全 文 ：第 35卷 第 1期 生 态 科 学 35(1): 130135
2016 年 1 月 Ecological Science Jan. 2016
收稿日期: 2015-01-26; 修订日期: 2015-03-06
作者简介: 吴梦纤(1990—), 女, 新疆克拉玛依人, 在读研究生学位, 从事土壤微生物研究, E-mail: wmq0915@qq.com
*通信作者: 张亚平, 女, 博士, 教授, 主要从事微生物学研究, E-mail: 510224419@qq.com
吴梦纤, 章芳, 王晓亮, 等. 新疆玛纳斯湿地土壤中真菌多样性的初步研究[J]. 生态科学, 2016, 35(1): 130135.
WU Mengxian, ZHANG Fang, WANG Xiaoliang, et al. The soil fungal diversity in Manas Wetand in Xinjiang[J]. Ecological Science,
2016, 35(1): 130135.
新疆玛纳斯湿地土壤中真菌多样性的初步研究
吴梦纤 1, 章芳 1, 王晓亮 1, 张亚平 1,*, 孙燕飞 1
石河子大学生命科学学院, 新疆, 石河子 832000
【摘要】玛纳斯湿地土壤不同土层和不同地区中可培养真菌的筛选和分子鉴定, 对土壤总 DNA 的提取后进行 PCR 扩
增后 DGGE 图谱的分析来研究真菌的多样性, 采用了 DNA 快速提取法、PCR—DGGE 技术以及 blast 序列比对分析, 得
到土壤中 11 种相似度较低的可培养真菌, 以及对不可培养真菌中 22 条不重复序列构建的系统发育树。玛纳斯湿地土
壤中真菌在不同季节数量有变化, 种类也存在一定的差异。不同样地间同一季节真菌种类不同, 同一样地不同土层间
真菌种类也不是完全相同。不可培养真菌之间的差距要比可培养真菌之间的差距大。
关键词：土壤; 真菌; DGGE
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.01.020 中图分类号：Q 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2016)01-130-06
The soil fungal diversity in Manas Wetand in Xinjiang
WU Mengxian1, ZHANG Fang1, WANG Xiaoliang1, ZHANG Yaping1,*, SUN Yanfei1
The College of Life Ccience of Shihezi University, Shihezi 832000, China
Abstract: In this paper, the fungi of different region and different soil layers in Manas Wetland were screened, and the soil fungal
diversity was studied by method of DNA fast extraction, and PCR-DGGE technology and blast sequence analysis. 11 culturable strains
and 22 unculturable strains were obtained, and similarity of 11 culturable strains was low. Phylogenetic tree of 22 unculturable strains
was built. Overall, the numbers and the variety of fungi were different among seasons; variety of fungi was different among sampling
plots in the same season, and among soil layers in the same sampling plots. The difference among unculturable strains was bigger than
culturable strains.
Key words: soil; fungus; DGGE
1 引言
土壤真菌(soil fungi)[1]可以作为生态系统健康
的指示物, 它分解有机质, 为植物提供养分, 其多
样性与土壤水分、有机质含量、植物多样性呈正相
关; 在土壤生态系统中, 真菌发挥着降解半纤维素
等、还原氮、溶解磷、防治植物病害等重要功能。
自然环境的真菌在气候变化、环境污染和人类活动
等多因素影响下, 其种类、数量、分布都发生了明
显变化。人们越来越重视对真菌多样性的研究, 而
研究一定区域内土壤真菌的多样性将有助于我们了
解该区域生态状况和有益的微生物资源。
2 研究材料与研究方法
本文主要针对玛纳斯湿地微生物生态系统中的
真菌的分布情况和类别进行研究分析。
1 期 吴梦纤, 等. 新疆玛纳斯湿地土壤中真菌多样性的初步研究 131
目前对干旱区荒漠绿洲玛河流域生态系统的微
生物多样性的系统研究, 依然处于空白阶段。玛河
流域独特的地理位置以及其特别的气候环境, 有存
在稀有微生物资源的可能, 同时也可以帮我们发现
玛河流域的微生物生态系统在维持绿洲生态平衡、
涵养水源、储藏微生物基因资源等方面的重要作用,
因此值得对其进行研究。新疆玛纳斯湿地位于玛纳
斯河流域、地处我国古尔班通古特沙漠南缘, 属于
干旱半干旱地区, 生态环境脆弱。但因为位于绿洲
经济带腹地, 所以其生态位区就显得极为重要。通
过对玛纳斯湿地微生物的研究, 能对玛河流域农业
生产和经济发展起到一定的促进作用。
真菌的分类鉴定是一项浩大的系统工程, 传统
的真菌分类学由于经常会得出假阳性或者假阴性的
结果, 为准确鉴定真菌的类别造成了一定的难度。
现代分子生物学技术中, 利用 PCR 技术扩增真菌核
糖体 ITS(Internal Transcribed Spacer)基因区段进行
真菌鉴定的方法得到了迅速的发展。
2.1 研究区概况
本研究区新疆玛纳斯河国家湿地公园规划区中
部有三大蓄水水库, 并有小型水库、鱼塘、沼泽、
芦苇滩沟通水系。样地位于亚洲大陆腹地经纬度为
43°03—46°03 N,84°48—86°42 E, 属干旱半干旱温
带大陆型气候, 干旱少雨, 日照充足, 热量丰富, 四
季分明, 冬季严寒, 春季酷热等是其主要特征。样地
的年平均气温为 6.8—7.1 , ℃ 年平均日照为 2886 h,
年平均降水量 205.7 mm, 年平均蒸发量 1648.4 mm,
相当于降水量的 4—11 倍。样地海拔约 350—650 m,
土壤类型: 灰漠土、潮土、盐土、平原林土、草甸
土、沼泽土。湿地内生长有沼泽植物、草甸植物和
盐生植物等多种植物(其中药用植物 50 多种), 生活
着大量水生、陆生动物(Ⅰ、Ⅱ级保护动约 15 种), 是
图 1 真菌 18S rDNA 及 ITS 位置示意图
Fig. 1 Position of the annealing sites of fungal 18S rDNA
and ITS primers used in this study
世界候鸟迁徙 3 号路线的重要迁徙停歇地、繁殖
地[2], 微生物资源丰富、代谢类型多样。
2.2 土样采集
本次试验于 2013 年进行采样, 由于新疆的特殊
气候导致冬季持续时间较长, 土壤冻结程度较高,
所以采集土壤时间为春季(5 月), 一共分为盐土、平
原林土、潮土、沼泽土、草甸土以及人工种植土(葡
萄园)6 个采集样点, 每个样点分别采集 1—10 cm、
11—20 cm 的土样。采集时使用对角线法, 将同一样
点同一平面土壤混合后取对角线两侧土壤, 保存。
2.3 试验方法与数据处理
2.3.1 菌种筛选
根据土壤真菌对营养需求的不同, 要采用不同
成分的培养基进行培养筛选, 通常培养真菌主要使
用马丁氏培养基(孟加拉红培养基)、马铃薯琼脂培
养基、麦芽浸汁琼脂培养、松膏培养基等等, 其中
最为常用的真菌分离和计数培养基是马丁氏培养
基和马铃薯培养基。本次试验选择培养基马铃薯培
养基和马丁氏培养基并充分培养以获得更多的种类
和数量, 同时用马丁氏培养基分离单菌落用于菌种
鉴定。
具体试验方法为: 将5 g土样于45 mL蒸馏水中
进行震荡混匀 30 min, 然后静置 10 min 后, 上清液
为 10–1 倍的土壤菌悬液, 取 1 mL 稀释至 10–2 倍, 再
取 1 mL 10–2倍菌悬液稀释至 10–3 倍, 再将制好的已
灭菌(1×105 Pa 灭菌 30 min)培养基放凉至 60℃左右,
加入链霉素。采用混板法倒板, 培养真菌, 分离培养
皿中的单菌落于马铃薯培养基中。
2.3.2 DNA 快速提取法提取真菌 DNA
将分离出的单菌落于液体马铃薯培养基中摇菌
3天后 12000 rpm离心 10 min收集菌体, 加入少量石
英砂后按 1︰1 加入 DNA 快速抽提 buffer 和酚氯仿,
摇床摇菌 1.5 h, 12000 rpm 离心 10 min 收集上清液,
加入 1/10 的 3 M 醋酸钠混匀后, 在液体中加入等体
积的异丙醇室温静置 40 min, 12000 rpm 离心 10 min,
弃上清, 使用70%乙醇洗涤后12000 rpm离心10 min,
再用 100%乙醇洗涤一次, 12000 rpm 离心 10 min 后
倒掉清液, 将EP 管于超净工作台中吹干, 确认无乙醇
残留后加入适量 TE 溶液溶解 DNA 得到 DNA 溶液。
2.3.3 PCR 扩增产物的连接转化测序
用引物 EF4、ITS4 进行 PCR 扩增得到 2000 bp
132 生 态 科 学 35 卷
左右真菌 18S DNA ITS 区扩增片段, 双酶切(hhaI/
ffa1)筛选后, 将得到的 PCR 产物纯化后进行连接转
化, 再测序鉴定种属。
本试验测序均为上海生工测序 , 使用 Excel
2013 对数据进行编辑整理, 用 Blast 进行序列比对。
2.3.4 土壤总 DNA 的提取
土壤总 DNA 的提取采用天泽基因 DNAout 试
剂盒提取。
2.3.5 PCR—DGGE
用含 GC 夹的引物 ITS1 和 ITS2 对土壤总 DNA
进行 PCR 扩增, 得到 340 bp 左右的真菌 ITS 区基因
片段进行 DGGE。对 DGGE 得到的电泳图谱进行图
像处理, 同时对较明显条带进行切胶回收后使用不
含 GC 夹的引物 ITS1 和 ITS2 再次进行 PCR, 将得
到的产物连接转化后测序。
本试验测序均为上海生工测序 , 使用 Excel
2013 对数据进行编辑整理, 用 Blast 进行比对。
3 研究结果
3.1 真菌种属鉴定
采集样地 A 点位于新户坪水库, B 点位于小海
子水库, C 点位于下桥子三村水库。
本次试验采取 6 个样地的土壤 A1-1、A1-2、A2-1、
A2-2、B2-1、B2-2、C1-1、C1-2、C2-1、C2-2、CK1、CK2,
共有 12 个土样。分别代表着 6 种不同土壤类型条件
下两个土层四个季节的真菌种群变化。通过加入不
同梯度浓度土壤悬浮液的马铃薯培养基中挑取单菌
落在马丁氏培养基中进行培养, 共分离出明显不同
的单菌落 84 株。
对 84 株真菌进行 DNA 提取后再进行 PCR, 所
得产物进行双酶切处理, 得到不同DNA条带所对应
的菌株后连接转化测序, 所得序列片段通过 NCBI
进行Blast分析, 得到 11种相似度较低的菌种, 分别
为 粗 糙 脉 孢 霉 (Neurospora crassa); 斜 卧 青 霉
(Penicillium decumbens); 青霉菌(Penicillium); 肉座
菌科 (Hypocreaceae); 金龟子绿僵菌 (Metarhizium);
枝顶孢属(Acremonium); 被孢霉属(Mortierella); 产
紫 青 霉 (Penicillium purpurogenum); 枯 萎 病 菌
(Fusarium solani); 产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum);
扩展青霉(Penicillium expansum)。[5]
用转化所得克隆体进行测序, 得到结果进行
blast 比对。
3.2 DGGE 图谱分析
通过 ITS 区通用引物 ITS1 和 ITS2 对土壤总
DNA 进行含 GC 夹的 PCR, 将得到的产物进行
DGGE 处理, 使用扫描成像仪拍摄电泳图谱。
将 DGGE 图谱使用 Quantity One 软件进行处理,
得到的处理数据导入Excel 2003, 应用Shannon指数
计算 DGGE 条带丰度, 得到的结果如表 2 所示。
Shannon—Wiener index( H)计算方法采用罗海峰等
的方法[12]。
通过对 PCR—DGGE 图谱进行条带切割后的胶
回收, 得到约 340 bp 的 DNA 片段。胶回收后进行使
用不含 GC 夹 ITS1 和 ITS2 引物的 PCR 反应得出的
PCR 产物进行连接转化测序反应, 得到的序列使用
MEGA6.0 软件进行系统发育树分析。
表 1 玛纳斯湿地春季(5 月)可培养真菌鉴定
Tab. 1 The culturable fungi identification from Manas Wetland in May
编号 对比结果 相似度 登录号
1(1) Penicillium purpurogenum strain 6—16P 18S ribosomal 99 gi444245697
2 Neurospora crassa 18S ribosomal, 99 gi238683624
5 Hypocrea nigricans strain NBRC 31289 18S ribosomal 99 gi363544790
10(1) Penicillium purpurogenum strain 6—16P 18S ribosomal 99 gi444245697
16 Penicillium sp. 6—16M 18S ribosomal RNA gene 99 gi444245696
20 Metarhizium anisopliae strain M34412 18S ribosomal 99 gi255709241
22 Fusarium solani strain 48X3—P0—P7—2 18S ribosomal 99 gi699340632
32 Penicillium chrysogenum strain 2H5—M3P2—3 18S ribosomal 99 gi699340502
36 Penicillium expansum strain SK16 18S ribosomal 99 gi309751842
37 Neurospora crassa 18S ribosomal RNA gene 99 gi238683624
71 Mortierellales sp. AGED 18S ribosomal 99 gi667489363
1 期 吴梦纤, 等. 新疆玛纳斯湿地土壤中真菌多样性的初步研究 133
表 2 玛纳斯湿地春季(5 月)不同区域土壤中真菌 DGGE 图
谱条带数和多样性
Tab. 2 DGGE band number and Shannon index of fungi
communities in soil from different area in Manas Wetland in
May
样品编号 条带数 多样性指数
A1-1 21±0.7 3.03±0.7
A1-2 28±0.2 3.29±0.6
A2-1 24±0.5 3.14±0.2
A2-2 28±0.6 3.27±0.9
B2-1 22±0.9 3.04±0.2
B2-2 22±0.2 3.06±0.7
C1-1 18±0.2 3.31±0.6
C1-2 29±0.6 2.82±0.4
C2-1 12±0.8 2.46±0.5
C2-2 15±1 2.68±0.8
CK1 28±0.9 3.29±0.2
CK2 29±0.4 3.32±0.4
图 2 玛纳斯湿地春季(5 月)土壤真菌 ITS 区 PCR—DGGE
图谱
Fig. 2 The ITS area PCR-DGGE picture of fungi on
Manas Wetland in May
4 结论
根据表 1 显示数据, 我们得到玛纳斯湿地可培
养真菌包含 11 种菌属, 其中也包含了同属不同种的
菌群。这些菌种中青霉菌属的种类远大于其他种属
菌群含量, 这说明了玛纳斯湿地由于其土壤中水含
量较高, 较适于青霉菌属生长。枯萎病菌的出现则
证明了玛纳斯湿地中植被存在枯萎病现象, 需求展
开对枯萎病的防治工作。
由图 2 显示的玛纳斯湿地 5 月份土壤根际真菌
DGGE 图谱, 向我们直观展示了玛纳斯湿地春季(新
疆春季较晚)土壤中真菌的含量。由图我们可以看出
玛纳斯湿地中葡萄田土壤(即 CK 土壤)中真菌密度
明显大于天然湿地的土壤, 而新户坪水库土壤中真
菌的含量明显高于小海子水库, 下桥子三村水库的
芦苇根际土壤中真菌含量最低, 丰度也远远不如新
户坪水库的真菌含量高。
表 2 则展示了不同区域中真菌含量和丰度的具
体特性。在这几处样地中, 每个样地的 1—10 cm 土
壤中真菌 DGGE 的条带数基本都大于 11—20 cm 土
壤中的。每个样地两个土层的土壤中真菌多样性的
指数都相似, 1—10 cm 的土壤真菌多样性指数大部
分小于 11—20 cm 土壤。
DGGE 图谱所不能直观展示的玛纳斯湿地不可
培养真菌间的亲缘关系, 在系统发育树(图 3)中得到
了体现。在图中可以看到不同样地中含有的不可培
养真菌之间存在共通性, 亲缘关系较近。
玛纳斯湿地土壤中真菌的种类较其他自然环境
土壤中真菌多一些, 但不如农田的土壤中真菌含量
多, 这说明农田土壤由于经常翻起、浇水等人为因
素可以使真菌的繁育更加容易, 同时种类也会更
多。而由于地下水资源的流通, 土壤中真菌资源得
以传播和交流。玛纳斯湿地较多的降雨量和水资源
储备, 给真菌的流通创造了便利的条件, 致使三个
水库中真菌资源有一定程度的共享。同时丰富的水
资源也为人工种植各种农作物创造了便利的条件。
本次试验中所发现的枯萎病菌的存在在一定程
度上会威胁到玛纳斯湿地农作物的生长, 希望能够
得到玛纳斯湿地地区附近农业产业的重视。
本文所写出的仅仅是玛纳斯湿地土壤真菌资源
中极少的一部分, 并不涉及落叶凋零物上的真菌。
因所使用的分离方法和培养基的不同, 分离出的真
菌种类也有很大差异。要对整个玛纳斯湿地丰富的
土壤真菌资源进行全面准确地调查和鉴定, 需要多
134 生 态 科 学 35 卷
图 3 玛纳斯湿地春季(5 月)DGGE 测序真菌系统发育树的构建
Fig. 3 The DGGE phylogenetic tree of fungi in Manas Wetland in May
种不同的取样方法、取样时间和分离方法。整个玛
纳斯湿地丰富的土壤真菌资源有待进一步调查,, 尤
其是该地区特殊的自然环境条件、人为生态环境条
件下, 植物内生真菌以及植物凋零物上丰富的真菌
多样性和生态学意义的研究, 这对新疆的“退耕还湿
地”和农垦开发将具有极其重要的意义。
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