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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):168-173
水稻稻瘟病是由真菌稻瘟病菌 Magnaporthe
oryzae（无性世代为 Pyicularia oryzae）引起的水稻
灾害性病害，病害重的年份可造成减产 40%-50%，
甚至颗粒无收［1］。目前全世界水稻平均年总产量
达到 7.2 亿 t［2］，超过 30 亿以上的人口以稻米为主
要粮食［3］，而中国水稻的年产量约 2 亿 t，达到世
收稿日期：2015-11-04
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201203014），湖南省“十二五”重点学科（0904）
作者简介：管玲莉，女，硕士研究生，研究方向：微生物资源利用；E-mail ：978210965@qq.com
通讯作者：刘二明，男，博士研究生，研究方向：植物与病原物互作及作物抗病性遗传多样性利用；E-mail ：ermingliu@163.com
一株拮抗稻瘟病菌细菌的筛选与鉴定
管玲莉1，2 任佐华1，2 李俊俊1 刘二明1，2
（1. 湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128 ；2. 植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室 南方粮油作物协同创新中心，
长沙 410128）
摘 要 ： 生防微生物是一种具有开发创新和环境友好的防控稻瘟病策略，旨在发掘高效生防微生物资源。于 2014 年从湖南
桃江山区一季稻感病品种湘早籼 24 号的感稻瘟病稻丛的健康稻株中分离出 817 株菌株，采用平板对峙法，筛选出 1 株对稻瘟病菌
具有高效抑制作用的拮抗细菌 JN005，通过菌丝生长速率法测定其活体菌代谢产物对稻瘟病菌的抑菌率高达 84% ；并对另外 5 种
植物病原真菌、4 种植物病原细菌和大肠杆菌及金黄色葡萄球菌等 11 种菌作了抑菌谱测定。结果表明，JN005 菌株对禾谷镰刀菌、
水稻稻曲病菌有较好的抑制作用，其抑制率分别为 70.1% 和 73.6%。通过形态学观察、生理生化测定及 16S rDNA 序列系统发育分析，
将 JN005 菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
关键词 ： 水稻 ；稻瘟病菌 ；拮抗细菌 ；分离 ；鉴定
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.024
Isolation and Identification of an Antagonistic Bacterial Strain Against
Rice Blast Fungus
GUAN Ling-li1，2 REN Zuo-hua1，2 LI Jun-jun1 LIU Er-ming1，2
（1. College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128 ；2. Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and
Control of Plant Diseases and Insect Pests，Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China，
Changsha 410128）
Abstract: It is quite important to develop novel and environment-safe strategies to control rice blast caused by Magnaporthe oryzae，
and screening effective microorganism resources is primary basis for the bio-control of blast. Total 817 strains were isolated from healthy ones
among diseased rice plants of the susceptible cultivar Xiangzaoxian 24，a single-season cropping rice，in the mountainous area of Taojiang，
Hunan，in 2014. One strain JN005 with efficient antagonism to M. oryzae among 817 strains was screened by the plate confrontation method.
The inhibition rate of metabolite from active bacterium to the rice blast reached 84% by measuring the growth rate of mycelium of the blast
fungus. Further，antimicrobial spectrum of JN005 against 5 plant pathogenic fungi，4 plant pathogenic bacteria，and also Escherichia coli and
Staphylococcus aureus sub. sp. aureus，was tested. The result revealed that JN005 also presented high inhibitory effect to Fusarium graminearum
and Ustilaginoidea virens，and the inhibition rates to two fungi were 70.1% and 73.6%，respectively. Based on analysis of the morphological，
physiological，and biochemical characteristics and the 16S rDNA phylogeny，strain JN005 was identified as Bacillus subtilis.
Key words: rice ；Magnaporthe oryzae ；antagonistic bacteria ；isolation ；identification
2016,32(6) 169管玲莉等：一株拮抗稻瘟病菌细菌的筛选与鉴定
界稻谷总产量的 28.6%，位居世界第一［2］。防治稻
瘟病的主要手段是化学农药防治，但由于抗瘟水稻
品种的单一性、稻瘟病菌生理小种的复杂多变及用
药不合理导致的病菌抗药性，各药剂田间防效不断
降低，与此同时还给生态环境和人类健康带来了不
可忽视的严重危害［4］。生防微生物有许多优于化
学防治的优点，如对人畜和天敌安全、与环境相容
性好、活体生物建立种群后对有害生物可达到长
期较稳定的防控作用［5］并减缓病原菌抗药性的产
生。生防细菌的研究与应用已经开展多年，国内外
研究者报道了众多可以应用于植物病害防治的不同
的细菌菌株。目前报道研究应用较多的植物病害生
防微生物主要包括放线菌、真菌、细菌中的假单胞
菌（Pseudomomnas）及芽胞杆菌（Bacillus）等，其
中芽胞杆菌（Bacillus）是目前植物病害生防细菌研
究中报道较多的一类［6］。芽胞杆菌防治植物病害的
重要机制之一是其菌体及代谢产物可以引起寄主植
物产生诱导抗病性，其另一重要优势是能够产生多
种抗菌素和抗菌活性酶，具有很好的抗菌活性。目
前生物防治研究存在着急需开发新的、高效的生防
产品，提高生防制剂的有效性、实用性，降低生产、
运输与应用成本等问题［7］。因此，从自然环境中分
离获得稻瘟病菌的拮抗菌株对水稻的防病增产及粮
食安全问题具有重要意义。
本研究从湖南桃江山区一季稻感病品种湘早籼
24 号的感稻瘟病稻丛的健康稻株中筛选出一株对稻
瘟病菌具有较好抑制作用的拮抗细菌 JN005，对其
进行形态学、生理生化特性及 16S rDNA 序列系统发
育分析鉴定，并进行代谢产物拮抗作用测定，旨在
为生防菌在稻瘟病防治的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
作物病原真菌 6 种，即稻瘟病菌（Pyricularia
oryzae）、 水 稻 纹 枯 病 菌（Rhizoctonia solani）、 稻
曲 病 菌（Ustilaginoidea virens）、 水 稻 恶 苗 病 菌
（Fusarium moniliforme）、小麦赤霉病菌（无性为禾
谷镰刀菌 Fusarium graminearum）和辣椒炭疽病菌
（Colletotrichum gloeosporioides）；作物病原细菌 4 种，
即水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、
烟草青枯病菌（R. solanacarum）、柑橘溃疡病菌
（Xanthomonas campestris pv. citri）和马铃薯环腐病菌
（Clavibactermichiganense subsp. sepedonicum）；大肠杆
菌（Escherichia coli）、 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus subsp. aureus）。这 12 种菌均由湖南农业大学
植物病理研究室提供。
供试培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（NA）、牛
肉膏蛋白胨培养液（NB）、燕麦片培养基、PDA 培
养基、需氧测定培养基、糖氧化发酵培养基、淀粉
水解培养基、硝酸盐还原培养基、V.P 培养基、明
胶液化培养基、石蕊牛奶培养基，均按方中达及陈
捷［8，9］的方法配制。
1.2 方法
1.2.1 样品采集 样品的采集地点位于湖南省桃
江县大栗港镇牌形上村（N28°3149.02″，E111°54
24.86″）。采样即从感稻瘟病的稻丛中选出未患病的
健康稻株，于 4℃冰箱保存备用。
1.2.2 拮抗菌株的分离纯化及筛选 将样品剪成长
为 4-6 mm 小段于灭过菌的研钵中研磨捣碎，加入
10 mL 无菌水，静置 30 min 后，梯度（10-1-10-7）稀释，
每个梯度取 0.2 mL 菌液涂布于 NA 平板上，每浓度
涂平皿 1个，重复 3次，置于 28℃ 恒温培养箱中倒
置培养。待平板内长出单菌落后，挑取不同形态的
单菌落于新的平板上划线纯化。采用平板对峙法［10］
测定待筛选的菌株对稻瘟病菌的拮抗作用，即在
PDA平板中央接种 1块稻瘟病菌菌饼（直径 5 mm），
待筛选菌株划线接种于菌饼两侧，27℃倒置培养，
以只接种稻瘟病菌菌饼的 PDA平板为对照，每处理
3 次重复。待对照菌落接近长满平板时，观察实验
平皿中有无抑菌带，留取抑菌带明显的平皿并测量
抑菌带的宽度。
1.2.3 JN005 菌株的分类鉴定
1.2.3.1 菌株形态观察及生理生化特性测定 参照
东秀珠等［11-13］方法进行。
1.2.3.2 16S rDNA 片段的扩增、序列分析及系统发
育分析 采用细菌基因组提取试剂盒（上海生工生
物有限公司）抽提 JN005 菌株全基因组 DNA，用通
用引物 27F（5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3）和
1492R（5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3）扩增。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6170
PCR 扩增条件：95℃预变性 2.5 min ；94℃变性 30 s，
55℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，35 个循环；72℃
延伸 10 min。扩增产物送上海生工生物有限公司进
行测序，测序结果在 GenBank 上进行 BLAST。采用
Mega5 对 JN005 菌株进行系统发育树构建。
1.2.4 JN005 菌株抑菌谱测定 JN005 菌株对各病原
细菌的拮抗作用采用纸碟法［14］测定；对各病原真
菌的拮抗作用采用平板对峙法［10］测定。
1.2.5 JN005 菌株代谢产物拮抗作用测定 JN005 菌
株接种于 NB 中，在 30℃ 200 r/min 条件下发酵培
养 96 h，发酵液 10 000 r/min 离心 15 min，取上清
液再经 0.22 μm 细菌过滤器过滤得到代谢产物。在
加有 JN005 菌株代谢产物的 PDA 平板（V代谢产物∶
VPDA 培养基 = 1∶4）中央接种稻瘟病菌菌饼（直径
5 mm），27℃ 倒置培养，以不加代谢产物并接种稻
瘟病菌菌饼（直径 5 mm）的 PDA 平板为对照，每
处理 3 次重复。待对照皿中菌落接近长满平板时，
采用菌丝生长速率法［15］计算抑菌率。
纯生长量（mm）=菌落平均直径 -菌饼直径
抑菌率（%）=［（对照菌落纯生长量 - 处理菌
落纯生长量）/ 对照纯生长量］×100%
2 结果
2.1 稻瘟病菌拮抗菌株的分离
本实验从样品中共分离获得 817 个细菌菌株，
其中有 26 个菌株对供试稻瘟病菌有拮抗作用，占总
分离菌数的 3.18%，拮抗效果明显的（抑菌带宽度
超过 7 mm）有 7个菌株，其中 JN005 菌株抑菌带宽
度达到 15.32 mm（图 1）。
2.2 JN005菌株分类鉴定
2.2.1 形态特征鉴定 JN005 菌株在 NA 培养基上
28℃倒置培养 48 h 后，菌落形态不规则，边缘隆起，
中间凹陷，粗糙不透明，表面干燥，污白色或微黄
色。JN005 菌体呈杆状，鞭毛周生，无荚膜，大小
为（0.7-0.8）μm ×（2-3）μm（图 2），芽孢椭圆
到柱状位于菌体中央或稍偏，长 0.5-1.0 μm，最适
生长温度 28-30℃，革兰氏染色为阳性，参照东秀
珠等《常见细菌系统鉴定手册》和布坎南等《伯杰
氏细菌系统鉴定手册》, 可鉴定 JN005 菌株为芽孢杆
菌属。
A B
A ：拮抗菌抑制生长的菌落；B：正常菌落
图 1 JN005 菌株对稻瘟病菌菌丝生长抑制效果
图 2 JN005 菌株扫描电镜照片
2.2.2 生理生化特征鉴定 JN005 菌株对接触酶（24
h）、V.P 反应等 22 项生理生化指标鉴定结果见表 1。
根据 JN005 菌株的生理生化特征，并结合扫描电镜
照片和菌落形态特征，参照《常见细菌系统鉴定手册》
和《伯杰氏细菌系统鉴定手册》，将 JN005 菌株鉴定
为枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌。
表 1 JN005 菌株的主要生理生化特征
实验 结果 实验 结果
接触酶 + 柠檬酸盐 +
V.P 试验 + 硫化氢实验 -
产气 + 甲基红实验 -
明胶 - 苯丙氨酸脱氢酶 -
水解淀粉 + 酪蛋白水解 -
产生吲哚 - 硝酸盐还原 -
厌氧生长 - 亚硝酸盐还原 +
7% NaCl + 10% NaCl +
5℃生长 - 10℃生长 -
30℃生长 + 40℃生长 +
50℃生长 + 55℃生长 -
注 ：“+”阳性；“-”阴性
2016,32(6) 171管玲莉等：一株拮抗稻瘟病菌细菌的筛选与鉴定
2.2.3 JN005 菌株的分子生物学鉴定 经测序，
JN005 菌株的 16S rDNA 序列全长为 1 601 bp（图
3），BLAST 结果表明，JN005 菌株与枯草芽孢杆菌
（Bacillus subtilis）的同源性最高，相似性为 100%。
用 N-J 法计算 JN005 菌株的 16S rDNA 全序列遗传距
离，并根据遗传距离得到系统发育树。结果（图 4）
显示，JN005 菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
处于一个大的分支内，遗传距离最近，结合形态学
及生理生化特征对 JN005 菌株的鉴定结果为枯草芽
孢杆菌。
2.3 JN005菌株的抑菌谱
JN005 菌株除了对稻瘟病菌抑菌效果突出外，
对供试的另外 12 种病原菌也有不同程度的拮抗作
用（表 2）。其中 JN005 菌株对稻瘟病菌、稻曲病菌、
禾谷镰刀菌及辣椒炭疽病菌的抑菌率大于 60%，拮
抗效果较好；对金黄色葡萄球菌、柑橘溃疡病菌、
纹枯病菌、马铃薯环腐病菌、白叶枯病菌、大肠杆
菌具有一定的拮抗作用；但对水稻恶苗病菌、烟草
青枯病菌没有拮抗作用。
2.4 JN005菌株代谢产物拮抗作用
JN005 菌株代谢产物对供试稻瘟病菌具有较好
的拮抗作用，含有代谢产物的 PDA平板上的稻瘟病
菌菌落生长较对照组明显被抑制，其中对照组稻瘟
病菌菌落平均直径达 68 mm，实验组稻瘟病菌菌落
平均直径仅为 8 mm（图 5），抑菌率高达 84%。
3 讨论
本研究从感稻瘟病稻丛的健康稻株中分离出
817 株细菌菌株，结合平板对峙法及代谢产物的菌
丝生长速率法筛选出一株对稻瘟病菌具有较好抑制
Marker CK JN005
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 3 JN005 菌株 16S rDNA PCR 产物的电泳结果
JN005 KU302780
Bacillus subtilis EU660358
Bacillus subtilis GQ280099
Bacillus siralis NR028709
Bacillus thuringiensis EF206345
Bacillus subtilis JX860846
Bacillus gibsoni AY737309
Rhizobium mongolense GU645016
Streptomyces albofaciens NR024760 100100
100
99
76
100
0.01
图 4 JN005 菌株的系统发育树
表 2 JN005 菌株对病原菌的拮抗作用
病原菌 抑菌率 /% 病原菌 抑菌率 /%
稻瘟病菌（Pyricularia oryzae） 84.0 水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani） 9.8
稻曲病菌（Ustilaginoidea virens） 73.6 水稻恶苗菌（Fusarium moniliforme） /
禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum） 70.1 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides） 62.5
水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae） 28.6 烟草青枯菌（R. solanacarum） /
柑橘溃疡病菌（Xanthomonas campestris pv. citri） 15.1 马铃薯环腐病菌（Clavibactermichiganense subsp. sepedonicum） 11.0
大肠杆菌（Escherichia coli） 21.2 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus sub. sp. aureus） 29.7
注 ：“/”无抑菌作用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6172
作用的拮抗细菌 JN005，通过生理生化测定及 16S
rDNA 分子序列分析将其鉴定为枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力，又
是自然界中广泛存在的动植物和土壤等环境中内外
生细菌，对人畜无害，不污染环境；其自身没有致
病性，只具有单层细胞外膜，能直接将许多蛋白分
泌到培养基中；在营养缺乏的条件下，产生多种大
分子的水解酶和抗生素，诱导自身的能动性和趋势
化恢复生长，并且具有生长快、营养简单、能产生
耐热、抗逆芽孢等突出特征，有利于生防菌剂的生
产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，加
之批量生产工艺简单，成本较低，施用方便，储存
期长，是一种理想的生防微生物。国内外先后开发
出多种芽孢杆菌生防制剂应用于多种病害的生物防
治，取得了良好的效果［16］。如美国已有 4株枯草芽
孢杆菌生防菌株获得环保局（EPA）商品化或有限
商品化生产应用许可，它们分别是 GB03、MBI600、
QST713 和解淀粉枯草芽孢杆菌变种（B. subtils var.
amyloliquefaciens FZB24）［17］；我国利用枯草芽孢杆
菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，
现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、
麦丰宁、纹曲宁等［18］。此外，枯草芽孢杆菌还是防
控稻瘟病菌的理想生物防治菌，Filippi 等［19］从水稻
根际土壤分离到 148 株细菌，促生能力筛选实验结
果显示 18 株细菌对稻苗有显著促生作用。进一步对
这些菌株对稻痕病菌的离体抑菌活性及温室盆栽防
效进行测定，获得对稻叶痕防效最高的菌株 rizo-46
和 rizo-55，防效最高可达 90%-95%。Shan 等［20］从
原始森林土壤中分离得到一株甲基营养塑枯草芽胞
杆菌 Bacillus methylotrophicus BC79c 离体抑菌实验结
果显示该菌株能抑制许多植物病原真菌菌丝生长和
孢子萌发。温室实验表明，BC79 发酵液对稻瘟病具
有 89.87% 的防效。经 TLC 与 HPLC 分析鉴定，其
主要抑菌活性物质为 Phenaminomethylacetic acid。而
本研究发现 JN005 菌株具有较强的拮抗水稻稻瘟病
菌活性，其代谢产物对水稻稻瘟病菌的抑菌率高达
84%，是稻瘟病生防菌的重要资源。
后续尚需对 JN005 菌株工业化最佳发酵条件优
化、剂型筛选、田间防治效果评价及作用机理等方
面进行研究。
4 结论
本实验共筛选出 7 个对稻瘟病菌拮抗效果明显
的菌株，其中编号为 JN005 的菌株对稻瘟病菌的抑
制作用最为突出，并且对稻曲病菌、禾谷镰刀菌及
辣椒炭疽病菌也有较好的抑制效果。综合对 JN005
的形态特征、生理生化特征及 16S rDNA 测序分析，
将其定名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。结果表
明，该菌无论是菌株活体还是发酵液都都能明显抑
制稻瘟病菌的菌丝生长。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）