全 文 ：海风藤 、山蒟的 RAPD鉴别研究
刘艳菊1 , 陈家春2 , 李吉莹3 , 赵刚1
(1.湖北中医学院药学院 , 湖北 武汉 430065;
2.华中科技大学同济医学院药学院 , 湖北 武汉 430033;3.湖北省制药学校 , 湖北 武汉　430071)
　　摘　要:目的　确定海风藤 、 山蒟的 DNA 扩增谱带的相似性 , 用 RAPD技术对两种药材进行分子水平的鉴
定。方法　用植物基因组 DNA 提取试剂盒提取海风藤 、 山蒟药材的总 DNA , 以随机引物进行随机扩增。结
果　从20 条随机引物中筛选出 13 条有效引物能够证明二者扩增谱带的相似性。结论　RAPD技术能快速 、 有效
地从 DNA水平上确定海风藤 、 山蒟的相似之处。
　　关键词:RAPD;海风藤;山蒟;中药鉴定
中图分类号:R284　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1000-0704 (2009)02-0057-02
　　中药海风藤为胡椒科植物风藤 Piper kadsura (Choisy)
Ohwi的干燥藤茎 , 分布于浙江 、 福建 、 广东等省。海风藤具
有祛风湿 、 通经络 、 止痹痛的功能 , 临床用于治疗风寒湿痹 、
肢节疼痛 、 筋脉拘挛与屈伸不利[ 1] 。目前有用其同属植物山蒟
Piper pube rulum (Benth.)Maxim 替代其临床药用 , 但这两种
药之间的质量标准与药理作用是否相似而可相互代替 , 还未有
科学依据。孙绍美等[ 2] 研究表明 , 在抗炎 、 镇痛与抗血小板凝
集等方面 , 海风藤的作用与山蒟相似。由于这两种药材外形相
近 , 药理作用相似 , 笔者采用 RAPD 技术从 DNA 分子水平对
海风藤 、 山蒟进行比较 , 旨在寻求其异同之处。
1　材料与方法
1.1　药材
为了使本研究更贴近实际情况 , 海风藤药材 (当年采收)
购自湖北省青山中药材公司 , 山蒟药材 (当年采收)购自福州
市中药材公司 , 并经华中科技大学同济医学院陈家春教授鉴
定。
1.2　试剂
植物基因组 DNA 提取试剂盒 (上海 Sango), dNTP (上
海 Sango), TaqDNA 聚合酶 (M gCl2 与缓冲液) (上海 San-
go), 随机引物 (上海 Sango), Marker (上海 Sango), 琼脂糖
(Amresco), 玻璃砂 (自制), 其余试剂为国产分析纯。
1.3　仪器
TGL-16G 型台式离心机 (上海安亭科学仪器厂), sy s-
tem9600型 PCR 仪 (Singapo re), DYY-4C 型电泳仪 (北京六
一仪器厂), YKH-Ⅰ型液体快速混合器 (江西医疗器械厂),
ZF-4 型 kodak 凝胶成像系统紫外透射仪 (上海顾村电光仪器
厂)。
1.4　DNA 提取
先向装有 200mg 海风藤药材粉末 (80 目)、 200mg 山蒟药
材粉末 (80 目)的 2 支 EP 管中分别加入 PCL 溶液 1000μL ,
震荡混匀 1min , 置于 65℃水浴 15min;再向每支 EP 管加入
5μLPP 溶液 , 上下颠倒混匀 3-5 次 , 置于冰上放置 15min ,
10000rpm 离心 5min;分别吸上清液到 GenClean 管中 , 各吸取
300μLPB 溶液至 GenClean 管中 , 上下颠倒混匀 2-3 次 , 室温
静置 3min , 3000rpm 离心 3min , 取下 GenClean 管 , 倒掉收集
管中废液;将 GenClean 管放回收集管中 , 各加入 500μLWash
溶液 , 8000rpm 离心 30s , 重复一次;取下 GenClean 管 , 弃去
收集管内废液 , 柱放回收集管中 , 10000rpm 离心 30s , 除残留
Wash 溶液;将柱放入新的洁净 1.5mLEP 管中 , 柱中央加入
40μLElution Buffer , 55℃放置 2min , 10000rpm 离心 1min , 离
心管中液体即基因组 DNA 。
1.5　PCR反应体系
Buffer (10×) 2.5μL , MgCl2 (20mmol/ L) 2μL , dNTP
(10mmo l/ L)0.5μL , TaqDNA 聚合酶 (5u/μL)0.3μL , 引物
0.4μmo l/ L , 模板 DNA30-60ng , 补纯水至 25μL。
1.6　循环参数
94℃预变性 3min;接着 94℃变性 1min , 41℃退火 45s ,
72℃延伸 1min , 如此进行 35 个循环;最后 72℃延伸 3min ,
4℃保存以备电泳。
1.7　基因组 DNA和 RAPD—PCR扩增产物电泳检测
用 1×TAE 电泳缓冲液配制 0.8%琼脂糖凝胶 (检测基因
组 DNA)和 1.4%琼脂糖凝胶 (检测 RAPD—PCR扩增产物),
取 10μLPCR 产物与 2μL 加样缓冲液混匀 , 于 5v/ cm 电泳
0.5h , 用 SYBR Green I染色 , 照像。
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA的提取
基因组 DNA 检测电泳结果如图 1 , 从图 1 可知 , 该方法提
取的基因组 DNA 的效果较为理想 , DNA 降解少。
图 1　总 DNA电泳图
1—山蒟;2—海风藤 M —Marker (100bp ladder)
2.2　RAPD—PCR引物的筛选
本实验从 20个随机引物中 , 筛选出 13 个有效引物 (见表
1), 获得了清晰稳定重现性好的基因组 DNA 多态性指纹图谱
·57·2009 年 2 月第 31卷第 2期Feb.2009 , Vo l.31 No.2 　　　　　　　　　　 湖北中医杂志H ubei Journal of T r aditional Chinese Medicine
图 2　8种引物对海风藤 、 山蒟样品的扩增图谱
(见图 2)。
表 1　随机引物序号及其碱基组成
随机引物序号 碱基序列 (5※3) 随机引物序号 碱基序列 (5※3)
S42
S60
S430
S79
S88
S16
S40
GGACCCAACC
ACCCGGTCAC
ACAACTGGGG
GT TGCCAGCC
TCACGTCCAC
T TTGCCCGGA
G TTGCGA TCC
S337
S427
S72
S99
S37
S43
CCT TCCCACT
CAGCCCAGAG
TGTCA TCCCC
GTCAGGGCA A
GACCGCTTG T
GTCGCCGTCA
　　从 DNA 指纹图谱可以看出 , 二者具有部分共同的谱带 ,
但又有各自的特征性谱带 , 说明两种药材在 DNA 水平上具有
一定程度的相似性。
3　讨论
鉴于海风藤 、 山蒟两种药材性状相近 , 药理作用相似 , 而
且采用 RAPD技术鉴别发现二者指纹图谱也具有一定相似性 ,
可以确定二者的质量标准相似。由于植物风藤的分布范围窄 ,
仅在福建 、 海南等地有零星分布 , 风藤资源极度匮乏。而山蒟
分布则比较广 , 在福建 、 浙江 、 江西 、 广东 、 广西及云南 、 贵
州等地均有分布 , 资源量多。既然两者质量标准相似 , 建议将
山蒟收载于下版药典中 , 增列为海风藤的植物来源。
RAPD 是由Williams 和Welsh 两个研究小组在不同实验室
同时发展起来的一项 DNA 多态检测技术。由于它具有样品用
量少 ,灵敏度高 、简便 、经济 、易于检测等优点 , 被广泛应用于遗
传图的构建 ,分子标记的寻找 ,遗传多样性的检测 , 品种间关系
的确定 ,植物系统学研究等领域中[ 3] 。同样在中药材质量标准
的建立方面发挥了重要作用 , 比如有西洋参[ 4] 、细辛[ 5]等等。
经反复实验 , 证明 RAPD分子标记技术可靠性强 , 重现性
好。该技术是一种新的建立中药材质量标准的有效方法。
参考文献:
[ 1] 　中国药典 2005一部 [ S] .2005:206-207.
[ 2] 　孙绍美 , 於兰 , 刘俭 , 等.海风藤及其代用品药理作用的比较
研究 [ J] .中草药 , 1998 , 29 (10):677-679.
[ 3] 　罗恒 , 王和勇 , 孙敏.应用 RAPD快速鉴别中药材海风藤及其
替代品 [ J] .中医药学报 , 2004 , 32 (5):33-36.
[ 4] 　王培训 , 黄丰 , 周联 , 等.商品西洋参 DNA 指纹图谱鉴别
[ J] .中药新药与临床药理 , 1999 , 10 (6):367-369.
[ 5] 　黄璐琦, 王敏 , 周长征 , 等 , ARPD 方法在细辛类药材鉴别研究
中的问题及其对策 [ J] .药学学报 , 1998 , 33 (10):778-784.
(收稿日期:2007-12-14　编辑:郑晓屏)
HPLC 法测定复方杜仲片药材浸膏中黄芩苷的含量
苏明武1 , 徐　林2 , 邓　超3 , 柳　俊3
(1.湖北中医学院药学院药物分析教研室 , 湖北 武汉 430065;2.湖北中医学院药学院 2007级硕士研究生 ,
湖北 武汉 430065;3.湖北中医学院药学院 2005级硕士研究生 , 湖北 武汉 430065)
　　摘　要:目的　建立高效液相法测定复方杜仲片药材浸膏中黄芩苷含量的方法。方法　采用十八烷基键合
硅胶为填充剂的色谱柱;甲醇-0.2%磷酸溶液 (44∶56)为流动相;流速:0.8mL/ min;柱温:30℃;检验波
长为 315nm。结果　黄芩苷在 0.29-2.9μg (r=0.9993)范围内线性关系良好;平均回收率为 96.62%, RSD
为 2.64%。结论　本方法简便 、 快速 、 准确 , 可用于测定复方杜仲片药材浸膏中黄芩苷的含量。
　　关键词:HPLC;复方杜仲片;药材浸膏;黄芩苷
　　中图分类号:R284　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1000-0704 (2009)02-0058-02
　　复方杜仲片是由杜仲(炒)、钩藤 、夏枯草 、黄芩 、益母草五味
中药材组成的纯中药制剂 ,用于治疗高血压。具有补肾平肝 , 活
血化淤之功效 , 现收载于《部颁标准》 。原质量标准中药材浸膏
没有含量测定项。目前国家要求复方制剂中的药材浸膏的制备
工艺要进一步优化 ,其质量要进一步控制。笔者拟订了本品药
材浸膏的质量标准研究方案 , 运用 HPLC 法测定了药材浸膏中
黄芩的黄芩苷含量[1-2] , 其方法准确可靠 , 合理可行 , 为本品的
药材浸膏和制剂的质量控制提供了依据。
·58· 湖北中医杂志H ubei Journal of T raditional Chinese Medicine 　　　　　　　　　　　2009 年第 31 卷第 2 期