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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):109-114
收稿日期 ：2015-06-05
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30860188）
作者简介 ：韩春梅，女，硕士，教授，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：chunmeihan224@163.com
通讯作者 ：张勤，男，博士，教授，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：qzhang@cau.edu.cn
TGF-β1 诱导马鹿茸 MSCs 软骨分化及 c-myc 基因的
表达
韩春梅1，3  王姗姗1  高庆华1，2  郑永富1  马梦婷2  张勤3
（1. 塔里木大学动物科学学院，阿拉尔 843300 ；2. 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300 ；
3. 中国农业大学动物科技学院，北京 100193）
摘 要 ： 鹿茸间充质干细胞（MSCs）是维持茸再生与骨化的重要组织，旨在研究鹿茸 MSCs 的软骨分化及原癌基因 c-myc
对该过程的调控作用。利用成年塔里木马鹿生长 60 d 的鹿茸第 2 代间充质干细胞（MSCs，P2），通过 TGF-β1（10 ng/mL 浓度）刺
激，诱导塔里木马鹿茸间充质干细胞向软骨分化，采用免疫组化和阿利新蓝染色鉴定诱导结果，并通过 qPCR 方法检测软骨分化
过程中 c-myc 基因的表达变化。结果显示，MSCs 在诱导后的第 9 天开始出现细胞形态变化，由梭形向多角形转变，原来菊花状的
分布逐渐向铺路石状变化，至 14 d 可观察到软骨陷窝，21 d 软骨细胞基质明显，并开始出现细胞凋亡。非诱导组 28 d 细胞出现凋
亡，细胞内发现空泡。35 d 两组细胞凋亡明显，细胞折光性变差，间隙变大。阿利新蓝染色鉴定，诱导至第 14 天细胞基质中开始
出现大量阳性染色。免疫组化实验检测，诱导至 21 d 的细胞基质中出现棕色 Col II 阳性反应物，随培养时间增加颜色加深，并集
中分布在细胞及其周围基质中。在软骨分化进程中，第 7、14、21 和 28 天，诱导组 c-myc 基因表达与非诱导组相比显著下调（P<0.05），
但诱导至 35 d，诱导组 c-myc 表达与非诱导组相比无显著差异（P>0.05）。在 TGF-β1 刺激下，塔里木马鹿茸 MSCs 可以分化成软骨，
原癌基因 c-myc 下调表达诱导鹿茸 MSCs 进入凋亡状态并分化为软骨细胞。
关键词 ： 马鹿茸 ；间充质干细胞 ；软骨分化 ；转化生长因子 β1 ；c-myc 基因
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.018
TGF-β1-induced Differentiation of Wapiti Antler Mesenchymal Stem
Cells to Cartilage and Expression Profile of Gene c-myc
HAN Chun-mei1，3 WANG Shan-shan1 GAO Qing-hua1，2 ZHENG Yong-fu1 MA Meng-ting2 ZHANG Qin3
（1. College of Animal Sciences，Tarim University，Alar 843300 ；2. Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science & Technology，
Xinjiang Production & Construction Group，Alar 843300 ；3. College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，
Beijing 100193）
Abstract: Antler mesenchymal stem cells（MSCs）play a pivotal role on the antler regeneration and ossification. To investigate the
chondrogenic differentiation of antler MSCs and the regulation role of the proto-oncogene c-myc in this process，the second passage cells
（MSCs，P2）of 60 d antler from adult Tarim wapiti were induced to chondrogenesis by the stimulation of transforming growth factor TGF-β1（10
ng/mL）in vitro. The inducing effects were identified by Alcian blue staining and immunohistochemics，and the expressions of gene c-myc
during this process were detected by qPCR. The results demonstrated that，on the day 9 after induction，some MSCs begun to change from
spindle-shaped to rounded or polygon，and the chrysanthemums-shaped pattern of the original MSCs gradually changed to paving stone like ；
the cartilage capsules were observed on the day 14，and the cartilage extracellular matrix was obvious and cell apoptosis appeared on the day 21.
While the cells in the control group were observed to have apoptosis on the day 28，and the cavitations were discovered in the cells. On the day
35，massive cell apoptosis of both groups were observed，and the cell refraction became weak and the gaps between cells became larger. The
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3110
鹿茸是哺乳动物唯一能够割后再生的器官，其
割后再生与快速生长类似肿瘤的特性，吸引了国内
外众多科学家的兴趣。鹿茸间充质干细胞位于茸皮
的真皮层下，是一类新的干细胞。在鹿茸不同生长
期，间充质细胞层的厚度不断变化，从生长早期到后
期即骨化期，逐渐变薄。一系列研究［1-5］发现鹿茸
的间充质细胞层（MSCs）来源于位于鹿额外脊的骨
膜干细胞，由间充质细胞分化成集落生成单位成纤
维细胞，然后分化成软骨细胞进而形成骨细胞，是
维持鹿茸的生长发育的源泉之一。在鹿茸整个生长
过程中，不断发生着这样的变化，来实现鹿茸的生
长［6，7］。但该理论的分子生物学证据国内外很少有
相关报道。
原癌基因 c-myc 对干细胞的增殖分化起着关键
的作用。对塔里木马鹿茸 c-myc 基因的研究发现，
不同生长期鹿茸不同组织中的 c-myc 基因有明显时
空表达变化［8］，说明 c-myc 基因与鹿茸的组织分化
和细胞生长密切关联。但 c-myc 在 MSCs 软骨分化
过程行使何种功能，其表达是分化的结果还是原因
均无相关报道。
转化生长因子（TGF-β1）是 MSCs 软骨分化不
可 缺 少 的 作 用 因 子［9，10］。Kocamaz 等［11］ 利 用 10
ng/μL TGF-β1 成功诱导了 20 日龄鸡的骨髓间充质干
细胞（hMSCs）向软骨分化。Christopher 等［12］用相
同 剂 量 的 TGF-β1 刺 激 山 羊 MSCs，3 周 后 RT-PCR
检测 II 型胶原蛋白（COL2）和聚集蛋白聚糖的表达
显著高于非诱导组。Mueller 等［13］在人 hMSCs 软骨
分化的研究中发现，10 ng/μL TGF-β1 及其不同配体
不但能诱导软骨形成，同时还能促使软骨肥大化。
本研究利用 10 ng/mL TGF-β1 诱导塔里木马鹿茸
MSCs 软骨分化，确定体外诱导的最佳条件 ；并在
此过程中研究 c-myc 基因的表达变化，一方面探讨
马鹿茸 MSCs 体外软骨的发育模式 ；另一方面研究
c-myc 对马鹿茸软骨分化机制的影响作用，以期为茸
MSCs 软骨分化提供分子依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 生长 60 d 的塔里木马鹿茸体外培
养第 2 代 MSCs 和软骨细胞（P2），由塔里木畜牧科
技重点实验室胚胎工程实验室提供，HeLa 细胞由华
中农业大学武军元老师提供。
1.1.2 试 剂 和 仪 器 胎 牛 血 清 FBS、 细 胞 培 养
液 DMEM、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、TGF-β1 均为
Sigma 公 司 产 品，TRIZOL（Invitrogen）；反 转 录 试
剂 盒（ThermoFisher）， 定 量 PCR 试 剂 盒（Roche），
DMSO ；CO2 加湿培养箱（MCO-15A），eppendorplex
荧光定量 PCR 仪，倒置相差显微镜（Nikon）；低温
高速离心机（Jouan）；生物显微镜（舜宇）；血细胞
计数板 ；无菌操作台等。阿利新蓝染色试剂盒，羊
Col II 一抗和免疫组化试剂盒（北京博奥）。
1.2 方法
1.2.1 诱导培养及诱导结果鉴定 选择 5 个 6 孔板，
每个孔中加入1 mL 10% FBS-DMEM，约含细胞1×105
个。设置其中 15 孔为对照组，另 15 孔为诱导组。
诱导组每孔于接种 P2 细胞后第 3 天，细胞生长至
70% 融合时，换用软骨诱导培养基，即含 10 ng/mL
TGF-β1 的 10% FBS-DMEM 及 1×10-7mol/L 地塞米松。
每 2 d 半量换液。换液时在倒置显微镜下观察拍照
记录细胞生长情况。在培养至第 7、14、21、28 和
35 天时，每个时间点分别收集 3 个孔的细胞，每孔
细胞数约为 4.5×105 个，在倒置显微镜下观察细胞
identification by Alcian blue staining revealed that heavy positive staining emerged in the cellular matrix from the day 14 after stimulating. The
detection by immunohistochemistry demonstrated that positive brown Col II reactant was in the cellular matrix from the day 21 after stimulating，
and the color became darker along with the culture time，mainly distributed in the cells and their surround matrix. In the cartilage differentiation
process from the day 7 to 28，the expressions of gene c-myc in the cells of the induced group were significantly lower than that of control group
（P<0.05），while there was no significant difference after the day 35（P>0.05）. In conclusion，Tarim wapiti antler MSCs differentiated into
cartilage under the stimulation of TGF-β1. The down-regulated expression of proto-oncogene c-myc induced the apoptosis of antler MSCs and
then differentiation to chondrogenic cells.
Key words: wapiti antler ；mesenchymal stem cells ；differentiation ；transforming growth factor β1 ；c-myc gene
2016,32(3) 111韩春梅等：TGF-β1 诱导马鹿茸MSCs 软骨分化及 c-myc 基因的表达
生长情况，用 II 型胶原蛋白免疫组化和阿尔新蓝染
色鉴定软骨诱导结果。
1.2.2 c-myc 基因的定量检测 对每个时间点收集的
细胞，用 Invitrogen 公司的 TRIZOL Reagent® RNA 提
取试剂盒方法提取 RNA，使用 ThermoFisher 公司的
反转录试剂盒合成 cDNA，1∶10 稀释后待用。根据
GenBank 数据库提供的鹿 c-myc 基因序列和内参基
因牛 GAPDH 基因序列，用 Primer 5.0 软件设计 PCR
的 引 物（ 表 1）。qPCR 反 应 条 件 为 ：95℃ 5 min ；
95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 个循环。熔解曲线程序 ：
55-95℃ ；半 定 量 PCR 反 应 条 件 ：95℃，5 min ；
95℃ 10 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min，28 个循环。
为比较 c-myc 软骨分化过程的基因表达，提
取培养至第 7 天的 P2 代软骨细胞和 HeLa 细胞的
表 1 qPCR 检测用引物
基因 引物序列（5-3） 退火温度 /℃ 扩增片段 /bp
c-myc
F ：CAAATGTGCCAGCCCAAGGTTTTC
63 130
R ：CTCTGGGATCTGGTCACGAAGAGCA
GAPDH
F ：GGTGCTGAGTATGTGGTGGA
63 180
R ：GGCATTGCTGACAATCTTGA
RNA，反转录后备用。
1.2.3 统计学处理 基因表达倍增值用 2-△△Ct 法计
算，利用 SPSS17.0 软件包对对照组和诱导组的基因
表达差异进行显著性检验，P <0.05 有统计学意义。
2 结果
2.1 诱导结果
倒置显微镜下观察 ：诱导组培养至第 9 天后开
始出现细胞形态变化。一些细胞的形态开始从梭形
变成圆形、多角形，随培养时间的延长，更多的细
胞形态发生类似变化。原本菊花状的细胞分布逐渐
向铺路石状变化。至 14 d 可观察到软骨陷窝，培养
至 21 d 软骨细胞基质明显，同时发现凋亡细胞。空
白组培养至 28 d 细胞出现凋亡，细胞内发现空泡。
35 d 两组细胞凋亡明显，凋亡细胞体积缩小，形态
近似圆形，凸起，中心呈空泡状，细胞折光性变差，
间隙变大（图 1）。
阿利新蓝染色发现，诱导至第 14 天细胞基质中
出现大量蓝色阳性染色，即聚集蛋白聚糖的软骨细
胞表面标志，随培养时间延长着色面积加大（图 2）。
免疫组化实验发现诱导至 21 d，细胞基质出现棕色
Col II 阳性反应物，随培养时间颜色加深集中分布在
细胞内及其周围基质中（图 3）。对照组细胞无相应
反应变化。
2.2 c-myc基因表达定量检测
通过 qPCR 定量检测诱导不同时间点 c-myc 基
因 的 表 达 结 果（ 图 4） 发 现， 第 14、21 和 28 天，
诱导组 c-myc 基因的相对表达量（倍增值）分别为
0.323、0.224 和 0.319， 而 对 照 组 的 分 别 为 0.574、
0.72 和 0.457，两组间差异显著（P<0.05）；但 35 d
两组间没有显著差异（P>0.05）。第 14-35 天 4 个时
间点诱导组的基因表达量与 P2 代软骨细胞中的表达
量（倍增值为 0.222）比较没有显著差异（P>0.05），
但 与 第 7 天 对 照 组 的 表 达 量 相 比 均 有 显 著 差 异
（P<0.05）。对照组中，第 7、14 和 21 天 3 个时间点
的基因表达量无显著差异（P>0.05），但显著高于第
28 和 35 天的表达量（P<0.05）。
定量 PCR 未检测到 HeLa 细胞的 c-myc 的表达
量，尽管通过半定量 PCR 结果，HeLa 细胞的内参
基因与目的基因均有表达，且表达量相似（图 5）。
3 讨论
Wang 等［13］通过在人 MSCs 软骨分化的培养基
质中添加血清和 TGF-β1 诱导剂对培养细胞凋亡的
影响实验，发现培养基中加入血清组在培养的第 7
天细胞数与细胞活力均明显下降，用 TUNEL 法染
色检测培养 21 d 的细胞，确定加血清培养组细胞凋
亡比对照组显著。而加 10 ng/mL TGF-β1 诱导剂组
则未发现 TUNEL 阳性染色细胞，认为血清培养可
诱导细胞凋亡而 TGF-β1 可阻止分化过程的细胞凋
亡。Walenda 等［14］2013 年研究了不同浓度 TGF-β1
对 hMSCs 软骨分化过程细胞增殖分化的影响，认为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3112
A B
7 d
A B
14 d
A
21 d
B
35 d
A B
28 d
A B
A ：对照组 ；B ：诱导组。黑色箭头指示的是圆形软骨细胞 ；红色箭头为细
胞基质
图 1 诱导组 MSCs 软骨分化不同时间点细胞形态变化
（100×）
A B
C D
A-D ：分别表示诱导 14、21、28 和 35 d
图 2 诱导组 MSCs 软骨分化阿利新蓝染色结果（100×）
A B
C D
A-D ：分别表示诱导 14、21、28 和 35 d
图 3 诱导组 MSCs 软骨分化免疫组化检测结果（100×）
1 ng/mL TGF-β1 不影响细胞早衰，但因为 TGF-β1 能
刺激细胞快速分裂而使细胞提早进入复制抑制。本
实验结果发现诱导组细胞衰亡（第 21 天）早于空白
组（第 28 天），这与 Walenda 的实验结果相似。但
体外培养细胞早衰与培养时间有一定关系［15］，因此，
关于马鹿茸 MSCs 的体外扩增与分化生长特性还需
进一步研究。
鹿茸 MSCs 是鹿茸软骨及骨细胞的细胞库，对
比不同生长期鹿茸间充质细胞层发现，从 30-60 d，
即生长高峰，该组织层的厚度逐渐增加，而生长高
峰过后，其厚度逐渐变薄。这一形态的变化，可证
实茸 MSCs 不断向软骨分化以维持鹿茸的快速生长。
C-myc 基因上调表达时细胞处于增殖状态，但细胞
处于分化状态时 c-myc 基因则下调表达［16］。
2016,32(3) 113韩春梅等：TGF-β1 诱导马鹿茸MSCs 软骨分化及 c-myc 基因的表达
现已证实，TGF-β1 蛋白主要通过影响其信号通
路下游基因 SMAD4/SMAD3 蛋白复合物来诱导干细
胞软骨分化。TGF-β1 蛋白促使该复合物表达加强，
刺激细胞基质分泌，诱导软骨分化调控因子 SRY-
related gene 9（sox9）的转录，以加强软骨的表面标
志 collagen II 蛋白的表达［17，18］；另一方面 TGF-β1
蛋白能够阻止该复合物与 Wnt 信号通路中 LEF/TCF
作用元件结合，抑制 c-myc 基因的激活［17，19］，表现
为分化过程 c-myc 基因的表达下调。本实验结果显
示，TGF-β1 诱导 P2 鹿茸 MSCs 的软骨分化过程中，
软骨分化的早期，空白组即非 TGF-β1 处理的间充质
细胞 c-myc 基因的表达量显著高于诱导组基因的表
达量。说明 c-myc 下调表达时鹿茸干细胞处于分化
阶段。
但 c-myc 基因下调表达也诱导细胞凋亡。该机
制可通过抑癌基因 P53 完成。P53 绑定在 c-myc 基
因启动子区，通过其组氨酸 H4 乙酰化阻止 c-myc
基因启动，诱导细胞生长停滞进而凋亡。在一些细
胞中 c-myc 介导的细胞凋亡不需要 P53 参与也能发
生［20］。该理论解释了鹿茸 MSCs 诱导组与空白组 28
d 后 c-myc 表达下调与细胞凋亡的因果关系。
C-myc 作为大多数恶性肿瘤的标志性基因，在
很多肿瘤组织中上调表达。本实验用 HeLa 细胞作
为实验材料之一，目的是比较鹿茸 MSCs 与肿瘤细
胞在 c-myc 基因表达量上的差异。当 cDNA 以 1∶10
稀释后，定量 PCR 结果未检测到 HeLa 细胞 c-myc
基因的表达值，该结果表明鹿茸 MSCs 的基因表达
量高于 HeLa 细胞。但原癌基因 c-myc 在 HeLa 细胞
中是否像其它肿瘤细胞上调表达无相关文献报道。
Liu 等［21］ 在 鼠 MSCs 软 骨 分 化 过 程， 超 表 达
Wnt11 基因，结果发现 MSCs G0/G1 细胞周期停滞 ；
聚集蛋白聚糖与 Collagen II 的表达量显著高于对照
组，同时 sox9 也大量表达。因此认为除了 TGF-β 信
号通路，非经典的 Wnt 信号也参与了 MSCs 的软骨
分化进程。
本实验以 TGF-β1 为诱导剂诱导鹿茸 MSCs 软骨
分化的过程，c-myc 基因呈下调表达。这与体内软骨
分化的结果是一致的［22-24］。但 c-myc 基因对鹿茸生
长再生的调控作用机制还需要对其信号通路做进一
步的研究。
4 结论
在 TGF-β1 刺激下，塔里木马鹿茸 MSCs 可以分
化成软骨 ；原癌基因 c-myc 下调表达诱导鹿茸 MSCs
分化 ；诱导分化软骨细胞与 MSCs 进入凋亡状态。
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0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
7 14 21 28 35 7 d 䖟僘ษޫᰦ䰤/dสഐؽ໎٬
オⲭ㓴䈡ሬ㓴
图 4 qPCR 检测 MSCs 软骨分化不同时间点 c-myc 表达量
M
500
bp
250
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M ：DNA Marker ；1，3，5，7，9 ：诱导组第 7、14、21、28 和 35 天 ；2，4，
6，8，10 ：空白组第 7、14、21、28 和 35 天 ；11 ：HeLa 细胞 cDNA
图 5 半定量 PCR 检测 MSCs 软骨分化不同时间点 c-myc
表达变化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3114
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（责任编辑 马鑫）