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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):226-230
糖尿病是一种全身性慢性疾病，病因复杂，并
发症多，治愈率低，成为国际医学的一大难题，被
世界卫生组织称为不死的癌症。胰岛素是治疗糖尿
病最基础、最有效的药物，也是 FDA 批准的第一
个用于人类的基因重组药物。目前，胰岛素作为重
组蛋白产品，主要有两条途径获得。一条途径是在
大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体，通过溶解和
复性等过程获得胰岛素；另外一条途径是通过酵母
表达系统，分泌表达可溶性的胰岛素前体进入培 
养液［1］。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统许多优点，
例如，可对表达的蛋白进行翻译后加工与修饰、具
有强的可控的醇氧化酶基因强启动子、表达载体是
整合在染色体上、糖基化程度低使其所分泌的糖蛋
白的免疫原性较低利于临床应用等。目前，在毕赤
酵母中已有许多基因成功的实现了高效表达，如破
伤风毒素基因在毕赤酵母中表达后，其产量达 12 
g/L［2］；而来源于人的人血清蛋白基因经表达后，其
产量达 10 g/L［3］。然而仍有些蛋白的表达水平较低，
甚至表达出来没有活性。因此，我们还需进一步研
究提高外源蛋白在其体内的表达。
近年来，也有很多学者研究利用毕赤酵母来分
收稿日期：2015-09-30
作者简介：梁果义，男，研究生，研究方向：生物医药；E-mail ：guoyi_liang@163.com
重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究
梁果义1  甘一迪1  刘晓航1  蔡祥胜2
（1. 北京双鹭药业股份有限公司，北京  100043 ；2. 南方医科大学生物治疗研究所，广州  510515）
摘 要 ： 为了提高胰岛素在酵母的分泌表达效率，首先合成了胰岛素原基因，并在其序列的 N 端引入了一段引导肽，构建
成 pPICZα-A-Pro-INS 重组分泌型表达载体。将表达载体线性化处理后电击转化毕赤酵母 GSll5 感受态细胞，筛选获得分泌型高表
达工程菌株，重组蛋白的表达水平为 300 mg/L，占分泌总蛋白的 40％左右。该结果表达明引导肽的存在对于在毕赤酵母中高效表
达胰岛素的基因至关重要。
关键词 ： 胰岛素 ；毕赤酵母 ；高效表达 ；引导肽
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.033
Study on the Highly Secreted Expression of the Recombinant Insulin in
Pichia pastoris
LIANG Guo-yi1  GAN Yi-di1  LIU Xiao-hang1  CAI Xiang-sheng2
（1. Beijing SL Pharmaceutical Co.，Ltd.，，Beijing 100043 ；2. Institute of Biotherapy of Southern Medical University，Guangzhou 510515）
Abstract:  In order to improve the efficiency of insulin secretion expression in yeast，firstly the pro-insulin gene was synthesized，and a 
recombinant secreted expression vector（pPICZα-A-Pro-INS）was constructed by inserting a leader peptide to N-end of the gene’s sequence. 
Linearized expression vector was transformed into the competent cells of Pichia pastoris GSll5. A strain with highly secreted expression of the 
insulin was screened，by which the secreted recombinant protein expression level was 300 mg/L，accounting for about 40% of the total secreted 
protein. This result revealed that the leader peptide is crucial to the gene of highly expressing insulin in P. pastoris. 
Key words:  insulin ；Pichia pastoris ；highly expression ；leader peptide
2016,32(6) 227梁果义等：重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究
泌表达胰岛素的基因，然而由于该基因自身的一些
特点，多数研究表达胰岛素的量均较低。现在已有
一些研究通过优化表达核的启动子、拷贝数、对宿
主菌进行改良、优化培养条件等方法来提高胰岛素
的表达量［4］。尽管这些方法可以在一定程度上提高
其表达量，但是现有的文献报到，其表达量较低。
早在 1996 年，Kjeldsen 等［5，6］在酿酒酵母中表达完
整的人胰岛素原 cDNA 基因时，发现胰岛素原蛋白
大部分累积在胞内而不能分泌到胞外，而将编码胰
岛素原cDNA分子中的 β链中的第30位氨基酸去除，
并接上短的 C 肽链，且与酿酒酵母的 α 交配因子前
导肽相融合，则可以有效的提高单链胰岛素原的分
泌表达量。在此基础上，Kjeldsen 等［7，8］也在毕赤
酵母中成功的表达胰岛素原基因，且在前导肽与外
源蛋白之间引入一段间隔肽——EEAEAEAEPK，这
样在前导肽的引导下，表达的胰岛素原可以正确
的折叠，形成正确的二硫键以及提高其分泌表达
量。刘海峰等［9］利用毕赤酵母表达人胰岛素原基因
时，在胰岛素原基因的 N 末端引入同样的一段间隔
肽——EEAEAEAEPK，发现虽然其可以提高目的蛋
白的表达量，但间隔肽中多个酶切位点造成胰岛素
原蛋白 N 末端的不均一性。利用间隔肽还可促进其
它的基因如 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因［10］和植酸
酶基因［11］等在毕赤酵母中的分泌表达。
胰岛素工程菌的表达量一直是困扰胰岛素制备
的一个难题，本研究结合前人研究的基础，重新设
计胰岛素酵母表达的方式。采用 pPICZαA 载体，在
分泌信号肽和胰岛素原之间引入一段间隔肽，构建
载体转化酵母受体菌 GS115，利用 zeocin 抗性筛选
高拷贝重组子，表达验证来获得高表达胰岛素的酵
母工程菌种。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  菌株与载体  大肠杆菌（Escherichia coli）
TOP10 感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限
公司，毕赤酵母菌株 GS115 由本实验室保存；大肠
杆菌 -毕赤酵母穿梭质粒载体 pPICZα-A由本实验室
保存。
1.1.2  试剂  T4 DNA 连接酶、限制性内切酶（Xho 
I 和 NotI）、PfuDNA 聚 合 酶、dNTP 及 DNA Maker
（DL2000）均购自大连 TaKaRa 公司；博来霉素
（Zeocin）购自 Invitrogen 公司，胰蛋白胨（Trypsin）
和酵母提取物（Yeast extract），英国 Oxoid 公司；质
粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自美国 Omega 公司
其他化学试剂均为国产分析纯，购自北京化学试剂
公司。
1.1.3  培养基  （1）LB 培养基：1.0% 胰蛋白胨，0.5%
酵母提取物，1.0% NaCl，调节 pH值至 7.0（固体培
养基含 1.5% 琼脂）。（2）YPG 培养基：2.0% 胰蛋白 
胨，1% 酵母提取物，2% 甘油（固体培养基含
1.5% 琼脂）。（3）完全培养基 YPD：2.0% 胰蛋白
胨，1% 酵母提取物，2% 葡萄糖。（4）诱导表达
培养基 BMGY：2.0% 胰蛋白胨，1% 酵母提取物，
1.34%YNB，2% 甘油，10 mmol/L 磷酸钾（pH6.0）、
生物素 4×10-5 %（无菌过滤加入）。（5）诱导表达
培养基 BMMY：2.0% 胰蛋白胨，1% 酵母提取物，
1.34%YNB，0.5% 甲醇，10 mmol/L 磷酸钾（pH6.0）、
生物素 4×10-5 %（无菌过滤加入）。
1.2  方法
1.2.1  胰岛素原的 cDNA 序列的合成及酵母表达重
组载体的构建  在参阅文献以及前期相关研究的
基础之上，充分考虑到目的蛋白的分泌表达、酶
切、纯化回收等各个环节，确定其引导肽的序列为
EEAEAEAKR，根据 Codon Usage database（http://www.
kazusa.or.jp/codon/）P. Pastoris 密码子使用偏好性
数据，设计甘精胰岛素原类似物核苷酸序列，在
序列后面设计两个 TAA 终止密码子序列，并在序
列 5 端和 3 端分别设计 Xho I（CTCGAG）和 Not I
（GCGGCCGC）限制性酶切位点。具体序列为“CTCG
AGAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTAAGAGA
TTCGTCAACCAGCACTTGTGCGGTTCTCACTTGGTTG
AGGCCTTGTACTTGGTCTGTGGTGAGCGTGGTTTCTT
CTACACCCCAAAGACCAGACGTGGTATCGTTGAGC
AGTGTTGCACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAGTTGG
AGAACTACTGTGGTTAATAAGCGGCCGC”。
委托生金维智生物科技有限公司对本公司设计
完整的 cDNA 序列进行全基因合成，并将上述全基
因合成的 cDNA 插入 PUC57 质粒，构建重组质粒
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6228
PUC- Pro-INS。用限制性内切酶 Xho I 和 Not I 酶切，
利用质粒胶回收试剂盒回收目的基因片段并保存。
然后将目的基因连入表达载体 pPICZα-A。
1.2.2  重组酵母菌株的转化和诱导表达
1.2.2.1  毕赤酵母感受态细胞的制备  挑取毕赤酵
母 GS115 单菌落接种到装有 5 mL YPD 培养基的 50 
mL 三角瓶中，30℃，200 r/min 培养过夜。取 5 mL
过夜菌液到 100 mLYPD 中 30℃，200 r/min 培养，
OD600=1.2-2.0 收菌。 将 50 mL菌液移入离心管，4℃，
1 600×g 离心 5 min，无菌彻底去掉上清。 用 10 mL 
1mol/L D-Sorbitol 悬 浮 菌 体，4℃，1 600×g 离 心
5 min，无菌去掉上清。用 10 mL1mol/L D-Sorbitol 悬
浮菌体，4℃，1 600×g 离心 5 min，反复 5 次。用
1 000 μL 1 mol/L D-Sorbitol 悬浮菌体，冰水浴备用。
1.2.2.2  毕赤酵母的电转化  取 80 μL 酵母感受态
细胞菌液至预冷的 0.2 cm 电转杯中，加入线性化的
质粒 20 μL 浓缩质粒混匀，置冰上 5 min（或 -20℃
放置 1 min）。将电转杯放入电转仪中电转（电压
2.0 kV，电击时间 5 ms）。立即加入 1 mL 预冷无菌 
1 mol/L 的 D-Sorbitol，静止 60 min。取 200 μL 菌液
涂布 MD 板，平放 30℃烘箱 20-60 min，再倒放培
养 3-5 d。
1.2.2.3  筛选毕赤酵母多拷贝重组子  用无菌牙签
随机挑取在 YPG-Zeocin 平板上生长较快的微量毕赤
酵母重组子到含不同 Zeocin 浓度（300 μg/mL、600 
μg/mL）的固体平板上，同一重组子在不同 Zeocin
浓度的固体平板上编相同的号码。根据整合的外源
基因的拷贝数与 Zeocin 抗性大小之间的计量依赖关
系，可推断仅在低浓度 Zeocin 平板上长出来的细胞
为低拷贝重组子，在高浓度 Zeocin 平板上长出来的
细胞为高拷贝重组子。恒温箱设置为 30℃，静置培
养3-5 d。每日检查不同Zeocin浓度平板出现的菌落。
1.2.2.4  毕赤酵母重组子的诱导表达摇瓶筛选  分
别在含 100 μg/mL、300 μg/mL、600 μg/mL Zeocin 的
YPD 平板上挑取不同拷贝数的重组子菌落，接种于
100 mL BMGY 培养液的 1 000 mL 摇瓶中，30℃摇
床培养约 16-24 h 至 OD600 为 2-6 时，无菌条件下
更换等体积的 BMMY培养液进行诱导，28℃继续培
养 120 h，每隔 24 h 补加终浓度为 0.5% 的甲醇。诱
导结束离心后，上清液用三氯乙酸（Trichloroacetic 
acid，TCA）沉淀。配制试剂液 50%的 TCA 加入 0.2%
的去氧胆酸钠，取 25% 的试剂液与 75% 的培养基
离心上清液（体积比）混合均匀，在冰块上放置 30 
min。离心（4℃，20 000×g，20 min），倒去上清液，
用 10% 的 TCA 悬浮，离心（条件同上）。倒去上清
液，用冷丙酮（-20℃）再悬浮，离心（条件同上）。
用吹风机吹干沉淀，用 SDS buffer 溶解浓缩进行电
泳或HPLC 检测。
2 结果
2.1  酵母阳性转化子的筛选
将转化有胰岛素表达核的重组毕赤酵母，分别
点在含 100 μg/mL、300 μg/mL、600 μg/mL Zeocin 的
YPD 平板上进行培养，来筛选整合有高拷贝表达核
的重组子，平板结果见图 1。从图 1可以明显发现，
有些酵母的基因组中可能整合了多个拷贝的基因表
达核，可能会高效表达胰岛素的基因。
A B
A ：300 μg/mL Zeocin 筛选平板；B：600 μg/mL Zeocin 筛选平板
图 1 转化子抗性平板筛选的结果
挑选整合有高拷贝的 8 株转化子，进行摇瓶诱
导表达培养，并检测其表达胰岛素的量，蛋白质电
泳结果见图 2。从图 2 中可以发现胰岛素可以被高
效诱导分泌表达到胞外，重组蛋白的表达水平最高
可以达到到 300 mg/L，占分泌总蛋白的 40％左右。
文献报道［12］没有加前导肽的毕赤酵母转化子中，
胰岛素获得的最高分泌表达量仅为 32 mg/L。在胰导
素前体的 N端加上前导肽后，可以提高其表达量约
为 10 倍。
2.2  工程菌诱导表达蛋白的质谱测定
将表达的胰岛素前体从 SDS-PAGE 电泳中切下
后进行色谱纯化，从色谱图（图 3）中可以发现该
蛋白出峰的保留时间约为 14.9 min，纯度为 100%。
2016,32(6) 229梁果义等：重组胰岛素原在毕赤酵母中高效分泌表达的研究
将获得的重组胰岛素前体进行质谱测定其分子量为
7.08 kD，与其理论分子量 7.08 kD 基本一致，该结
果初步表明表达的重组蛋白质为胰岛素前体。在此
基础上，对目标条带进行一级质谱检测（图 4），选
取信号强度较好的两个肽段进行二级质谱，并搜索
Mascot 数据库，分析表明检测的蛋白质为胰岛素前
体中的蛋白质片段，从而证明胰岛素原在毕赤酵母
中成功实现表达。
的多肽，如果用常规方法构建单拷贝基因的重组质
粒，则目的基因在细胞中的表达量很低，无法体现
基因工程产量高的优势，其原因是表达产物的分子
太小，在细胞中不稳定，容易被宿主蛋白酶降解。
因此，建立一套适合小分子肽表达的体系，以实现
小分子多肽在体外的高效表达极为重要。
毕赤酵母作为目前应用最成功的一种外源基因
真核表达系统，可以高效分泌表达外源基因，然而
许多基因由于基因自身的性质，很难在该表达系统
中得到高效表达，其中胰岛素就是其中的一个例子。
有研究通过提高胰岛素基因表达核的拷贝数，优化
发酵条件、启动子等方法可以提高其分泌表达量，
但是其表达量依然很低。本研究发现在其 N 端融合
一种前导肽，可以提高其分泌表达量，也再次表明，
蛋白质 N端的序列和其在毕赤酵母中的分泌表达密
切相关。但到目前为止，仍还不清楚为什么这段前
导肽能大幅度提高胰岛素前体表达量的原因。另外
关于其应用的普遍性也需要进一步的研究。
优化发酵条件，提高酵母的产量，实现目的多
肽的高表达。用发酵罐高密度培养能大量提高表达
量。这是因为在发酵罐中，溶解氧水平、通气量、
PH搅拌速度、营养补给等方面更容易得到优化，有
机体能高密度生长，也可获得目标产物更高效的表
达。分泌表达可稳定表达产物，减少蛋白水解酶作用。
对已经筛选出来的菌株，通过优化发酵条件可进一
步提高分泌表达量。
4 结论
本研究构建了 pPICZα-A-Pro-INS 重组载体；将
表达载体转化毕赤酵母 GSll5，利用 Zeocin 抗生素
筛选高抗重组菌株；重组子甲醇诱导表达筛选获得
高表达菌种，基本上与其 Zeocin 浓度呈正相关，蛋
白的表达水平最高可达 300 mg/L，占分泌总蛋白
的 40％左右；获得的重组胰岛素前体分子量为 7.08 
kD，与其理论分子量一致。
参 考 文 献
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［2］Clare JJ, Rayment FB, Ballantine SP, et al. High-level expression 
㜠ዋ㍐৏
䈡ሬࡽ ሩ➗ 1 2 3 4 5 6 7 8
1-8 ：高拷贝重组子
图 2 蛋白质电泳结果
1000
500
0
0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min
图 3 回收样品 HPLC 色谱图
120000
100000
80000
60000
40000
20000
Components
10 min
A
.7
08
9
5000 10000 15000
图 4 质谱检测结果
3 讨论
利用基因重组技术在体外大量制备活性多肽是
目前生物制品研究的热点之一。对于许多分子较小
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6230
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                    （责任编辑  李楠）