全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):54-59
收稿日期：2015-10-14
基金项目：天津市科技支撑计划重点项目（14ZCZDTG00025）
作者简介：范栩嘉，男，硕士研究生，研究方向：生物化工；E-mail ：gudusafa@163.com
通讯作者：乔长晟，男，博士，教授，研究方向：发酵工程；E-mail ：qiaochangsheng@tust.edu.cn
聚苹果酸生产菌株出芽短梗霉菌代谢组学样品前处理
方法的优化
范栩嘉1  边艳慧1  殷海松3，4  乔长晟1，2
（1. 天津科技大学生物工程学院  工业发酵微生物教育部重点实验室，天津  300457 ；2. 天津北洋百川生物技术有限公司，天津  300457 ； 
3. 天津现代职业技术学院生物工程学院，天津  300350 ；4. 天津市轻工业化学研究所有限公司，天津  300350）
摘 要 ： 为了得到更加准确和完整的胞内代谢物信息，从而更加真实的反映微生物胞内代谢情况，基于 GC-MS 平台，从淬
灭剂、提取剂和溶解剂 3 个方面对代谢组学样品制备过程进行了系统性的优化。对比了不同淬灭剂对胞内代谢物的渗出及细胞损
伤情况，结果表明 60% 甲醇 /0.9% NaCl 效果最佳。研究了不同提取剂、溶解剂的提取和溶解效果，结果显示 60% 甲醇提取效果显
著，吡啶溶解效果突出。最终确定了出芽短梗霉菌代谢组样品最适前处理方法 ：预冷的 60% 甲醇 /0.9% NaCl 淬灭细胞，液氮研磨
和反复冻融破碎细胞，预冷的 60% 甲醇提取，最后采用吡啶溶解提取物并采用 MSTFA 40℃衍生 90 min。采用该方法可以检测出
300 多种代谢组分，包括大量氨基酸、有机酸和糖类物质。本方法可以有效的应用于出芽短梗霉菌代谢组学样品的研究。
关键词 ： 代谢组学 ；出芽短梗霉 ；GC-MS ；样品前处理
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.009
Optimization of Sample Pretreatment Method for Metabolomics
Studies of Aureobasidium pullulans Producing Polymalic Acid
FAN Xu-jia1  BIAN Yan-hui1  YIN Hai-song3，4  QIAO Chang-sheng1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Microbiology of Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and
Technology，Tianjin 300457 ；2. Tianjin Peiyang Biotrans Biotech Co.，Ltd，Tianjin 300457 ；3. School of Biotechnology，Tianjin Modern
Vocational Technology College，Tianjin 300350 ；4. Tianjin Research Institute of Light Industrial Chemistry，Tianjin 300350）
Abstract:  In order  to acquire more accurate and complete  intracellular metabolite  information，and therefore  to more realistically 
reflect the microbial intracellular metabolism，the systematic optimization of metabolomic sample preparation process was carried out from 3 
aspects of quencher，extraction and solvent agent based on the GC-MS platform. The leakage of intracellular metabolites and cell injury with 
different quenchers was compared，and the results showed that 60% methanol/0.9% NaCl had the least leakage. The effects of extraction and 
solvent agent on relative abundance of metabolite distribution were investigated，and 60% methanol presented the significant extraction effect，
and pyridine had the dissolving effect．The optimal sample pretreatment method for metabolomic analysis of Aureobasidium pullulans was 
determined as follows ：pre-cooled 60% methanol/0.9% NaCl as quencher，ground in liquid nitrogen and repeated freezing and thawing for 
cell disruption，pre-cooled 60% methanol for the extraction of metabolites，and then the extracts were dissolved by pyridine and derivatized 
for 90 min under MSTFA at 40 ℃ . By using this optimized protocol，more than 300 kinds of metabolic components were identified by GC-
MS，including a large number of amino acids，organic acids and sugars. Thus our established method can be used to effectively analyze the A.
pullulans metabolites.
Key words:  metabolomics ；Aureobasidium pullulans ；GC-MS ；pretreatment
2016,32(6) 55范栩嘉等：聚苹果酸生产菌株出芽短梗霉菌代谢组学样品前处理方法的优化
聚苹果酸（poly malic acid，PMLA）属于聚酯类
聚合物，是一种以苹果酸为唯一单体的均聚高分子
聚合物。PMLA 具有高度的水溶性、生物可吸收性、
生物相容性、生物可降解性、可化学衍生性及无免
疫原性等优良的性能的水溶性脂肪族聚酯，是一种
具有广泛应用前景的功能高分子材料［1，2］。出芽短
梗霉相较于其他菌株合成的 PMLA 产率及分子量较
高，故被广泛选为 PMLA 生产菌株。目前普遍认为
微生物发酵积累 PMLA 是以 L-苹果酸为前体［3］。苹
果酸的生物合成途径主要有 4 种，分别为：（1）丙
酮酸途径；（2）6- 磷酸葡萄糖途径；（3）TCA 循环； 
（4）乙醛酸循环。然而对于哪一条途径是合成
PMLA 的前体物苹果酸的主要途径还没有一个明确
的定论，程若东等［4］通过添加代谢抑制剂推断出芽
短梗霉积累 PMLA 与 TCA 循环和乙醛酸途径有关。
乔长晟等［5］通过对出芽短梗霉代谢通量及关键酶活
性分析推断丙酮酸羧化途径和乙醛酸途径为 PMLA 
的主要合成途径。
代谢物组学（metabolomics/metabonomics）是一
种通过定性定量测定生物体代谢产物及种类的变化，
分析系列关联代谢物的综合差异，从而发现生物系
统对基因以及环境变化响应的研究方法。它是伴随
基因组学和蛋白质组学的兴起而逐渐发展起来的又
一门主要组学，完善了组学研究系统。通过在转录 
组、代谢组和蛋白组水平上整体分析环境干扰或基
因，可以更全面地了解并分析某一生物或细胞全面
而复杂系统的生理生化结构和机理［6，7］。目前，代
谢组学分析技术主要采用 3 种分析方法［8，9］：基于
核磁共振的分析方法［10］；基于质谱的分析方法，通
常情况下与色谱联用，如 GC-MS、LC-MS、CE-MS
等［11］；基于光谱的方法，如傅立叶变换红外光谱、
拉曼光谱等［12，13］。其中，GC-MS 技术因其有完整
的标准图库，代谢物谱图可检索性较强，定性鉴定
方便等优点，从而备受国内外代谢组学研究人员的
青睐并被广泛应用与代谢组学的研究中。
微生物代谢物组学需要高效可靠的样品前处理，
这样才能够确保胞内代谢物分析的准确性［14，15］。由
于实验菌株间具有差异性，若未进行条件优化直接
使用文献报道方法进行处理，难免会对实验结果产
生影响。为确保所用实验样品真实反映细胞的特定
代谢特征，研究合理有效的细胞内代谢物的提取分
离方法就显得尤为重要。目前常用的方法有，使用
冷甲醇和冷乙醇等有机溶剂，瞬间停止细胞的代谢，
再进一步用预冷的有机溶剂提取代谢物［16，17］。本研
究着重对比分析了细胞淬灭剂、提取溶剂和溶解剂
对出芽短梗霉胞内代谢物的影响。从细胞淬灭、代
谢物提取和代谢物溶解 3 个方面，对出芽短梗霉代
谢物组学样品前处理方法进行优化，为准确分析出
芽短梗霉代谢物组学奠定基础。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  菌种  出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans 
CGMCC3337 和 Aureobasidium pullulans TKPM10017，
天津科技大学生化工程研究室保藏。
1.1.2  主要试剂  甲氧基铵盐酸盐（色谱纯）与吡
啶（色谱纯）；N-甲基 -N-（三甲基硅烷）三氟乙酰
胺（色谱纯），购自 SIGMA 化学有限公司。色谱纯
乙腈、甲醇、乙醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、氯仿。
实验用水为 Milli-Q 超纯水。
1.1.3  仪器与设备  GC/MS 气相色谱 - 质谱联用
仪，配有 7683 自动进样器与 6980 气相色谱仪（GC，
Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）。Milli-Q 
Advantage A10 超 纯 水 制 备 系 统（ 美 国 Millipore 
公司）。
1.2  方法
1.2.1  不同淬灭方法比较　取对数生长期后期的发
酵液，离心（7 000 r/min，5 min，4℃），弃上清液。
然后用 4℃的 0.9% 生理盐水洗菌体两次。分别取 5 
mL 不同淬灭液［（1）100％甲醇（-40℃）；（2）60%
甲 醇（-40℃）；（3）60% 乙 醇（-40℃）；（4）60%
甲醇 /0.9% 氯化钠（-40℃）］，快速加入装有沉淀的
离心管中，用涡旋震荡器快速混匀，离心（10 000 
r/min，5 min，-4℃），将上清液置于 -80℃ 保存直到
分析，标记为胞外样本。将淬灭后的细胞液氮研磨 
20 min，至细粉状，称取 50 mg 于 1.5 mL 离心管中
用于小分子代谢物的提取，每个取样点取 3 个平行，
液氮研磨后的样品加入 1 mL 预冷的提取溶剂（70％
的冷甲醇）反复冻融法提取，将上清液置于 -80℃ 
保存直到分析，标记为胞内样本。萃取液中加入 10 
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.656
μL 1 mg/mL的d4-丁二酸作为内标。萃取液冷冻干燥，
储存在 -20℃直到 GC-MS 分析。每个灭活方法做 3
个重复。
1.2.2  细胞完整性的测定  淬灭处理后的细胞沉淀
重悬浮于 4 mL 1% PBS 缓冲液（8 g/L NaCl，0.2 g/L 
KCl，1.44 g/L Na2HPO4和 0.24 g/L KH2PO4），置于冰上。
通过检测 OD600 减少值评估细胞的裂解情况。OD回
收率计算公式如下：
η=
OD600，Recovered
OD600，Original
×100%
其中 OD600，Recovered 为淬灭后菌体重悬浮的吸光度；
OD600，Original 为未经淬灭菌体重悬浮的吸光度。
1.2.3  灭活过程中代谢物渗出实验  取 10 mL 菌体
处于指数生长期的发酵液（OD620 约为 9.0），10 000 
r/min，5 min，4℃离心得到菌体再使用 0.9% 氯化钠
润洗细胞一次。将菌体重悬在 2 mL 不同灭活剂中，
6 000 r/min，10 min，-4℃离心得到上清。将水洗后
的细胞重悬在 0.9% 和 2.3% NaCl 中离心得到的上清
作为阴性对照样品，将水洗后的细胞重悬在热 0.9% 
NaCl（70℃，30 min）中离心得到的上清作为阳性
对照样品。测定上述方法得到的上清在 260 nm 和
280 nm 的吸光度，分别代表胞内核酸和蛋白质的渗
出量。同时测定了灭活后水洗液中的代谢物。 
1.2.4  细胞破碎和胞内小分子提取  取对数生长期
后期的发酵液，离心（7 000 r/min，5 min，4℃），
弃上清液。然后用 4℃ 的 0.9% 生理盐水洗菌体两
次。向清洗后的细胞中加入 60% 甲醇 /0.9% 氯化钠
（-40℃），用涡旋震荡器快速混匀，离心（10 000 r/min，
5 min，-4℃），-80℃保存备用。将淬灭后的细胞液
氮研磨 20 min，至细粉状，称取 50 mg 于 1.5 mL 离
心管中用于小分子代谢物的提取，每个取样点取 3 
个平行，液氮研磨后的样品加入 1 mL 预冷的不同提
取溶剂［（1）100% 甲醇；（2）60% 乙醇；（3）60%
甲醇；（4）甲醇 / 氯仿（1∶1，V/V）］反复冻融法提 
取，将上清液置于 -80℃保存直到分析，标记为胞
内样本。萃取液中加入 10 μL，1 mg/mL 的 d4-丁二
酸作为内标。萃取液冷冻干燥，储存在 -20℃直到
GC-MS 分析。每个提取方法做 3个重复。
1.2.5  不同溶解剂的比较  将冷冻干燥后的样品，
加 50 μL 甲氧基铵盐酸盐 / 不同溶解剂溶液（吡啶、
乙腈、四氢呋喃、二甲基甲酰胺）（20 mg/mL），充
分溶解样品，置于 40℃水浴中，反应 90 min ；（2）
加 80 μL N-甲基 -N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺，混
合均匀，置于 40℃水浴中，反应 90 min ；（3）将衍
生后的样品 10 000 r/min 离心 5 min ；取上清液 100 
μL 加入进样瓶中，并编号，于室温放置 2 h，准备
进行 GC-MS 检测。
1.2.6  GC/MS 检测  GC 条件［18］：Agilent HP5 30 m 
×0.25 mm×0.25 μm 毛 细 管 柱；进 样 口 温 度：
280℃，升温程序：初始温度 70℃保持 2 min，以
5℃/min 程序升温至 290℃保持 5 min ；载气：高纯
氦气，恒压模式 91 kPa，流速 1 mL/min ；进样量 1 
μL ；柱后分流比 10∶1。
MS 条件［18］：接口温度：280℃；电离方式：
EI ；电离方式：电子轰击电离（EI+）；离子源温度：
250℃；电子轰击能量：70 eV ；电子电流：40 μA ；
扫描质量范围：50-800 m/z。
1.2.7  数据处理  将 GC/MS 数据导入 MSD 增强型
化学工作站，提取离子峰并用 NIST08 数据库进行比
对进行定性，通过将所有的离子峰与内标物质的峰
面积相比使数据归一化，再对数据进行中心化后导
入 SIMCA 软件进行 PCA 分析［19，20］。
2 结果
2.1  不同溶解剂对代谢物溶解效率的影响
出芽短梗霉胞内物质种类繁多，其中主要有氨
基酸类，有机酸类，糖类等。因此，分析比较了 4
种不同的溶解剂吡啶、乙腈、四氢呋喃、二甲基甲
酰胺对标准品溶液的溶解效果。运用 GC-MS 分析衍
生后不同溶解剂溶解后的标品，比较不同溶解剂溶
解后样品的出峰个数和峰面积。结果如图 1 所示，
不同溶解剂溶解后样品的出峰个数和峰面积有不同
程度的差异，其中四氢呋喃和乙腈效果相对较差，
其他两组效果较好，但二甲基二酰胺溶剂延迟较吡
啶长，同时据文献报道吡啶能溶解大部分非极性和
极性的化合物［21］，因此在代谢组学文献中吡啶被广
泛用于提取剂，综合以上原因选择吡啶为本实验的
提取剂。
2016,32(6) 57范栩嘉等：聚苹果酸生产菌株出芽短梗霉菌代谢组学样品前处理方法的优化
2.2  不同的灭活剂对细胞灭活效率的影响
测定不同灭活溶液上清液中核酸和蛋白质的渗
出情况，核酸和蛋白质分别在 260 nm 和 280 nm 处
有特征吸收峰。此外，还测定了灭活后在水洗过程
中代谢物的渗出情况。
图 2 为不同淬灭剂条件下核酸和蛋白质的渗漏
情况，以间接反映代谢物的渗出情况。从图中可以
看出，100% 甲醇作为淬灭剂时蛋白质的渗出情况
相对比较严重，证明其不适合作为淬灭剂使用；而
采用其他 3组淬灭剂使蛋白质的渗出得到大幅改善。
其中甲醇和氯化钠组灭活后吸光度最低，表明代谢
物渗出最少。同时利用监控淬灭处理后细胞 OD 值
的减少来反映整体细胞水平的细胞损伤，OD 回收率
越大表明细胞受到的损伤越小。由图 3 可知，60%
甲醇 /0.9% 氯化钠（-40℃）OD 回收率最大，结果
表明低浓度的甲醇相对于高浓度的甲醇可以减轻细
胞的损伤，同时加入盐溶液可以明显减轻细胞的 
损伤。
综合上述两个实验结果表明使用有机溶剂对细
胞灭活过程中有代谢物渗出，其原因可能是冷有机
溶剂对细胞壁的冷冲击作用对细胞壁有一定的破坏
性，同时有机溶剂可以在一定程度上改变细胞膜的
流动性，使得胞内代谢物渗出胞外。60％甲醇 /0.9% 
NaCl 组相对于其他组分淬灭处理后的 OD 回收率最
大，细胞完整性最好，并且代谢物渗出最少。综上
所述，选择 60%甲醇 /0.9% NaCl 为淬灭剂。
60
50
40
30
20
10
0
R
es
po
nd
R
at
io
R
es
po
nd
R
at
io
35
30
25
20
15
10
5
0
Ci
tric
ac
id
As
pa
rag
ine
Al
an
ine
Gl
yin
e
Va
lin
e
Le
uc
ine
Ls
ole
uc
ine
Su
cci
nic
Fu
nm
ari
c
Pro
lin
e
Me
thi
on
ine
Se
rin
e
Th
roe
nin
e
Ph
en
yla
lan
ine
As
pa
rag
ine
Ly
sin
e
Cy
ste
ine
Gl
uta
mi
ne
Gl
uta
mi
ne
Gl
uc
ose
Ma
nn
ito
l
Try
po
top
ha
n
Hi
sti
din
e
Ty
ros
ine
Pyrimidine
N,N-Dimethylformamide
Acteonitrile
Tetrahydrofuran
Pyrimidine
N,N-Dimethylformamide
Acteonitrile
Tetrahydrofuran
A
B
图 1 不同溶解剂对各种代谢物峰面积的影响
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
A
bs
or
ba
nc
e
Me
tha
no
l
40
%E
tha
no
l
60
%M
eth
an
ol
60
%M
eth
an
ol/
0.9
%NH 4 2CO 3
60
%M
eth
an
ol/
0.9
%N
aC
l
Co
ld
Na
Cl
OD260
OD280
Me
tha
no
l
40
%E
tha
no
l
60
%M
eth
an
ol
60
%M
eth
an
ol/
0.9
%NH 4 2CO 3
60
%M
eth
an
ol/
0.9
%N
aC
l
η%
100
80
60
40
20
0
图 2 不同淬灭剂条件下胞内核酸和蛋白质的渗出分析
图 3 不同淬灭方法处理后的 OD 回收率
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.658
2.3  不同提取剂对代谢物提取效率的影响
在已鉴定代谢物中随机选出部分氨基酸、有机
酸、糖类等物质进行比较分析，结果（图 4）显示，
70％甲醇和甲醇 / 氯仿（1∶1）两组提取效果较好，
但由于氯仿具有一定的毒性，因此选择 70％甲醇为
提取剂。
2.4  方法重复性的考察
平行制备出样本 4 份，分别进行 GC-MS 检测。
结果（表 1）显示，对 4 个平行样品进行相对定量
计算后发现不同物质的相对含量的相对标准偏差
（RSD）值均小于 15％，因此该方法适用于代谢组学
样品的检测和进一步分析。
3 讨论
出芽短梗霉作为聚苹果酸和普鲁兰多糖的生产
菌株，传统的发酵优化手段已经无法满足现代工业
的要求，对菌株的定向改造进一步提高产物产量降
低副产物的产出的要求日益迫切。代谢组学作为一
种系统的研究手段，在目的产物相关代谢物轮廓分
析，代谢物合成途径的发现中具有无与伦比的优势。
近年来，对于微生物代谢组学的研究飞速发展，但
尚无出芽短梗霉代谢组学研究方法的文献报道，而
现存的代谢物组学研究方法中没有一种可以满足所
有微生物的研究。所以本研究对出芽短梗霉代谢物
样品制备过程进行了系统优化。
预冷的有机溶剂在接触细胞的瞬间就可以使细
胞失去活性，很好的满足了代谢组样品制备快速灭
活的要求，但是有机溶剂对于细胞膜的破坏和对细
胞渗透压的冲击使得胞内小分子代谢物容易渗出胞
外，从而影响实验结果的准确性。本研究比较了 4
种不同的灭活剂，结果发现在有机溶剂中加入适合
浓度的盐溶液可以很好的减少胞内代谢物的渗出，
60% 甲醇 /0.9% NaCl 组代谢物渗出最少并且灭活后
细胞完整性最好，最终选择 60%甲醇 /0.9% NaCl 为
淬灭剂。代谢物组数据分析过程中，需要定性和定
量尽可能多的物质来全面的描述代谢途径、代谢调
节及描述机制。由于代谢物在不同的提取溶剂中的
提取效率不同，本研究比较了 4 种提取溶剂的提取
效率，结果发现用 70%甲醇提取的胞内的代谢物质
最全面，而且提取含量最高。
4 结论
本研究以出芽短梗霉的代谢组为研究对象，比
R
es
po
nd
R
ar
io
R
es
po
nd
R
ar
io
120
100
80
60
40
20
0
Gl
uc
ose
Th
reo
ine
Ma
lto
s
Pro
lin
e
Le
uc
ine
Va
lin
e
Iso
leu
cin
e
Gl
uta
mi
ne
Se
rin
e
Fru
cto
se
Ty
ros
ine
Ri
bo
se
Xy
lito
l
Ino
sit
ol
Ar
ba
ito
l
Cl
uc
ini
c
As
pa
rag
ine
pu
ruv
ic
2-p
ho
sph
og
lyc
eri
de
suc
cin
ic
Ma
nn
ose
Ly
sin
e
Al
an
ine
Ma
nn
ito
l
lac
tic
fru
ma
ric
ma
lic
Gl
yin
e
As
pa
rtic
Ph
en
yla
lan
ine
gly
cer
ate
-3-
ph
osp
ha
te
ace
tyl
ph
osp
ha
te
8
6
4
2
0
60%Methanol
Methanol/Chloroform
60%Ethanol
100%Methanol
60%Methanol
Methanol/Chloroform
60%Ethanol
100%Methanol
A
B
图 4 不同提取方法处理得到的胞内代谢物水平
表 1 各种代谢物的重复性检测
物质名称 相对标准偏差 /% 物质名称 相对标准偏差 /%
Glycine 4.5235 Glucose 2.1536
Leucine 9.2483 Fructose 14.5213
Methionine 7.0215 Mannose 9.8125
Alanine 7.8132 Sorbitol 13.9116
Histidine 10.153 Glycerol 7.9794
Tryptophan 8.7921 Carnine 11.4432
Threonine 8.1345 Malic acid 8.1635
Isoleucine 12.1055 Pyruvic acid 6.1563
Proline 4.3210 Succinic acid 9.0154
Valine 6.1565 Citric acid 4.1563
Lysine 13.1562 Malonic acid 5.1563
Phenylalanine 5.1531
2016,32(6) 59范栩嘉等：聚苹果酸生产菌株出芽短梗霉菌代谢组学样品前处理方法的优化
较了不同淬灭剂，提取剂和溶解剂条件下代谢物组
的分析结果，最终确定了出芽短梗霉代谢物样品制
备的最适方法：采用 60%甲醇 /0.9% NaCl 溶液淬灭、
乙腈∶甲醇∶水（2∶2∶1）提取胞内代谢物、含
有甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液溶解冻干样品、最后
使用 N-甲基 -N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺对样品
进行衍生化。采用本方法从出芽短梗霉中共检测到
300 多种代谢物，经鉴定包括大量的氨基酸有机酸
和糖类物质。
参 考 文 献
［1］Ding H, Portilla-Arias J, Patil R, et al. The optimization of polymalic 
acid peptide copolymers  for  endosomolytic drug delivery［J］. 
Biomaterials, 2011, 32（22）：5269-5278. 
［2］Ding H, Klibanov AM.  Inhibition  of  brain  tumor  growth  by 
intravenous poly（β-L-malic  acid）nanobioconjugate with pH-
dependent drug release［J］. Proceedings of the National Academy 
of Sciences, 2010, 107（42）：18143-18148. 
［3］Schmidt A, Windisch C, Holler E. Nuclear  accumulation  and 
homeostasis  of  the unusual polymer β-poly（L-malate）in plas 
modia of Physarum polycephalu［J］. European Journal of Cell 
Biology, 1996, 70（4）：373-380.
［4］程若东 , 王浩 , 周华 , 等 . 出芽短梗霉积累聚苹果酸途径及调控
研究［J］. 化工学报 , 2012, 63（11）：3639-3644. 
［5］乔长晟 , 郑志达 , 孟迪 , 等 . 出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的代
谢通量及关键酶活性分析［J］. 现代食品科技 , 2014, 7（7）：
74-80. 
［6］King RD, Whelan KE,  Jones  FM,  et  al.  Functional  genomic 
hypothesis generation and experimentation by a robot scientist［J］. 
Nature, 2004, 427（6971）：247-252. 
［7］Kitano H. Systems biology ：A brief overview［J］. Science, 2002, 
295（5560）：1662-1664. 
［8］Dunn WB, Broadhurst DI, Atherton HJ, et al. Systems level studies 
of mammalian metabolomes ：the roles of mass spectrometry and 
nuclear magnetic  resonance spectroscopy［J］. Chem Soc Rev, 
2011, 40（1）：387-426. 
［9］彭超 , 黄和 , 肖爱华 , 等 . 代谢组学分析技术平台及方法研究进
展［J］. 食品科技 , 2008（9）：220-223. 
［10］Girjesh G. Metabonomics ：A new  frontier of nuclear magnetic 
resonance（NMR）［J］. National Academy Science Letters, 
2004, 27 ：289-299. 
［11］Detterm K, Aronov PA, Hammock BD. Mass spectrometry-based 
metabolomics［J］. Mass Spectrometry Review, 2007, 26（1）：
51-78.
［12］Lasch  P,  Boese M,  Pacifico A,  et  al.  FT-IR  spectroscopic 
investigations  of  single  cells  on  the  sub  cellular  level［J］. 
Vibrational Spectroscopy, 2002, 28（1）：147-157. 
［13］Jürgen S, Michael B, Angelika B, et al.  Identification of scrapie 
infection  from  blood  serum  by  Fourier  transforms  infrared 
spectroscopy［J］. Analytical Chemistry, 2002, 74（15）：3865-
3868. 
［14］Somerville GA,  Proctor RA. At  the  crossroads  of  bacterial 
metabolism and virulence factor synthesis  in staphylococci［J］. 
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2009, 73（2）：233-
248. 
［15］Bolten CJ, Kiefer P, Letisse F, et al. Sampling for metabolome analy 
amino acid analysis in five phylogenetically different yeasts［J］. 
Analytical Chemistry, 2007, 79（10）：3843-3849.
［16］Villas-Bôas SG, Højer-Pedersen  J, Åkesson M,  et  al. Global 
metabolite analysis of yeast ：evaluation of  sample preparation 
methods［J］. Yeast, 2005, 22（14）：1155-1169. 
［17］Maharjan RP, Ferenci T. Global metabolite analysis ：the influence 
of extraction methodology on metabolome profiles of Escherichia
coli［J］. Analytical Biochemistry, 2003, 313（1）：145-154. 
［18］Bo T, Liu M, Zhong C, et al. Metabolomic analysis of antimicrobial 
metabolomics  of  epsilon-Poly-L-lysine  on Saccharomyces
cerevisiae［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 
62（19）：4454-4465. 
［19］Fiehn  O. Metabolomics- the  link  between  genotypes  and 
phenotypes［J］. Plant Molecular Biology, 2002, 48（1-2）：155-
171. 
［20］阿基业 . 代谢组学数据处理方法——主成分分析［J］. 中国
临床药理学与治疗学 , 2010（5）：481-489. 
［21］李晓雪 , 田锡炜 , 王永红 , 等 . 拟干酪乳杆菌胞内代谢产物的
GC—MS 分析方法的建立［J］. 食品工业科技 , 2013（18）：
169-173. 
（责任编辑  李楠）