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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):66-72
启动子是基因 5 端与 RNA 酶及一些反式作用
因子结合的区域，是指 RNA 聚合酶识别、结合和开
始转录的一段 DNA 序列。生物能够根据自身的需要
及环境的改变，定时、定位及定量地表达所需的基
因产物，在这个过程中，作为调控元件之一的启动
子发挥了重要的作用［1］。通常基因的表达模式由其
收稿日期 ：2016-02-06
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260334），甘肃省自然科学基金资助项目（1308RJZA205），甘肃省农科院创新专项（2013GAAS16），
甘肃省油菜工程技术研究中心项目（1306NTGA022）
作者简介 ：董云，男，博士，副研究员，研究方向 ：油菜育种 ；E-mail ：dongyungs@163.com
通讯作者 ：徐妙云，女，博士，研究方向 ：植物开花时间和种子发育调控机制 ；E-mail ：xumiaoyun76@163.com
王磊，男，博士，研究方向 ：玉米抗逆与生殖发育调控、玉米基因工程 ；E-mail ：caaswlwl@163.com
油菜（Brassica napus）Bna-miR1140 基因启动子
miR1140Pro 的克隆与表达模式研究
董云1  王毅1  靳丰蔚1  孙万仓2  刘自刚2  方彦2  徐妙云3  王磊3
（1. 甘肃省农科院院作物研究所，兰州 730070 ；2. 甘肃省油菜工程技术研究中心，兰州 730070 ；3. 中国农科院生物技术研究所，
北京 100081）
摘 要 ： 旨在研究 Bna-miR1140的表达模式及其调控机理，依据本实验室前期的油菜 miRNA芯片实验结果，从油菜栽培种
Westar中克隆了 Bna-miR1140前体序列上游 1.5 kb的片段，并进行了顺式作用元件分析，然后构建了 GUS报告基因植物表达载体，
通过农杆菌介导法将 miR1140 pro∷GUS转化到甘蓝型油菜Westar品种中，经 PCR法鉴定获得 5株阳性株。对阳性株油菜 T1代
各组织的 GUS化学染色分析表明，miR1140前体序列上游 1.5 kb区域具有启动子的功能，能够驱动 GUS在油菜中表达，并且 GUS
基因仅在叶柄及叶腋中特异性表达，说明油菜 miR1140Pro为特异性启动子。
关键词 ： 油菜；Bna-miR1140 ；启动子；表达模式
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.010
Cloning of Bna-miR1140 Gene Promoter in Rape and Preliminary
Identification of Its Expression Pattern
DONG Yun1 WANG Yi1 JIN Feng-wei1 SUN Wan-cang2 LIU Zi-gang2 FANG Yan2
XU Miao-yun3 WANG Lei3
（1. Crop Research Institute，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070 ；2. Rapeseed Engineering Technology Research Center
of Gansu，Lanzhou 730070 ；3. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: In order to explore the expression pattern and regulation mechanism of Bna-miR1140，the upstream 1.5 kb fragment from
Bna-miR1140 precursor was cloned in a cultivated variety Westar of rape by PCR approach on the basis of rapeseed miRNAs chip results in
our laboratory，and their cis-acting elements were analyzed. Then plant expression vector of GUS reporter genes was constructed，the vector
miR1140 pro∷GUS was transformed into variety Westar by Agrobacterium-mediated approach，and 5 positive transgenic lines were obtained.
GUS chemically staining the varied tissues of T1 generation groups of positive rape strains，the results showed that the upstream 1.5 kb region of
miR1140 precursor sequence presented the function of promoter，driving GUS expression in rapeseed，moreover，only specific expression in
the petiole and leaf axil，indicating that miR1140Pro was a specific promoter.
Key words: rapeseed ；Bna-miR1140 ；promoter ；expression pattern
2016,32(7) 67董云等：油菜（Brassica napus）Bna-miR1140 基因启动子miR1140Pro 的克隆与表达模式初探
上游启动子所决定，在基因启动子区通常存在不同
的顺式或反式作用元件，克隆基因启动子序列并对
其中的转录因子结合位点进行分析是了解基因转录
表达模式及其调控机制的关键。
miRNAs 是一类在进化上保守的长约 21 nt 的
非编码单链 RNA，在生物体生长发育过程、抗生
物或者非生物胁迫中起着非常重要的作用，在基
因表达调控的网络中处于核心位置［2，3］，有效地
抑制其靶基因编码的蛋白质的合成，或以其他调节
机制来抑制靶基因的表达。近年来，关于克隆、分
析植物 miRNA 启动子的报道较多，如毛果杨 ptr-
MIR156a［4］、草莓 miR390［5］、番茄 Sly-miR167a［6］，
此外，Han 等［7］利用生物信息学对大豆降解组文
库 miRNA 的启动子进行了分析。前人研究结果表
明 Bna-miR1140 基因是芸薹属特异 miRNA［8］，并通
过降解组测序分析得到 Bna-miR1140 的靶基因为一
种糖基转移酶（glycosyltransferase）和响应调节因子
（Arabidopsis response regulator ARR8-like protein）［9］，
而关于 Bna-miR1140 功能的研究鲜见报道。miRNA
自 身 的 转 录 调 控 是 miRNA 在 整 个 调 控 网 络 中 第
一 步， 也 是 非 常 重 要 的 一 步。 本 文 为 研 究 Bna-
miR1140 的表达模式及其调控机理，依据本实验室
前期的油菜 miRNA 芯片实验结果，利用 plantCARE
软件对 Bna-miR1140 上游 1.5 kb 的序列进行生物信
息学分析，找到 TATA-box，G-box 等启动子的关键
元件，然后设计引物从油菜基因组 DNA 中扩增出
该 1.5 kb 片段并构建了 miR1140 pro∷GUS 植物表
达载体，转化油菜，获得转基因株系，GUS 染色分
析 Bna-miR1140 的表达特异性，旨在为进一步揭示
Bna-miR1140 基因的时空表达和功能作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 油菜品种 甘蓝型油菜（Brassica napus L.）
栽培种 westar。
1.1.2 菌株和载体 根癌农杆菌 LBA4404、植物表
达载体 pPZP212 均由中国农业科学院生物技术研
究所提供。克隆载体 pEASY-T1 Cloning Vector（10
ng/μL）和大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞
Trans 1-T1 购自北京全式金生物公司。
1.1.3 酶、试剂盒和主要的化学试剂 Taq DNA 聚
合酶购自北京泽星生物公司 ；各种限制性内切酶购
自 NEB 公司 ；Go3S 柱离心式 PCR 产物回收试剂盒
V3.1 K141 购自申能博彩生物科技公司 ；Trizol 购自
上海生物工程有限公司 ；IPTG、X-gal、T4 DNA 连
接酶购自 Promege 公司。普通的化学药品均为国产
分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 油 菜 Bna-miR1140 基 因 启 动 子 的 扩 增 根
据本实验室前期的油菜 miRNA 芯片实验结果，对
Bna-miR1140 上 游 1.5 kb 的 序 列 设 计 引 物， 上 游
引 物 5 端 添 加 Hind III 酶 切 位 点， 下 游 引 物 5
端 添 加 Xba Ⅰ 酶 切 位 点 ；引 物 序 列 编 号 为 Bna-
miR1140ProFw、Bna-miR1140ProRv；测序引物 NOS70
按照植物表达载体 pPZP212 中 NOS 终止子序列设
计 ；鉴 定 引 物 Bna-miR1140ProFw1 和 gusRv 按 照
miR1140 pro∷GUS 构 建 上 的 miR1140 pro 序 列 和
GUS 基因序列设计。引物由上海生物工程有限公司
合成，序列详见表 1。以 CTAB 法从油菜幼苗中提取
的 DNA 为模板，PCR 扩增 1 351 bp 的 Bna-miR1140
基 因 启 动 子 片 段。PCR 反 应 体 系 ：Taq（2 U/mL）
0.5 mL，10×Taq reaction buffer 2.0 mL，dNTP mix
（10 mmol/L each）0.5 mL，Bna-miR1140ProFw（10
mmol/L）0.5 mL，Bna-miR1140Pro Rv（10 mmol/L）0.5
mL，油菜 DNA 1.0 mL，dH2O 15 mL。PCR 反应条件：
94℃预变性 4 min ；94℃变性 40 s，53℃退火 40 s，
72℃延伸 40 s，共 35 个循环 ；72℃延伸 10 min。
表 1 引物序列
引物 序列（5-3）
Bna-miR1140ProFw AAGCTTCTCTCTTAAGGGTC
Bna-miR1140ProRv TCTAGAACACAGAGAGACTT
NOS70 CCGGCAACAGGATTCAATCTTA
Bna-miR1140ProFw1 CATCATCTCTCAAATCCCTC
gusRv TAGAGCATTACGCTGCGATG
1.2.2 油 菜 Bna-miR1140 基 因 启 动 子 表 达 载 体
构 建 依 据 载 体 pEASY-T1 Cloning Vector 使 用 说
明 进 行 T 连 接 反 应， 反 应 结 束 后 转 化 大 肠 杆 菌
Trans1-T1。通过蓝白斑筛选得到的单克隆经 PCR 和
双酶切鉴定后送北京中科希林生物公司用引物 M13
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.768
+ 和 M13-进 行 双 向 测 序 验 证。 利 用 plantCARE 在
线 软 件（http://bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/
plantcare/html/）对启动子序列的顺式作用元件进行
在线分析，找到 TATA-box，G-box 等启动子的关键
元件。用限制性内切酶 Hind III 和 Xba I 对 pPZP212
质粒和测序正确的 Bna-miR1140Pro-pEASY-T1 质粒
进行双酶切，凝胶电泳切胶回收 1 351 bp 和 11 124
bp 的 DNA 片段，胶回收后的 Bna-miR1140Pro 片段
和 pPZP212 载体片段用 T4 DNA 连接酶连接，然后
转化大肠杆菌感受态 Trans1-T1，再 PCR 和酶切鉴
定阳性重组子 Bna-miR1140Pro-Ppzp212，对鉴定正
确的阳性重组子摇菌后送北京中科希林生物公司用
引物 Bna-miR1140ProFw 和 NOS70 进行双向测序验
证。测序验证正确的阳性重组子 Bna-miR1140Pro-
Ppzp212（以下简写为 miR1140 pro∷GUS）电击转
化农杆菌 LBA4404。
1.2.3 油菜的转化及阳性植株鉴定 按照 Prem L
Bhalla 和 Mohan B Singh 的 方 法［10］（ 略 有 改 变 ），
通过农杆菌介导浸染油菜子叶柄法转化油菜。经
Kanamycin 不同梯度培养筛选到的生根壮苗炼苗移栽
后， 用 CTAB 法 提 取 其 DNA， 以 miRProFw1/gusRv
和 miRProFw/gusRv 两对鉴定引物分别进行 PCR 扩
增，1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出 1 905 bp 和
622 bp 条带的为阳性株，PCR 阳性对照模板为质粒
miR1140 pro∷GUS ；阴性对照为未经转化的油菜基
因组 DNA。
1.2.4 转 miR1140 pro∷GUS 油菜 T1 代阳性株组织
化学染色 收集经 PCR 鉴定为阳性的转 miR1140
pro∷GUS 油菜 T1 代植株各组织器官，分别放入 1.5
mL EP 管中，加适量配制好的 GUS 染色缓冲液（浸
没材料为宜），于 37℃温育 8-10 h，检查 X-gluc 的
着色情况，并用 75%-95% 梯度浓度的乙醇由先低
浓度再高浓度的顺序室温脱色，直至叶片呈透明无
色，最后用无菌水清洗 2 次，在体式显微镜下观察
着色情况。
2 结果
2.1 油菜Bna-miR1140启动子片段的扩增
以 提 取 和 纯 化 的 油 菜 DNA 作 为 模 板，Bna-
miR1140ProFw 为 正 向 引 物，Bna-miR1140ProRv 为
反 向 引 物 进 行 PCR 扩 增 Bna-miR1140 启 动 子 序
列， 片 段 长 1 351 bp 左 右（ 图 1-A）。PCR 产 物 与
pEASY-T1 Cloning Vector 连 接 后， 利 用 引 物 Bna-
miR1140ProFw/Bna-miR1140ProRv、 酶 Xba I/Hind III
分别对质粒 Bna-miR1140Pro-pEASY-T1 进行 PCR 和
双酶切鉴定，结果（图 1-B、1-C）显示质粒 PCR
条带和酶切条带大小均与理论大小一致，说明 Bna-
miR1140 启动子序列 PCR 产物成功连接到克隆载
体。引物 M13 +和 M13-对Bna-miR1140Pro-pEASY-T1
双向测序，用软件 Vector NT I9.0 将序列拼接，序
列 长 1 351 bp。 利 用 plantCARE 在 线 软 件（http://
bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）
对启动子序列的顺式作用元件进行在线分析，结果
（表 2）显示，该启动子含有与转录必需的 RNA 聚
合酶结合的 TATA 盒（TATA-box），以及在调控基因
转录效率中发挥重要作用的 CAAT 盒（CAAT-box）。
另外序列中包含了其他 2 种顺式作用元件 ：参与水
杨酸应答的 TCA 元件（TCA-element）和参与细胞周
N M 1
1000 1351
A 2 N M
1351
bp
1000
bpbp bp
600
B
1351
bp
C
A ：Bna-miR1140ProFw/Bna-miR1140ProRv 扩 增 油 菜 基 因 组 DNA ；B ：Bna-
miR1140ProFw/Bna-miR1140ProRv 扩 增 Bna-miR1140Pro-pEASY - T1 质 粒
DNA ；C ：Xba I/Hind III 双酶切 Bna-miR1140Pro-pEASY-T1 产生的片段。1 ：
以油菜基因组 DNA 为模板 ；2 ：以 Bna-miR1140Pro-pEASY - T1 质粒 DNA 为
模板 ；M ：DNA Marker ；N ：以 H2O 为模板
图 1 油菜 Bna-miR1140 启动子的克隆及酶切鉴定
2016,32(7) 69董云等：油菜（Brassica napus）Bna-miR1140 基因启动子miR1140Pro 的克隆与表达模式初探
期调控的元件（MSA-like），还含有一些光响应和赤
霉素响应的元件。
2.2 油菜Bna-miR1140启动子植物表达载体的构建
及农杆菌转化
用 Hind III/Xba I 分别双酶切植物表达载体质粒
pPZP212 和测序验证正确的克隆质粒 miR1140Pro-
pEASY-T1， 切 胶 回 收 目 的 片 段（ 图 2-A 和 2-B），
并 连 接。 先 用 引 物 Bna-miR1140ProFw 和 Bna-
miR1140ProRv 进行 PCR 扩增，再用酶 EcoR I/Hind
III、Xba I/Nco I、Xho I/Nco I 等 3 对酶分别进行双酶
切，酶切结果见图 2-C、2-D、2-E。EcoR I/Hind III
双酶切产生的片段大小为 3 510 bp，Xba I/Nco I 双酶
切产生的片段大小 2 335 bp，Xho I/Nco I 双酶切产
生的两个片段大小分别为 1 399 bp 和 193 bp，3 次
酶切片段大小符合理论值。PCR 和酶切均鉴定为阳
性的重组子 miR1140pro∷GUS 经测序验证获得最终
的植物表达载体 Bna-miR1140Pro-Ppzp212。将质粒
miR1140pro∷GUS 转化农杆菌 LBA4404 感受态细胞，
用鉴定表达载体构建的方法筛选到了阳性克隆。
2.3 miR1140 pro∷GUS转化油菜及T0代阳性株的
获得
转化了植物表达载体 miR1140pro∷GUS 的农杆
菌 LBA4404（OD650nm=0.5）悬浮液共计浸染 300 个
具有 2 mm 叶柄的油菜子叶，在恢复培养后，进行
了愈伤组织诱导，总共诱导出愈伤 295 个，出愈率
98%。选取无褐化、无污染的培养皿中的愈伤 250 个，
在低浓度 25 mg/L kanamycin 抗性的芽诱导培养基中
生长，诱导出芽 67 个，芽诱导率 27%。挑取生长
健壮、无污染和无褐化的 54 个发生芽继续在低浓度
25 mg/L kanamycin 抗性的芽生长培养基中生长 4 周，
然后转移至高浓度 50 mg/L kanamycin 抗性的筛选培
养基中生长 4 周，筛选出绿苗数 10 个，白化苗 21 个，
表 2 应用 PlantCARE 在线预测的油菜 Bna-miR1140 启动子区的顺式调控作用元件及功能
位点名称 位置 信号序列 位点功能
TCCC-motif -88 TCTCCCT 光响应元件的一部分
TCA-element -42 CAGAAAAGGA 参与水杨酸响应的顺式作用元件
P-box -771、-465 GCCTTTTGAGT、CCTTTTG 赤霉素响应元件
MSA-like -197 TCCAACGGT 参与细胞周期调控的顺式作用元件
MRE -211 AACCTAA 参与光响应的 MYB 结合位点
MBS -192 CGGTCA MYB 结合位点
GATA-motif -305 AAGATAAGATT 光响应元件的一部分
GARE-motif -799、-679、-647、-525、-493 AAACAGA 赤霉素响应元件
GAG-motif -440 AGAGAGT 光响应元件的一部分
CCAAT-box -195 CAACGG MYBHv1 结合位点
CAAT-box -1013、-831、-554、-58 CCAAT、CAAT、CAAAT 启动子和增强子区域普通顺式作用元件
TATA-box -1320、-824、-102 TAATA、TATA、TATAAAT 转录起始® 30 核心启动子元件
11124
bp
A B C
1351
bp
D E
2335
bp
1399
bp
193
3510
bp
A ：pPZP212 酶切后胶回收片段 ；B ：miR1140Pro-pEASY-T1 酶切后胶回收
的 Bna-miR1140 启动子片段 ；C ：EcoR I/Hind III 双酶切 miR1140pro∷GUS
片段 ；D ：Xba I/Nco I 双酶切 miR1140pro∷GUS 片段 ；E ：Xho I/Nco I 双酶
切 miR1140pro∷GUS 片段
图 2 油菜 Bna-miR1140 启动子植物表达载体构建及酶切
鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.770
坏死和污染的苗 23 个。将所有绿苗转接到生根培养
基上，一月后发生根的苗数为 7 株，出根率为 70%。
通过高浓度 50 mg/L kanamycin 抗性筛选后，初步确
定 7 株呈阳性。
以抗性筛选为阳性的转化 miR1140pro∷GUS 的
T0 代油菜苗基因组 DAN 为模板，利用 miRProFw1/
gusRv 和 miRProFw/gusRv 两对引物分别对这些 DNA
进行 PCR 扩增，WT 作为阴性对照，大肠杆菌质粒
miR1140pro∷GUS 作为阳性对照。琼脂糖凝胶电泳
检测后（图 3），两对引物的 PCR 扩增鉴定阳性结果
一致，并且分别扩增出的片段大小与阳性对照相同，
条带大小分别为 1 905 bp、622 bp。通过 kanamycin
抗性筛选和 PCR 鉴定，最后确定转 Bna-miR1140 启
动子的油菜 T0 代阳性苗共 5 株。
517
bp
M N P 1 2 3 4 5 6 7A
2000
bp
1 2 3 4 5 6 7 N P MB
A ：miRProFw1/gusRv 扩增目的条带 ；B ：miRProFw/gusRv 扩增目的条带 ；M ：
DNA Marker ；N ：阴性对照 ；P ：阳性对照 ；1-7 ：miR1140 Pro∷GUS 转化
油菜 T0 株系
图 3 转化 miR1140 Pro∷GUS 油菜 T0 代阳性株 PCR 鉴定
2.4 转miR1140 Pro∷GUS油菜T1代阳性株组织化
学染色鉴定
由于构建的 miR1140 pro∷GUS 植物表达载体中
带有 miR1140 pro 驱动的报告基因 GUS，所以可以
通过对转 Bna-miR1140 启动子的 T1 代油菜的 5 个株
系中的阳性株进行各组织 GUS 染色，观察 GUS 基
因的表达，以野生型油菜和转空载体 pPZP212 的油
菜作为对照。染色结果（图 4）表明，在转 miR1140
pro∷GUS 的 T1 代阳性株油菜中，GUS 基因未在根、
叶、花中表达，仅在油菜的叶柄和芽分生组织中表
A B C
D
1 2
F
G
1 2 3 4 5
A-F ：分别为根、叶、花、带叶柄的叶、叶柄、芽分生组织。其中，E 中的
1 是 WT，2 是 miR1140 pro∷GUS 油菜叶柄 ；G 中 1 和 2 分别为 pPZP212 和
WT ；3-5 是 miR1140 pro∷GUS
图 4 转 miR1140 pro∷GUS 油菜 T1 代阳性株组织化学
染色
达， 由 此 说 明 Bna-miR1140 的 表 达 模 式 为 特 异 性
表达。
3 讨论
通常功能基因的表达模式由其上游启动子所决
定，在基因启动子区一般存在不同的顺式或反式作
用元件。在植物体内，不同的转录因子与这些元件
结合从而调控基因表达量的升高或降低。microRNA
作为近年来发现的一类新的调控型小分子 RNA 备
受人们关注，并且在生物体生长发育过程中起着重
要的作用。目前，人们将 microRNA 的研究着力于
其加工成熟过程以及其生物学功能上，并取得重要
的成果，关于 miRNA 的转录和启动子功能的研究报
道也较多。RNA 聚合酶 II 和 III 均可以参与 miRNA
的转录［11，12］，作为聚合酶 II 基因的一个重要特征，
启动子有着非常重要的作用。Lee 等［13］首次通过实
验发现人体来源的 miR23a 是由 RNA 聚合酶 II 转录
而来，他们发现其前体转录物具有 RNA 聚合酶 II 转
录产物的特征，即 5 端具有帽子结构，而 3 端具有
PolyA 结构。Kasschaukd 等［14］也研究发现许多 pri-
miRNA 含有 5 帽子和 3 poly（A）尾巴结构，而这
是由 RNA 聚合酶 II 转录的 mRNA 的典型特征，之
2016,32(7) 71董云等：油菜（Brassica napus）Bna-miR1140 基因启动子miR1140Pro 的克隆与表达模式初探
后 Xie 等［15］发现在其研究的 miRNA 的前体上游序
列中普遍存在着 TATA-box，这预示着这些序列可能
具有启动子活性。
miRNA 特异的表达模式可能取决于其上游启
动子的调控，而且，miRNA 启动子的调控模式与
功能基因启动子类似，能够指导 miRNA 在植物特
定发育时期，特定组织中发挥重要调控作用［16］。
克隆 miRNA 前体上游的序列，通过连接报告基因
gus，转化拟南芥等植物后进行 GUS 组织化学分析
和 GUS 活性的测定，可以分析启动子不同的调控模
式及其 miRNA 的功能。Sunkar 等［17］在研究拟南芥
中 miR398 参与植物抗氧化胁迫的分子机理时，将
miR398b 基因上游 2 kb 的序列与 gus 报告基因相连
并转化拟南芥。GUS 染色结果显示，miR398b 基因
的上游序列能够驱动 gus 基因在拟南芥的轮座叶，
茎和花药中表达。此外，该研究小组还发现，经
过 Cu 和 Fe 离子处理后，转基因植株的 GUS 着色
明显变浅，这与 miR398b 响应氧化胁迫处理下调是
完 全 吻 合 的。Robert 等［18］ 将 miR159a 和 miR159b
茎环结构上游序列与 gus 报告基因连接构建表达载
体并转化拟南芥，对转基因拟南芥的染色结果表
明，miR159a 和 miR159b 的启动子驱动的 gus 基因
具有相似的表达模式，且与其靶基因的表达模式也
非常相似。miR398a 已证明可以参与植物抵抗氧化
胁迫过程，miR398a 在拟南芥中过表达可以提高拟
南芥对病原菌的抗性，由其表达模式推测它可能参
与了某些物质的运输［17］。Wang 等［19］研究了拟南
芥中 miR160 与根尖形成的相互关系，在实验中将
miR160 前体上游序列与 gus 报告基因相连后转化拟
南芥，GUS 染色显示 miR160 能够在主根维管组织
和侧根原基处有所表达，而在根尖部位表达量微弱，
连同其他数据证明 miR160 在根尖形成过程发挥重
要的调控作用。
Bna-miR1140 是芸薹属特异 miRNA，关于其功
能研究和表达调控均未见报道。本研究将目标启动
子与 GUS 报告基因融合，通过转化油菜和 GUS 化
学染色分析发现 miR1140 启动子为特异性启动子，
GUS 仅在叶柄及叶腋中表达，即表明 miR1140 在叶
柄和叶腋中表达。植物通过在叶腋中形成新的分生
组织产生分枝，分枝的形成受到植株发育阶段、环
境因素和激素的严格调控［20］。miRNA 参与油菜分
枝生长发育的分子机理研究几乎是一片空白，目前
还没有从油菜中克隆出任何控制分枝的相关基因及
miRNA，这与分枝在油菜株型育种中的重要地位极
其不符合。研究 miRNA 参与调控油菜分枝形成和发
育的遗传控制机理，可以完善高等植物发育生物学
的理论。同时，对于克隆鉴定调控油菜分枝发育的
miRNA 基因，结合分子育种手段，培育理想油菜株
型，以及增加油菜产量和降低油菜生产成本极具现
实意义。
4 结论
本研究对 miRNA 基因上游 1 351 bp 的序列进
行分离，并构建了 miR1140 pro∷GUS 植物表达载
体，得到 5 株转化 miR1140 pro∷GUS 的油菜 T0 代
阳性株。通过对阳性株油菜各组织的 GUS 化学染色
分析表明，miR1140 前体序列上游 1.5 kb 区域具有
启动子的功能，能够驱动 GUS 在油菜中的表达。对
miR1140 pro∷GUS 转基因油菜根、茎、叶、叶腋（茎
尖分生组织，SAM）、叶柄、花、种荚等组织、器官
进行 GUS 染色分析，结果表明 GUS 仅在叶柄及叶
腋中表达。
参 考 文 献
［1］ 况守龙 , 胡延章 . 启动子的克隆和研究方向［J］. 重庆工学院
学报 , 2007, 21（1）：136-139.
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（责任编辑 狄艳红）