全 文 ：·研究报告·
田间杂草与作物竞争阳光、水分、养分及生长
空间，同时又是作物病原菌和害虫的中间寄主生物，
严重影响了农作物产量和农产品质量［1］。同其他作
物如水稻、小麦、玉米、大豆和油菜等一样，甘蔗
杂草危害也相当严重，使用除草剂除草是目前备受
青睐的除草方式。然而传统的除草剂如草铵膦和草
甘膦除草无选择性，不能直接用于作物的生长期，
因此这个时期的田间除草只能依赖于人工操作［2］。
然而随着中国农村剩余劳动力的减少和劳动力成本
的增加，使本来机械化水平就偏低的甘蔗生产成本
收稿日期 ：2015-06-01
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31371687），现代农业产业技术体系（甘蔗）建设专项资金项目（CARS-20-6-11）
作者简介 ：王文治，男，硕士研究生，助理研究员，研究方向 ：甘蔗基因工程 ；E-mail ：wangwenzhi@itbb.org.cn
通讯作者 ：张树珍，女，博士，研究员，研究方向 ：甘蔗生物技术 ；E-mail ：zhangshuzhen@itbb.org.cn
抗除草剂 bar 基因与 EPSPS 基因在转基因甘蔗中的
应用研究
王文治  杨本鹏  蔡文伟  熊国如  冯翠莲  王俊刚  武媛丽   
沈林波  张树珍
（中国热带农业科学院甘蔗研究中心 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，
海口 571101）
摘 要 ： 通过农杆菌介导法，分别将 bar 基因和 EPSPS 基因导入到甘蔗中，分别获得了抗草铵膦和草甘膦两种除草剂的转
基因甘蔗。通过直接喷洒田间施用浓度的草铵膦和草甘膦除草剂，证明了转基因甘蔗 T0、T1 代、宿根 1 代和宿根 2 代外源基因遗
传稳定，且均具有稳定的耐除草剂的功能。因此转耐除草剂基因的甘蔗，可以与转耐除草剂基因的玉米、大豆、油菜和棉花一样，
有广阔的应用前景。
关键词 ： 转基因甘蔗 ；耐除草剂 ；bar 基因 ；EPSPS 基因 ；草铵膦 ；草甘膦
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.012
On Application of Herbicide Resistant Gene bar and EPSPS in
Transgenic Sugarcane
WANG Wen-zhi YANG Ben-peng CAI Wen-wei XIONG Guo-ru FENG Cui-lian WANG Jun-gang WU Yuan-li
SHEN Lin-bo ZHANG Shu-zhen
（Sugarcane Research Center of CATAS，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of CATAS，Key Biotechnology Laboratory for Tropical
Crops of Ministry of Agriculture，Haikou 571101）
Abstract: In this research gene bar and EPSPS were transferred into sugarcane cultivar via agrobacterium-mediated method，and the
transgenic sugarcane lines resistant to glufosinate-ammonium and glyphosphate were obtained. Directly spraying two herbicides at application
concentration for field onto the field planting the transgenic sugarcane lines demonstrated the genetic stability of exogenous gene in generation
T0，T1，ratoon 1，and 2 of them，and the lines had the stable herbicide-resistant ability. Therefore，the transgenic sugarcane lines resistant
to herbicide can be widely used in the field production as the other transgenic herbicide-resistant crops such as corn，soybean，rape and cotton.
Key words: transgenic sugarcane ；herbicide-resistant ；gene bar ；gene EPSPS ；glufosinate-ammonium ；glyphosphate
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):73-78
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.374
进一步提高［3-5］。种植耐除草剂转基因作物是解决
这个问题的最有效方法之一，在中国开展耐除草剂
转基因育种具有巨大的市场需求［6］。
2014 年， 全 球 种 植 转 基 因 作 物 1.815 亿 hm2，
相 当 于 全 球 总 耕 种 面 积 的 10%， 其 中 具 有 耐 除
草剂性状的转基因作物占全球转基因作物面积的
61%［7，8］。开展耐除草剂转基因研究的作物有很多种，
得到大面积推广应用的主要以玉米、大豆、油菜和
棉花为主［9］。国内外对甘蔗耐除草剂转基因方面的
研究也有一些报道［10-12］，但对其推广应用还远不如
大豆、玉米等其他作物，特别是在国内，甘蔗抗除
草剂转基因的研究相对来说还比较落后。
世界上应用得比较多的耐除草剂的基因主要为
bar 基因和 EPSPS 基因［13，14］。本研究通过农杆菌介
导法，分别将 bar 基因和 EPSPS 基因导入甘蔗中，
通过直接喷洒田间施用浓度的草铵膦和草甘膦，以
期获得抗草铵膦和草甘膦的转基因甘蔗。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 品种、质粒和菌株 受体材料为甘蔗主栽
品 种 新 台 糖 22 号， 抗 草 铵 膦 的 bar 基 因 来 源 于
pCAMBIA3300 载体，抗草甘膦的 EPSPS 基因来源
于根癌农杆菌 CP4 菌株。分别含两个抗除草剂基因
的植物表达载体均为本实验构建并保存，转化所用
农杆菌菌株为 EHA105。所使用草铵膦为浙江永农
生物科技有限公司生产，农药名称为“百速顿”，产
品批号 ：2014080701，其有效浓度为 20% 的草铵膦。
所使用草甘膦为江苏丰山集团有限公司生产，农药
名称为“双火”，产品批号 ：2014111201，其有效浓
度为 41% 草甘膦异丙胺盐。
实验地点 ：农业部转基因植物及植物用微生物
环境安全监督检验测试中心（海口） ——文昌基地。
1.1.2 培养基配方 胚性愈伤组织诱导培养基 ：MS+
2，4-D 1 mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 卡拉胶 8 g/L，pH5.8。
胚 状 体 分 化 培 养 基 ：MS+6-BA 1 mg/L+KT 0.5
mg/L+ 蔗糖 30 g/L+ 卡拉胶 8 g/L，pH5.8。
生根诱导培养基 ：MS（大量元素减半，其他成
分不变）+NAA 2 mg/L+ 蔗糖 20 g/L+ 椰水 100 mL/L+
卡拉胶 8 g/L+ 活性炭 0.2 g/L，pH 5.8［15］。
MR 培养基 ：MS（1/5 大量元素）+30 g/L 蔗糖
+100 μm/L 乙酰丁香酮，pH5.2。
1.2 方法
1.2.1 甘蔗胚性愈伤组织的诱导 以田间生长良好
的甘蔗顶端生长点处的幼叶组织为外植体，经酒精
及升汞消毒、无菌水冲洗后，于无菌滤纸上吸干其
表面的水分后，切成 1 mm 左右厚度的薄片接种于
诱导培养基上，于避光条件下进行培养至诱导出愈
伤组织。
1.2.2 农杆菌侵染菌液的制备 通过冻融法将含
bar 基因及 EPSPS 基因的植物表达载体分别导入到
EHA105 中。将经 PCR 鉴定为阳性的农杆菌在含抗
生素的 YEP 平板上划线，挑取单菌落接种到 5 mL
YEP 的液体培养基中，振荡培养至对数生长期，于
150 mL 三角瓶中扩大培养，培养至 OD 为 0.6 左右，
将菌液转移到离心管中，5 000 r/min 离心 5 min，弃
上清，吸干残液，用 MR 液体培养基重悬菌体，最
后置于 28℃，200 r/min 激活 2 h，诱导细菌 Vir 基因
的表达，作为转化材料的浸染液。
1.2.3 愈伤组织的转化 挑取生长旺盛的愈伤组织
于滤纸上吹干使其处于干缩状态，于工程菌液中浸
泡 30 min 后，滤去菌液，用滤纸吸干残液，吹干，
转移到 MR 固体培养基上。共培养 3-4 d 后，继代
筛选培养 20 d 后，分化筛选培养 15 d。待愈伤长出
1 cm 左右的小苗后，生根筛选培养 30 d。
1.2.4 转化植株的移栽与培养 当分别转入抗草铵
膦的 bar 基因及抗草甘膦的 EPSPS 基因的植株在抗
性生根培养基上生长至 4-7 cm 后，将经 PCR 鉴定
为阳性的转化株系移栽到大花盆里，并置于室外进
行种植培养，此次培养得到的植株设为 T0 代。到 T0
生长 8 个月左右后，砍去主茎，适量培土进行宿根
培养，重新生长出来的植株设为宿根 1 代。待宿根
1 代生长到 8 个月左右，再次砍去所有主茎，再次
进行宿根培养，重新生长出来的植株设为宿根 2 代。
而将所砍取的 T0 代的甘蔗茎段作为种茎，移栽大田
扩繁种植，称为 T1 代。
1.2.5 转化植株的分子检测 分别合成 bar 基因及
EPSPS 基因的特异性引物，分别对 T0 代、T1 代、宿
根 1 代及宿根 2 代的转化植株进行 PCR 检测，分析
2016,32(3) 75王文治等：抗除草剂 bar基因与 EPSPS基因在转基因甘蔗中的应用研究
bar 基因及 EPSPS 基因在转基因甘蔗中的遗传稳定
性。进行 PCR 扩增检测，扩增时设置正负对照。并
对植株扩增产物进行回收测序，检测扩增目的条带
的准确性。
1.2.6 T0 代、T1 代、 宿 根 1 代 及 宿 根 2 代 的 转 化
植株的耐除草剂特性检测 对转有 bar 基因的 T0
代、T1 代、宿根 1 代及宿根 2 代的转化植株，喷洒
田间建议使用浓度 4.5/hm2 的百速顿草铵膦除草剂
（200 g/L 草铵膦，永农生物科技有限公司，浙江）。
对转有 EPSPS 基因的 T0、T1、宿根 1 代及宿根 2 代
的转化植株，喷洒田间建议使用浓度 6 L/hm2 的农达
草甘膦除草剂（41% 草甘膦异丙胺盐，丰山集团有
限公司，江苏）。
2 结果
2.1 bar基因及EPSPS基因植物表达载体转化农杆
菌的鉴定
用合成的 bar 基因及 EPSPS 基因的特异性引
物，对通过冻融法将含抗草铵膦的 bar 基因及抗草
甘膦的 EPSPS 基因的两个植物表达载体分别导入
EHA105 中的农杆菌菌株进行 PCR 鉴定，并通过农
杆菌质粒 DNA 间接酶切鉴定法进行质粒载体的酶切
鉴定［16］。如图 1 所示，1、2 号菌株能扩增出与预
期条带 359 bp 大小一致的条带，且如图 2-A 所示，
通过酶切可以获得与 bar 基因 550 bp 大小一致的条
带，说明含抗草铵膦的 bar 基因的植物表达载体已
经正确导入到 EHA105 农杆菌菌株中。同样如图 1
所示，3、4 号菌株能扩增出与预期条带 643 bp 大小
一致的条带，且如图 2-B 所示，通过酶切可以切出
与 EPSPS 基因 1 600 bp 大小一致的条带，说明含抗
草甘膦的 EPSPS 基因的植物表达载体已经正确导入
到 EHA105 农杆菌菌株中。
2.2 转基因植株的获得
通过农杆菌介导法，用含抗草铵膦的 bar 基因
及抗草甘膦的 EPSPS 基因的两个植物表达载体分别
对甘蔗新台糖 22 号进行遗传转化，结果（图 3）表明，
为转化筛选后得到了分别含抗草铵膦的 bar 基因及
抗草甘膦的 EPSPS 基因的转化植株。
2.3 T0代转化株系的PCR检测
当所获得的转化抗性植株生长至 4-7 cm，按
编 号 剪 取 小 苗 叶 片 组 织 约 10-20 mg， 剪 碎 置 于
eppendorf 管中，用 CTAB 法提取 DNA。用 1.2.5 合
成的 bar 基因及 EPSPS 基因的特异性引物，对分别
转有 bar 基因及 EPSPS 基因的转化植株进行 PCR 检
测。图 4 显示，所检测的转 bar 基因的 23 株转化
抗性植株中有 20 株为 bar 基因阳性（编号为 ：b1、
b2、b3、b5、b6、b7、b8、b9、b10、b12、b13、
b14、b15、b17、b18、b19、b20、b21、b22、b23）。
359
bp
1 2 M 3 4
643
bp
1，2 ：含 bar 基因植物表达载体的农杆菌菌株 ；3，4 ：含 EPSPS 基因植物
表达载体的农杆菌菌株 ；M ：2000 bp DNA Marker
图 1 农杆菌菌株 PCR 鉴定
550
barสഐbp 1600EPSPSสഐbpMA B1 2 M 3 4
1，2 ：含 bar 基因植物表达载体的酶切鉴定 ；3，4 ：含 EPSPS 基因植物表
达载体的酶切鉴定 ；M ：DNA Marker
图 2 植物表达载体的酶切鉴定
A ：转含 bar 基因的甘蔗转化植株 ；B ：转 EPSPS 基因的甘蔗转化植株
图 3 转含 bar 基因（A）EPSPS 基因（B）的甘蔗遗传
转化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.376
而所检测的转 EPSPS 基因的 23 株转化抗性植株中
有 15 株为 EPSPS 基因阳性（编号为 ：E1、E5、E6、
E8、E9、E10、E12、E14、E15、E17、E18、E20、
E21、E22、E23）。
2.4 T1代、宿根1代及宿根2代的转化植株的PCR
鉴定
砍取 T0 代为阳性的植株主茎转移到大田扩繁种
植，称为 T1 代。而 T0 代在花盆中留下的蔗头则连
续进行两次宿根培养，称为宿根 1 代及宿根 2 代。
通过 bar 基因及 EPSPS 基因的特异性引物，对 T1 代、
宿根 1 代及宿根 2 代进行 PCR 检测，以检测 bar 基
因及 EPSPS 基因在转基因甘蔗中的遗传稳定性。图
5 显示，T0 代检测为 bar 基因 PCR 阳性的 20 个转化
植株，在 T1 代、宿根 1 代及宿根 2 代中均能检测到
bar 基因的存在，说明 bar 基因可以在转基因甘蔗中
得到稳定的遗传。图 6 则显示，T0 代检测为 EPSPS
基 因 PCR 阳 性 的 15 个 转 化 植 株， 在 T1 代、 宿 根
1 代及宿根 2 代中均能检测到 EPSPS 基因的存在，
说明 EPSPS 基因也可在转基因甘蔗中得到稳定的
遗传。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 CK- CK+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 CK-CK+
barสഐ
EPSPSสഐAB
图 4 转化 bar 基因（A）及 EPSPS 基因（B）植株 T0 代的 PCR 检测
1 2 3 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 17 18 19 20 21 22 23 CK- CK+A
B
C
A ：T1 代 ；B ：宿根 1 代 ；C ：宿根 2 代
图 5 转 bar 基因甘蔗的遗传稳定性检测
1 5 6 8 9 10 12 14 15 17 18 20 21 22 23 CK- CK+A
B
C
A ：T1 代 ；B ：宿根 1 代 ；C ：宿根 2 代
图 6 转 EPSPS 基因甘蔗的遗传稳定性检测
2.5 T0 代、宿根1代及宿根2代的耐除草剂特性
检测
分别对转 bar 基因与 EPSPS 基因的转基因甘
蔗 T0 代、宿根 1 代及宿根 2 代，喷洒田间施用浓度
的草铵膦 4.5 L/hm2 和草甘膦 6 L/hm2。转 bar 基因
与 EPSPS 基因的转基因甘蔗 T0 代、宿根 1 代及宿
根 2 代喷洒除草剂 7 d 后观察，并拍照。转 bar 基
因甘蔗 T0 代、宿根 1 代及宿根 2 代喷洒草铵膦 7 d
后的结果（图 7）显示，每个花盆的左边为补充种
2016,32(3) 77王文治等：抗除草剂 bar基因与 EPSPS基因在转基因甘蔗中的应用研究
植的非转基因对照植株，已经干枯并逐渐死亡，而
右边为转 bar 基因植株则不受草铵膦的任何影响继
续健康生长。说明转 bar 基因的甘蔗 T0 代、宿根
1 代及宿根 2 代都具备稳定的耐除草铵膦特性。转
EPSPS 基因甘蔗 T0 代、宿根 1 代及宿根 2 代喷洒草
甘膦 7 d 后的结果（图 8）显示，每个花盆的右边为
补充种植的非转基因对照植株，已经干枯并逐渐死
亡，而左边为转 EPSPS 基因植株则不受草甘膦的任
何影响继续健康生长。说明转 EPSPS 基因的甘蔗 T0
代、宿根 1 代及宿根 2 代都具备稳定的耐除草甘膦
特性。
草铵膦有极强的耐受性。
田间喷洒草甘膦除草剂 10 d 后的效果（图 10）
显示，杂草及非转基因对照甘蔗均枯黄，基本接近
死亡，对草甘膦没有任何耐受性（图 10-A）；喷洒
了草甘膦的转 EPSPS 基因的甘蔗不受草甘膦的任何
影响继续健康生长（图 10-B），说明转 EPSPS 基因
的甘蔗对草甘膦有极强的耐受性。
T0ԓ ᇯṩ1ԓ ᇯṩ2ԓ
图 7 转 bar 基因甘蔗喷洒草铵膦
T0ԓ ᇯṩ1ԓ ᇯṩ2ԓ
图 8 转 EPSPS 基因甘蔗喷洒草甘膦
图 9 田间喷洒草铵膦除草剂 10 d 后
图 10 田间喷洒草甘膦除草剂 10 d 后
3 讨论
草甘膦和草铵膦从化学结构上讲都属含磷的氨
基酸类除草剂。草甘膦于 1974 年投入市场，而草铵
膦于 1986 年投入市场。这两种除草剂都是非选择性
的灭生性除草剂，这是他们的共同之处，但作用机
制却不同。草甘膦为 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷酸
合成酶（EPSP）抑制剂。草甘膦通过阻碍此酶，从
而破坏杂草所必须的芳香族氨基酸的合成，诸如色
氨酸、酪氨酸、丙氨酸，导致杂草枯死。而草铵膦
则为谷氨酰胺合成酶（GS）抑制剂，通过阻碍该酶
的合成而灭杀杂草。目前草甘膦是全球销售市场最
高的除草剂，也是全世界销售额第一的农药品种，
2012 年，其销售额达 45.75 亿美元。可见，草甘膦
的销售与应用远远超过了草铵膦。所以目前抗草甘
膦转基因作物的推广应用也最为广泛。
但随着草甘膦抗性难除杂草的增多、百草枯禁
2.6 田间扩繁T1代耐除草剂特性检测
分别对转 bar 基因与 EPSPS 基因的转基因甘
蔗田间扩繁 T1 代，喷洒田间施用浓度的草铵膦 4.5
L/hm2 和草甘膦 6 L/hm2。
田间喷洒草铵膦除草剂 10 d 后的结果（图 9）
显示，杂草及非转基因对照甘蔗均枯黄，基本接近
死亡，对草铵膦没有任何耐受性（图 9-A）；喷洒了
草铵膦的转 bar 基因的甘蔗不受草铵膦的任何影响
继续健康生长（图 9-B），说明转 bar 基因的甘蔗对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.378
用日期临近，草铵膦作为理想的替代选择成为业界
关注的热点品种。在 2014 年 11 月的草铵膦应用技
术与市场推广交流会上，不少业内专家认为，除草
剂将进入草铵膦时代。草铵膦对土壤、作物根系和
后茬无影响，杀草谱广、持效期较长，可以减少用
药次数，降低成本，性价比优势明显，未来应用面
积将进一步扩大。国内百草枯水剂退市后，近 4 万
t 市场空白将被草铵膦等灭生除草剂替代，而草铵
膦将成为唯一的快速灭生除草剂，尤其是浅根作物
行间除草，增长空间大。草铵膦生产工艺复杂，要
经过 13 道反应工序，历经半个多月的时间才能生产
出来，国内能生产出这一产品的厂家屈指可数，产
能供应不足。同时，价格偏高也限制了其在大田作
物的应用。虽然草铵膦的用药成本是百草枯的 2-3
倍，但至少能节约一次用药，每公倾可以节省用工
成本 300 多元钱，目前人工成本贵，而且劳动力紧
缺。百草枯的退市，使得灭生性除草剂选择空间变小；
现在农户对种植成本有了新的认识，不是简单看价
钱，关键看性价比 ；随着草铵膦规模的不断扩大和
科技进步，也会逐渐降低生产成本，这几大因素让
草铵膦有非常大的发展潜力。同时这也将进一步推
进抗草铵膦转基因作物的研究与应用［17］。
4 结论
利用农杆菌介导法分别获得了抗草甘膦与草铵
膦的转基因甘蔗，并对 T0 代、宿根 1 代、宿根 2 代
及田间扩繁 T1 代外源基因遗传稳定性和耐除草剂稳
定性进行较为系统的研究。结果证明，转 bar 基因
耐草铵膦和转 EPSPS 基因耐草甘膦的甘蔗转基因植
株的外源基因均能稳定遗传，耐除草剂特性强且稳
定。因此，转 bar 基因和转 EPSPS 基因的耐除草剂
转基因甘蔗有良好的应用前景。
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（责任编辑 马鑫）