 和
60 min对总三萜得率的影响。
1． 4 响应面试验设计
综合单因素试验结果，根据 Box － Behnken 的中心组合设计原理，分别选取乙醇体积分数(X1)、提
取温度(X2)、液料比(X3)和超声波作用时间(X4)作为自变量，以神秘果叶总三萜的得率作为响应函
数，采用响应面分析法，通过回归得出自变量与响应函数之间的统计模型。
神秘果叶总三萜的得率(Y)作为评价指标的预测模型，由最小二乘法拟合的二次多项式方程为:
Y = β0 + ∑βi + ∑βiiX2i + ∑∑βijX iX j 。式中，Y为预测响应值;β0 为常数值;βi 为线性系数;βii为
二次项系数;βij为交互项系数。
第 6 期 卢圣楼，等:响应面法优化神秘果叶总三萜的超声波提取工艺 97
2 结果与讨论
2． 1 单因素试验
2． 1． 1 乙醇体积分数 乙醇体积分数对总三萜得率的影响如图 1(a)。由图可以看出，在乙醇体积分
数为 70 % 之前的得率增加趋势明显，70 % 之后总三萜得率缓慢下降，这可能由于乙醇体积分数的提
高会使一些醇溶性杂质或亲脂性强的成分溶出。因此，乙醇体积分数以 70 % 为宜。
2． 1． 2 提取温度 提取温度对总三萜得率的影响如图 1(b)。由图可以看出，在低于 50 ℃ 的范围内随
着温度的逐渐升高总三萜得率随之升高，说明较高的温度对三萜类化合物的溶出是有利的。但温度超
过 50 ℃ 之后，总三萜得率略有下降，这可能由于在较高温度下，溶剂挥发严重加之其它物质也随之溶
出。故选取超声波提取温度为 50 ℃。
2． 1． 3 液料比 液料比对总三萜得率的影响如图 1(c)。由图可以看出，随着料液比的增加，总三萜的
得率呈现先上升后下降的趋势。这是由于溶剂用量增加，可以使药材与溶剂接触面积增大，并且能够增
大固液浓度差，有利于扩散速度的提高。为避免溶剂浪费，选择料液比为 30 ∶ 1。
2． 1． 4 超声波作用时间 超声波作用时间对总三萜得率的影响如图 1(d)。由图可以看出，超声波在
较短时间内能够对神秘果叶总三萜进行充分萃取，超声波作用时间越长，总三萜得率越高。但超过
30 min，总三萜得率略有下降，这可能由于在提取溶剂量不变的情况下，超声波作用时间过长，其它物质
也会溶出，从而影响了总三萜的得率。因而，选取超声波作用时间为 30 min。
图 1 各因素对神秘果叶总三萜得率的影响
Fig． 1 Effects of the factors on total triterpenoids yield from Synsepalum dulcificum leaf
2． 2 模型的建立与显著性分析
根据 Box－Benhnken模型，以乙醇体积分数、提取温度、液料比和超声波作用时间为自变量，以神秘
果叶总三萜得率为响应值。响应面试验的设计和试验结果见表 1。利用 Design－Expert 8． 0 软件对表 1
的试验数据进行回归分析，拟合后得到了预测响应值与编码自变量的二次多项回归模型方程为:
Y = 0． 92 + 0． 023X1 + 0． 043X2 + 0． 039X3 + 0． 051X4 － 0． 063X
2
1 － 0． 085X
2
2 － 0． 110X
2
3 － 0． 091X
2
4 +
0. 007 5X1X2 + 0． 010X1X3 － 0． 037X1X4 + 0． 075X2X3 － 0． 007 5X2X4 + 0． 023X3X4
表 1 响应面设计方案和试验结果
Table 1 Matrix and experimental results of response surface methodology
编号
No．
X1
乙醇体积分数 /%
EtOH volume
fraction
X2
提取温度 /℃
extraction
temperature
X3
液料比(mL ∶ g)
ratio of liquid
to solid
X4
超声波作用
时间 /min
ultrasonic time
得率 yield /%
试验值
experimental value
预测值
predicted value
1 70 60 35 ∶ 1 30 0． 92 0． 88
2 80 60 30 ∶ 1 30 0． 82 0． 85
3 70 60 30 ∶ 1 40 0． 83 0． 83
4 70 60 30 ∶ 1 20 0． 76 0． 74
5 60 60 30 ∶ 1 30 0． 75 0． 79
6 70 60 25 ∶ 1 30 0． 66 0． 65
7 80 50 35 ∶ 1 30 0． 83 0． 82
8 70 50 35 ∶ 1 40 0． 8 0． 83
9 70 50 35 ∶ 1 20 0． 63 0． 68
98 林 产 化 学 与 工 业 第 33 卷
续表 1
编号
No．
X1
乙醇体积分数 /%
EtOH volume
fraction
X2
提取温度 /℃
extraction
temperature
X3
液料比(mL ∶ g)
ratio of liquid
to solid
X4
超声波作用
时间 /min
ultrasonic time
得率 yield /%
试验值
experimental value
预测值
predicted value
10 60 50 35 ∶ 1 30 0． 76 0． 75
11 80 50 30 ∶ 1 40 0． 81 0． 80
12 80 50 30 ∶ 1 20 0． 79 0． 78
13 60 50 30 ∶ 1 40 0． 85 0． 83
14 60 50 30 ∶ 1 20 0． 68 0． 65
15 80 50 25 ∶ 1 30 0． 72 0． 72
16 70 50 25 ∶ 1 40 0． 72 0． 71
17 70 50 25 ∶ 1 20 0． 64 0． 65
18 60 50 25 ∶ 1 30 0． 69 0． 69
19 70 40 35 ∶ 1 30 0． 67 0． 64
20 80 40 30 ∶ 1 30 0． 74 0． 75
21 70 40 30 ∶ 1 40 0． 75 0． 76
22 70 40 30 ∶ 1 20 0． 65 0． 64
23 60 40 30 ∶ 1 30 0． 70 0． 71
24 70 40 25 ∶ 1 30 0． 71 0． 72
25 70 50 30 ∶ 1 30 0． 91 0． 92
26 70 50 30 ∶ 1 30 0． 93 0． 92
27 70 50 30 ∶ 1 30 0． 90 0． 92
28 70 50 30 ∶ 1 30 0． 92 0． 92
29 70 50 30 ∶ 1 30 0． 94 0． 92
对该模型方程进行方差分析，结果见表 2。由表 2 可知，回归模型具有高度的显著性(p ＜ 0． 000 1) ，
失拟项 p = 0． 093 2 ＞ 0． 05，表明方程的拟合不足检验不显著，二次响应曲面回归方程能够很好的拟合本
试验所得的结果，自变量与响应值之间线性关系显著，该模型可以用于得率试验的理论预测。回归模型
决定系数 Ｒ 2 = 0． 956 3，表明得率的实测值和预测值间有很好的拟合度，可以较好的地描述回归方程各
因素与响应值之间的真实关系。模型的调整确定系数 Ｒ2Adj = 0． 912 6，表明大约有 91%的得率变异分布
在所研究的 4 个相关因素中，其总变异度仅有 9%不能由该模型来解释。
表 2 回归方程系数显著性检验和方差分析
Table 2 Significance test for each regression coefficient and variance analysis
变异来源
source
平方和
sum of squares
自由度
df
均方和
MS
F值
F value
p值
p value
显著性
significance
模型 model 0． 250 14 0． 018 21． 87 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X1 6． 533 × 10－3 1 6． 533 × 10－3 8． 14 0． 0128 *
X2 0． 023 1 0． 023 28． 06 0． 0001 ＊＊＊
X3 0． 018 1 0． 018 22． 93 0． 003 ＊＊
X4 0． 031 1 0． 031 38． 62 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X1X2 2． 250 × 10－4 1 2． 250 × 10－4 0． 28 0． 6049
X1X3 4． 000 × 10－4 1 4． 000 × 10－4 0． 50 0． 4919
X1X4 5． 625 × 10－3 1 5． 625 × 10－3 7． 01 0． 0192 *
X2X3 0． 022 1 0． 022 28． 02 0． 0001 ＊＊＊
X2X4 2． 250 × 10－4 1 2． 250 × 10－4 0． 28 0． 6049
X3X4 2． 025 × 10－3 1 2． 025 × 10－3 2． 52 0． 1346
X21 0． 025 1 0． 025 31． 55 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X22 0． 047 1 0． 047 58． 36 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X23 0． 080 1 0． 080 99． 98 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
X24 0． 054 1 0． 054 67． 26 ＜ 0． 0001 ＊＊＊
残差 residual 0． 011 14 8． 030 × 10－4
失拟项 lack of fit 0． 010 10 1． 024 × 10－4 4． 10 0． 0932
纯误差 pure error 0． 001 4 2． 500 × 10－4
总误差 sum 0． 26 28
第 6 期 卢圣楼，等:响应面法优化神秘果叶总三萜的超声波提取工艺 99
二次模型中回归系数的显著性检验 (见表 3)表明:因素 X1、X2、X3 和 X4 都对提取效果的线性效
应显著，因素 X21、X
2
2、X
2
3 和 X
2
4 对提取效果的曲面效应显著，X1X2、X1X3、X2X4 和 X3X4 对提取效果的交
互影响不显著，X1X4 和 X2X3 对提取效果的交互影响显著。因此各影响因子对响应值的影响不是简单
的线性关系，所以仅靠单因素试验是不能确定最佳工艺条件的，必须进行因素优化。
2． 3 神秘果叶总三萜得率的响应面分析
根据二次回归方程，建立响应面图，见图 2。由图 2 可以清楚的观察各因素对总三萜得率影响以及
各因子间两两交互作用。乙醇体积分数和超声波作用时间对神秘果叶总三萜得率影响交互作用显著，
随着乙醇体积分数的增大或者超声波作用时间的延长，总三萜的得率呈现上升趋势，但超声波作用时间
的影响更加显著。同理，提取温度和液料比对神秘果叶总三萜得率影响交互作用显著。乙醇体积分数
和液料比、液料比和超声波作用时间交互作用不显著，乙醇体积分数和提取温度、提取温度和超声波作
用时间未表现出交互作用。
图 2 不同因子对总三萜得率影响的响应面图
Fig． 2 Ｒesponse surface plot of different factors on total triterpenoids yield
2． 4 最佳条件的确定和模型的验证
通过响应面分析得到海南产神秘果总三萜提取的最优工艺条件:乙醇体积分数 71． 6 %、提取温度
54 ℃、液料比 31． 75 ∶ 1 和超声波作用时间 32． 7 min。在此条件下，神秘果叶总三萜的预测得率为
0． 94 %。为了验证回归模型的有效性，根据推断的最佳工艺参数和实际操作过程中的可行性，以乙醇
体积分数 70 %、提取温度 50 ℃、液料比 30 ∶ 1 和超声波作用时间 33 min 的条件下进行验证试验。实测
得率分别为 0． 91 %、0． 92 %、0． 91 %、0． 93 % 和 0． 92 %，测定结果稳定，偏差较小，数据重现性良好，
平均值为 0． 92 %，与预测值较接近。这充分反映该模型是合理有效的，能够为实际操作提供良好的
指导。
3 结 论
3． 1 在单因素试验的基础上，将响应面法应用于优化总三萜的超声波提取工艺条件。回归分析结果表
明，提取温度和超声波作用时间对得率的影响更加显著。总三萜得率响应方程的回归分析和验证实验
100 林 产 化 学 与 工 业 第 33 卷
表明此方法合理可行。得到神秘果叶总三萜超声波提取最佳条件为:以 1． 0 g 海南产神秘果叶为原料，
乙醇体积分数为 70 %，提取温度 50 ℃，液料比 30 ∶ 1(mL ∶ g)和超声波作用时间 33 min，实测得率为
0． 92 %，与预测值(0． 94 %)基本相符。
3． 2 采用 Box-Benhnken设计试验法对海南产神秘果叶总三萜超声提取工艺条件进行优化，不仅科学
合理，而且高效快速，为神秘果叶的综合利用提供了理论基础。
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89－96．
本 刊 信 息
《林产化学与工业》被 EI收录情况跟踪报道
《林产化学与工业》2013 年起再次被美国《工程索引( Engineering Index，EI) 》数据库收录，本刊被
EI收录对提高我国工程学科国际影响力有积极的推动作用。本刊 2013 年 1 ～ 4 期发表的论文全部被
EI收录，其中，第 4 期 28 篇学术论文收录号段为: 20134216861041 ～ 20134216861068。编辑部已于第一
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