全 文 ：第 33卷 第 4期 生 态 科 学 33(4): 759−763
2014 年 7 月 Ecological Science Jul. 2014

收稿日期: 2013-08-30; 修订日期: 2014-12-12
基金项目: 河南省科技攻关项目(132102110021；142300410007)和河南高校青年骨干教师计划资助(2012GGJS-219)
作者简介: 闫艳(1979—), 女, 驻马店人, 硕士, 工程师, 主要从事园林园艺研究。
*通信作者: liujunhe79@126.com

闫艳, 崔文艺, 李大红, 等. 紫花苜蓿 DREB1 基因的原核表达与蛋白纯化[J]. 生态科学, 2014, 33(4): 759−763.
YAN YAN, CUI Wenyi, LI Dahong, et al. Prokaryotic expression of MsDREB1 gene and protein purification [J]. Ecological Science,
2014, 33(4): 759−763.

紫花苜蓿 DREB1 基因的原核表达与蛋白纯化
闫艳 2, 崔文艺 1, 李大红 1 , 刘军和 1*
1. 黄淮学院生物工程系, 河南，驻马店 463000
2. 驻马店园林绿化科研所, 河南，驻马店 463000

【摘要】 构建 MsDREB1 基因的原核表达载体, 对表达产物进行鉴定和纯化, 为研究 DREB1 基因在植株中功能奠定基
础。用冷酚法从紫花苜蓿提取 RNA, 并转化成 cDNA, 然后将其克隆至 pET32a 原核表达载体, 构建重组载体 pET32a-
DREB1。用重组质粒转化大肠杆菌 BL21, IPTG 诱导表达后进行 SDS-PAGE 分析, 用 Ni-NTA 亲和层析柱对重组蛋白进
行纯化。结果表明, 原核表达载体构建正确; SDS-PAGE 分析, 出现了与 DNAMAN 预测的 43.2 kd 大小一致的蛋白条带;
经分析重组蛋白纯化率达到 90%以上。

关键词：MsDREB1 基因; 原核表达; 纯化
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2014.04.020 中图分类号：Q948 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2014)04-759-05
Prokaryotic expression of MsDREB1 gene and protein purification
YAN YAN2, CUI Wenyi1, LI Dahong1*, LIU Junhe1
1. Department of Biological Engineering of Huanghuai University, Zhumadian 463000, Henan, China
2. Landscape Research Institutes of Zhumadian, Zhumadian 463000, Henan, China
Abstract: MsDREB1 prokaryotic expression vector was constructed and the expression products were identified and purified, as a
basis for study DREB1 gene function in Alfalfa. We extracted RNA using cold phenol method from Alfalfa, and transformed into
cDNA, then cloned into prokaryotic expression vector pET32a to construct recombinant plasmid pET32a-DREB1. Recombinant
plasmid was transformed into E. coli BL21, and IPTG induced its expression; the protein was SDS-PAGE analyzed, recombinant
protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The results showed that the prokaryotic expression vector was constructed
correctly, and by SDS-PAGE analysis, there was a 43.2 kd protein band consistent with the DNAMAN forecast. The recombinant
protein purification rate was 90% or more.
Key words: MsDREB1 gene; prokaryotic expression; purification
1 引言
苜蓿是世界上分布范围最广、种植面积最大的
多年生豆科牧草, 以“牧草之王”著称, 不仅产量高,
而且草质优良, 各种畜禽均喜食。我国目前苜蓿的
种植面积约 133 万 hm2。随着商品经济的发展, 近年
来苜蓿产业化规模发展较快, 苜蓿的种植面积正在
扩大。苜蓿的品种较多, 其中最重要的一种是紫花
苜蓿(Medicago sativa), 但其抗逆性差, 因此对它的
抗逆性进行改良具有重要意义。
760 生 态 科 学 33 卷

DREB1 蛋白是 DREB 家庭的一个成员, DREB1
属于AP2/EREBP转录因子家族, 该家族转录因子是
一类在植物中特有的、与植物的生长发育调控以及
应答植物的非生物逆境胁迫有关的转录因子, 其典
型特征是DNA结合区均为由 57—70 个氨基酸残基
组成的 AP2/EREBP 保守结构域。其具有转录因子的
普遍结构特征, 由DNA结合区(DNAbinding domain)、
转录调控区(transcription regulation domain)、寡聚化
位点(oligomerization site)和核定位信号区(nuclear
localization signal, NLS) 4 个独立的功能区组成, 转
录因子通过这些功能域与靶基因启动子中的顺式作
用元件或其他蛋白质相互作用来激活或抑制基因的
表达[1–3 ]。自从 Liu 等[4]分别从低温、干旱诱导的拟
南芥中分离得到 2 类共 5 个 DREB 类转录因子, 利
用DREB1A培育的转基因拟南芥植株的低温耐性比
野生型植株显著增强之后, 关于 DREB 转录因子的
研究在国内外广泛开展了, 大麦[5]、水稻[6]、棉花[7]
等植物中均有 DREB 类转录因子基因有所报道。有
研究表明, 由 CaMV35S 启动子调控 DREB1A 的超
表达显著提高了转基因拟南芥Ⅲ、烟草、菊花等植
株的抗旱性 [8–9]。本研究在原核表达系统中表达
DREB1, 为进一步研究DREB1在植物中的功能, 对
其蛋白水平检测及 DREB1 调控机理提供抗原。
2 材料与方法
2.1 材料
菌株E.coli DH5、E.coli BL21和表达载体pET32
由本实验室保存。回收试剂盒、DNA聚合酶、T4 DNA
连接酶、限制性内切酶BamHI和SalI以及DNA片段
回收试剂盒均购自TaKaRa公司; 质粒快速提取试
剂盒购自Promega公司 , Ni-NTA纯化试剂盒购自
Invitrogen公司; 引物合成及基因测序由上海生物工
程技术服务有限公司完成。
2.2 引物设计、PCR 反应与产物回收
设计、合成引物5’-ccggatccACACCA TTTT CC
ACTCTATCCA-3’ (下划线序列为BamH I酶切位点)
和 5’-ccgtcgacTCCTATTCTACGATCCAAAA-3’ (下
划线序列为SalI酶切位点), 采用冷酚法[10]提取苜蓿
总RNA, cDNA合成按上海生物工程技术服务有限
公司cDNA合成试剂盒进行。
以cDNA为模板, 对MsDREB1基因进行PCR扩增
反应体系: cDNA 0.5μL, 10×Taq Buffer 2μL, MgC12
(25mmol·L−1)1.2 μL, dNTP(2.5 mmol·L−1)0.5 μL, 上
下游引物(10 pmol·L−1)各0.5 μL, ddH2O补足至20 μL;
反应参数为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性60 s, 52 ℃
退火50 s, 72 ℃ 延伸 60 s, 循环扩增30次, 最后 72 ℃
延伸10 min。扩增完毕, 用琼脂糖凝胶电泳检测。扩
增片段用DNA凝胶回收试剂盒纯化。将经纯化的扩
增片段与pMD-18T载体直接连接, 连接产物转化用
的是CaC12法制备的大肠杆菌DH5a感受态细胞。在
含有氨苄青霉素(Amp), IPTG和X-gal的LB平板上挑
选白色菌落, 抽提质粒, 用BamHI和SalI双酶切, 琼
脂糖凝胶电泳检测DREB1, 送交上海生物工程技术
服务有限公司测序。
2.3 目的蛋白的诱导表达
将测序正确的重组质粒转化E.coli BL21, 挑取
阳性克隆接种于LB培养液中(含Amp 100μg·mL-1),
37℃振摇培养过夜。次日按1％比例转接后, 37℃振
摇培养2.5h, 使OD达到0.5—0.6后, 加入IPTG至终
浓度为0.1 mmol·L–1, 37℃诱导培养5—6h, 离心收集
菌体, 并进行12%SDS-PAGE鉴定。
2.4 目的蛋白的纯化
用适当浓度的 IPTG 诱导并选择相应的温度培
养 500 mL 所构建的工程菌, 离心收集菌体, 加入裂
菌缓冲液并进行超声波碎菌, 随后收集上清进行纯
化。具体纯化操作参照 Invitrogen 公司 Ni-NTA 纯化
试剂说明书。
3 结果
3.1 MsDREB1 基因 PCR 扩增
本研究采用冷酚法提取紫花苜蓿叶总 RNA,
电泳确定 RNA 的完整性, 以总 RNA 为模板, 按上
海生物工程技术服务有限公司合成试剂盒操作说
明合成了叶 cDNA。PCR 产物经凝胶电泳分离, 结
果呈弥散状 , 以单链 cDNA 为模板 , 合成双链
cDNA, 获得大小为 730 bp 左右的条带(图 1), 经
TA 克隆和酶切鉴定, 初步确定为目的条带, 经测
序和 NCBI 基因库中源基因比对, 碱基同源性达
100%。这表明目的基因已构建到 pMD-18T 载体上,
并成功转入了大肠杆菌。
3.2 pET32a-DREB1 载体的酶切鉴定
提取重组子质粒, 经 PCR 扩增, 琼脂糖凝胶电
4 期 闫艳, 等. 紫花苜蓿 DREB1 基因的原核表达与蛋白纯化 761


图 1-a PCR 扩增MsDREB1基因, M-Maker DL2000, 1, 2-PCR 产物; 1-b: 重组质粒酶切鉴定图谱, M-Maker DL15000, 1-载
体经 BamHI 和 SalI 双酶切; 1-c: pET32a -DREB1 载体的构建
Fig. 1-a PCR amplification of MsDREB1 gene, M-Maker DL2000, 1,2-PCR product; 1-b: Identification of vector pET32a-
DREB1, M-Maker DL15000, 2-pET32a-DREB1 digested with BamHI and SalI; 1-c: Construction of vector pET32a-DREB1

泳, 能够清晰地看到一条约 730 bp 的亮带, 与阳性
对照一致。再用 BamHI 和 SalI 酶切, 也能看到与预
期大小一致的片段(图 1—a)。图 1—c 为重组载体的
构建示意图。
3.3 目的蛋白在大肠杆菌中的表达
MsDREB1蛋白含 216个氨基酸, 加上融合蛋白
C 端的多肽标签, 重组蛋白全长 393 个氨基酸, 经
DNAMAN 预测其分子质量约为 43.2 kd。SDS-PAGE
显示诱导组在不同 IPTG浓度下, 在37ºC条件下, 加
入 IPTG 至终浓度分别为 0 mM、0.1 mM、0.2 mM、
0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM, 诱导培养 4h(图 2-a)。
由图 2可见, 没有 IPTG诱导剂时, 无目的蛋白表达,
在 0.1—0.8 mM的 IPTG浓度范围内, 蛋白表达量没
有明显差别, 因此选择 0.1 mM 的 IPTG 浓度作为表
达的工作浓度, 之后, 分别对诱导时间与温度进行
优化 , 确定时间为 4 h, 诱导温度为 16 ℃。经
Ni-NTA 纯化, SDS-PAGE 电泳, 该蛋白位于蛋白质
分子质量标准之 43.0 kd 的稍上方, 符合预期大小,
说明融合蛋白表达成功。用 BandScan 灰度扫描蛋白
分析软件分析, 蛋白纯度达 95.3%(图 2—b)。
4 结论
利用原核表达系统过量表达外源蛋白时, 目标
蛋白往往因为自身的理化性质、表达速率过快、二
硫键不能氧化折叠等原因而聚集形成包涵体[11,12],
难以获得可溶性蛋白, 所以难以继续进行蛋白性质
762 生 态 科 学 33 卷


图 2-a 1-无 IPTG 诱导 BL21(pET32a-DREB1)总蛋白。
2—6-IPTG 诱导 BL21(pET32a-DREB1)总蛋白(浓度分别为
0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.8mmol/L); 2-b: M-蛋白质分子量标准;
1-Ni-NTA 纯化的目的蛋白
Fig. 2-a 1-The whole cell protein expressed by BI_2l
(pET32a-DREB1) without IPTG induction. 2-6-The whole
cell protein expressed by BL21 (pET32a-DREB1) induced
by IPTG (Concentrations were 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.8mmol/L
respectively); 2-b M-Protein Marker, l-Purification protein
through Ni-NTA
的研究, 往往需要借助外力破碎包涵体, 本研究对
部分包涵体用超声波破碎, 而后进行蛋白的纯化。
研究所用的宿主菌株E.coli BL21是一个广泛用于表
达外源蛋白的宿主菌, 但诱导条件的选择也非常重
要, 包括IPTG浓度、诱导时间和诱导温度、pH值等。
诱导温度的高低, 不仅影响到蛋白质的表达, 而且
也影响其溶解度。37 ℃生长会使一些蛋白累积形成
包涵体, 而24 ℃生长可溶性蛋白表达最多。通常,
降低蛋白合成速率(如降低诱导培养温度)及在盐离
子浓度适宜的培养基中生长都会使目的蛋白的可溶
性增加。诱导剂的量则影响到表达产物的产量。过
低的浓度, 表达产物的产量也往往不高, 然而诱导
剂浓度过高, 表达产物却不会随之无限提高, 反而
造成浪费。本实验中使用了不同浓度的IPTG诱导,
结果发现表达产量没有显著差异。发酵培养是为了
大大提高菌体量, 进而提高蛋白产量。采用慢速持
续的表达策略, 选用较低的生长温度, 中等诱导剂
浓度和较丰富的培养基, pH介于6.5—7.1, 这样可以
减少包涵体的形成。研究外源基因在大肠杆菌中的
表达的工作已进行得十分广泛, 其中影响因素也很
多, 除了表达载体和表达系统的选择, 也包括目的
蛋白的诱导表达条件的优化以及目的蛋白的分离纯
化等, 仅仅改变其中某一方面的因素对蛋白的表达
纯化并不能起到突出性的作用, 只有清楚各个因
素的作用和方法 , 优化蛋白表达的各个途径 , 使
各步操作协调一致相互作用, 才能使目的蛋白充
分表达。
国内外许多研究表明 DREB 转录因子与植物对
干旱、低温、高盐胁迫应答密切相关 [5,13,14,15], 在
DREB 转基因植物中, DREB 转录因子基因的超表
达可以激活下游靶基因的表达, 从而提高植物对
低温、高盐、干旱等逆境的耐受性。有研究表明
紫花苜蓿 MsDREB1 基因在紫花苜蓿基因组中以
2 拷贝存在[16]。但是对于紫花苜蓿 DREB 基因的
研究 , 在国内外报道较少。本研究从紫花苜蓿中
克隆到 MsDREB1 基因, 并将其进行原核表达并
纯化, 为研究 DERB1 在紫花苜蓿中功能及调控提
供抗原。
参考文献
[1] GUO Z J，CHEN X J, WU X L, et al．Overexpression of the
AP2/EREBP transcription factor OPBP1 enhances disease
resistance and salt tolerance in tobacco[J]. Plant Molecular
Biology, 2004, 55 (4): 607–618.
[2] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K, KOIZUMI M, URAO S,
et al. Molecular cloning and characterization of nine
cDNAs for genes that are responsive to desiccation in
Arabidopsis thaliana: Sequence analysis of one cDNA
clone that encodes a putative transmembrane channel
protein[J]. Plant Cell Physiology, 1992, 33(3): 217–224.
[3] YAMAGUCHI-SHINOZAKI K and SHINOZAKI K. A
novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved
in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt
stress[J]. Plant Cell, 1994, 6(2): 251–264.
[4] LIU Q, KASUGA M, SAKUMA Y, et al. Two Transcription
Factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA
Binding Domain Separate Two Cellular Signal
Transduction Pathways in Drought- and Low-Temperature-
Responsive Gene Expression, Respectively, in Arabidopsis[J].
Plant Cell, 1998, 10(8): 1391–1406.
[5] CHOI D W, EDMUNDO M, RODRIGUEZ et al. Close
Barley Cbf3 Gene Identification, Expression Pattern, and
Map Location[J]. Plant Physiol, 2002, 129(4): 1781–1787.
4 期 闫艳, 等. 紫花苜蓿 DREB1 基因的原核表达与蛋白纯化 763

[6] DUBOUZET J G, SAKUMA Y, ITO Y, et al. OsDREB
genes in rice(Oryza sativa L.) encode transcription
activators that function in drought- , high-, salt- and cold-
responsive gene expression[J]. Plant Journal, 2003, 33 (4):
751–763.
[7] HUANG Bo, JIN Longguo and Liu Jinyuan. Identification
and characterization of the novel gene GhDBP2 encoding a
DRE-binding protein from cotton (Gossypium hirsutum)[J].
Journal of Plant Physiology, 2008, 165(2): 214–223
[8] GILMOUR S J, ZARKA D G, STOCKINGER E J, et al.
Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family
of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-
induced COR gene expression[J]. The Plant Journal, 1998,
16(4): 433–443.
[9] QIN Feng, LI Jie, ZHANG Gui-you, et al. Isolation and
structural analysis of DRE-binding transcription factor
from maize (Zea mays L.)[J]. Acta Botanica Sinica, 2003,
45(3): 331–339.
[10] ZHENG F Q, WANG Z Y, GAO J P. Isolation of total RNA
from rice endosperm[J]. Plant Physiology Commu, 1993,
29(6): 438–440. (in Chinese).
[11] HANNING G, MAKRIDES S C．Strategies for optimizing
heterologous protein expression in Escheriehia coli[J].
Trends Biotechnol, 1998, 16(2): 54–60.
[12] BESSETTE P H, ASLUND F, BECKWITH J, et al.
Eficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in
the Escheriehia coli cytoplasm[J]. Pro Nail Acad Sci USA,
1999, 96(24): 13703–13708.
[13] 韩兆雪, 曹墨菊, 朱祯, 等. DREB 基因双 T-DNA 植
物表达载体的构建及验证 [J]. 分子植物育种 , 2004,
2 (1): 7–12.
[14] 刘录祥, 赵林姝, 梁欣欣, 等. 基因枪法获得逆境诱导转
录因子 DREB1A 转基因小麦的研究[J]．中国生物工程
杂志, 2003, 23(11): 53–56.
[15] 阳文龙, 刘敬梅, 刘强等. 高羊茅 DREB 类转录因子
基因的分离及鉴定分析 [J]. 核农学报 , 2006, 20(3):
187–192.
[16] 牛一丁, 哈斯阿古拉, 张丽, 等. 紫花苜蓿逆境胁迫诱导
相关转录因子 MsDREB1 基因克隆与分析[J]. 植物生理
学通讯, 2008, 44(3): 454–458.