全 文 ：第27卷第4期 生态科学 27(4)：227．231
2008年8月 EcologicalScience Aug．2008
聚球藻PCC7942氢酶的分离纯化及特性研究
徐惠娟1，邬小兵1，李筱泉1，龙敏南1，梁世中2
1．厦门大学生命科学学院，厦门361005
2．华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006
【摘要】 报道了室温、空气环境下聚球藻Synechococcussp．PCC7942氢酶的分离纯化。经过超声破碎、超速离心、离
子交换层析、疏水层析及凝胶层析等步骤，氢酶被纯化了218倍，得率为6．5％，比活为1．46U·mgd蛋白。纯化氢酶的
SDS．PAGE图显示五条蛋白带，分子量约为83kDa，60kDa，47kDa，30kDa和27kDa。该氢酶为可溶性的双向氢酶，其催
化放氢的最佳电子供体为还原态的甲基紫精，最适温度50"C，最适pH8．0。
关键词：氢酶：放氢；聚球藻；纯化：特性
中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2008)04-227—05
PurificationndcharacterizationofhydrogenasefromSynechococcussp．
PCC7942
XUHui-juanp，WUXiao-bin91，LIXiao-quanl，LONGMin-nanl，LIANGShi-zhon92
1．School醇L瓣Sciences,XiamenUniversity,Xiamen36100只China
2．CollegeofBiologicalSc encendEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China
Abstract：Hydrogenasef mSynechococcussp．PCC7942waspurifiedtoclosehomogeneitya robicallyatroomtemperature．
Thehydrogenase-containingrudeextractWascollectedafterultrasonicdisruptionandremovalofcelldebrisby
ultraeentrifugation．Subsequently,threestepsofcolumnchromatographies(anionexchange，hydrophobicinteract onandgel
filtration)wereperfo med．HydrogenaseWaspurifiedabout218一foldwithayieldof6．5％finally．Thepurifiednzymehasa
specificactivityforhydrogenevolutionof1．46U‘mg—protein．SDS-PAGEgelofthepurifiedenzymerevealedfivepredominant
proteinba dswithestimatedmolecularweightsof83，60，47，30and27kDa,respectively．The曲zymeisasolubleidirectional
hydrogenasea dshowsmaximumactivitywhileusingreducedm thylviologenasa electrondo or．Theoptimumtemperature
andpHvalueforhydrogenevolutioncatalyzedbythepurifiedhy rogenaseare50"12andpH8．0．
Keywords：hydrogenase；hydrogenevolution；Synechococcussp．PCC7942；purification；characterization
收稿日期：2008-06-24收稿，2008旬8．10接受
基金项目：福建省自然科学基金(C0410002)资助
作者简介：徐惠娟(1971一)，女，讲师，研究方向为酶工程．
’通讯作者，E-mail：hjxu@xmu．edu．gn
万方数据
1引言(Introduction)
氢酶是一类催化氢的氧化或质子还原的酶，广
泛存在于原核微生物和一些简单的真核生物中，如厌
氧细菌、光合细菌、蓝藻和某些真核藻类，在这些生
物体的能量代谢中扮演着重要角色【l捌。氢酶从功能
上分为吸氢酶和双向氢酶。吸氢酶主要催化利用分子
氢的反应，而双向氢酶既可催化放氢，也可催化利用
分子氢的反应。当今世界面临的能源危机，使得利用
微生物制取清洁燃料氢气成为科学界的热点。氢酶是
生物产氢过程中的关键酶，对氢酶的深入研究不仅可
以揭示它的催化机理，而且能为氢酶的改造和高效生
物制氢系统的构建奠定基础。
聚球藻Synechococcussp．PCC7942是一种单细
胞海生蓝藻，本实验室的前期研究发现该藻在厌氧黑
暗条件下能利用葡萄糖产氢，且产氢效率较高，说明
其体内必然存在能够催化放氢的氢酶。已经有多种氢
酶从不同微生物中分离出来，因为氢酶对氧敏感，热
稳定性差，纯化步骤通常在低温、厌氧条件下进行p。5J。
本文报道了非厌氧条件下聚球藻PCC7942氢酶的分
离纯化，并对其催化放氢的特性进行了初步研究。
2材料与方法(MaterialsandMethods)
2．1材料
聚球藻(Synechococcussp．PCC7942)由本实验
室保存。
生长培养基：BG．1培养基【61。
诱导培养基：改进的BG．1l培养基，以等当量
的NH4CI代替NaN03，并加入1．5％(w／v)的葡萄糖，
pH8．0。
2．2藻的培养及诱导
将聚球藻接种于生长培养基，28℃连续光照、通
气培养两周后，离心收集藻体，以诱导培养基洗涤两
次，将藻细胞悬浮于适量诱导培养基中，放入血清瓶，
抽充氩气，密闭，于40"C、黑暗条件下诱导一天，
之后离心收集藻体，以无菌水洗涤两次，藻泥于．20℃
保存备用。
2．3氢酶纯化
湿藻泥用h2．5(w／v)的50mmol·L～Tris．HCI
缓冲液(pH8．5)悬浮，充分搅拌，加入1nag·mLd
溶菌酶，37℃水浴处理lh。加入2mmol·L。1二硫苏
糖醇(DTT)，冰浴超声破碎(800W，超声5s，间隔
5 s)，超声时间为2．5min／g藻。破碎液于4"C、
100，000xg离心1h，上清即为粗酶液。
DEAE-SepharoscFF离子交换柱(2．7x13．5cm)
预先以50mmol·L1Tris．HCl缓冲液(pH7．5)平衡，
以粗酶液上样，同样的缓冲液洗脱未结合蛋白，之后
分别以含0．1tool·L．1和0．2moloL"1NaCl的缓冲液洗
脱。合并有氢酶活性的洗脱液，室温下以饱和硫酸铵
溶液沉淀2h，10，000xg离心10min，去上清，沉淀
以少量缓冲液溶解作为疏水柱层析的样品。
Butyl．Scpharose4FF疏水柱(2．7x4cm)预先以
含2tool·L～(NH4)2S04的50mmol·L～"Iris．HCl缓冲
液(pH7．5)平衡，上样，先以含2tool·L‘1(NH4)2S04
的缓冲液洗脱未结合蛋白，之后进行2"-0tool·L．1
(sn4)2SO。的线性梯度洗脱。合并有活性的洗脱液，
以截留分子量为10kDa的超滤离心管进行浓缩(4℃，
5800xg)，至样品体积小于500皿，作为凝胶柱层析
的样品。
SephacrylS．200凝胶柱(1．6x63era)预先以
50mmol·L～Tris．HCI缓冲液(pH7．5)平衡，上样，
以同样的缓冲液洗脱一个柱体积，收集氢酶活性最高
的洗脱液。纯化的氢酶于．20℃保存。
2．4氢酶活性测定
主要测定放氢活性。反应在有效容积为5mL
的真空采血管中进行，反应体积为2mL，缓冲液为
50mmol·L～Tris．HCl(pH7．5)，体系中含1．5mmol·L
甲基紫精(MV)和25mmol·L．1Na2S204，抽充氩气，
于50℃水浴反应30min，以气相色谱检测上层气相
中的氢气。不含氢酶的反应体系为空白对照。50℃，
反应30rain产生1pmol氢气的酶量定义为一个氢酶
活性单位。
2．5氢酶催化放氢的影响因素实验
2．5．1温度实验
反应体系同氢酶活性测定，分别于20，30，40，
50，60，70℃反应30min，以气相色谱检测上层气相
中的氢气。
2．5．2pH实验
反应体系中的缓冲液均为50mmol·L～Tris-HCl，
p 分别为7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，其余同氢酶活性
万方数据
4期 徐惠娟，等：聚球藻PCC7942氢酶的分离纯化及特性研究 229
测定，50℃下反应30rain，以气相色谱检测上层气相
中的氢气。
2．5．3电子载体实验
反应体系中的电子载体分别为甲基紫精
(MV),NADR苄基紫精(BV)和NADH，浓度均
为1．5mmol·L-1，其余同氢酶活性测定，50℃下反应，
定期以气相色谱检测上层气相中的氢气。
2．6蛋白质含量测定
采用考马斯亮兰法f71。
2．7主要化学试剂
Na2S204，苄基紫精和NADH为sigma公司产品，
NADP购自Amresco公司，甲基紫精购自中国百灵威
公司，DEAE-sepharoseFF，Butyl．scpharosc4FF和
ScphacrylS-200均为Phannacia公司产品。
3结果与分析(ResultsandAnalysis)
3．1纯化结果
从藻细胞中提取氢酶，通常采用高压匀浆或珠磨
的方法破碎细胞【4’8,91。本文研究了超声波处理法在聚
球藻PCC7942上的应用。由于超声破碎法受到功率、
处理时间、细胞浓度和菌种类型的影响，对聚球藻
PCC7942的破碎效果不太理想。经过改进，在超声
破碎之前增加溶菌酶的处理过程，获得了稳定而有效
的破碎效果。溶菌酶分子量较小，且用量少，易分离，
不影响氢酶的纯化。
第一步离子交换层析能除去大量的杂蛋白，再经
过疏水层析和凝胶层析，氢酶被纯化了218倍，得率
为6．5％，比活为1．46U．na91蛋白。纯化结果如表l
所示。
通常认为蓝藻中既可催化吸氢又可催化放氢的
双向氢酶由NiFe氢化酶和心肌黄酶两部分组成，
其中NiFe氢化酶包含HoxY和HoxH两个亚基，心
肌黄酶部分的两个亚基为HoxF和HoxU。后来
Schmitz等人研究发现，心肌黄酶还包含第三个亚基
HoxE，蓝藻的双向氢酶是个五聚体(Ho)【EFUYH)
[9-¨】。聚球藻PCC7942纯化氢酶的SDS．PAGE结果
如图l。
图1纯化氢酶的SDS-PAGE图谱
FigelSDS-PAGEofpurifiedhy rogenase
从图上可以看到五条明显的蛋白条带，分子量大
约为83kDa，60kDa，47kDa，30kDa和27kDa。Schmitz
等人对Synechococcussp．PCC6301的氢酶进行了分
离纯化【91，纯化氢酶的SDS．PAGE图显示六条蛋白
带，其中的五个蛋白分别为氢酶的HoxF，HoxH，
HoxU，HoxY和HoxE亚基。SynechOCOCCU$sp．PCC
7942与Synechococcussp．PCC6301同为聚球藻属
(Synechococcus)。它们的氢酶应该有相似之处。比
较二者氢酶的SDS．PAGE图谱，发现其中有四条蛋
白的分子量非常接近，因此推测60kDa，47kDa，
30kDa和27kDa对应的蛋白分别为聚球藻PCC7942
万方数据
氢酶的HoxF，HoxH，HoxU和HoxY亚基，而83kDa
的条带为一未知蛋白。聚球藻PCC7942的氢酶是否
也由HoxEFUYH五个亚基组成，它与聚球藻PCC
6301的氢酶差别多大，该问题有待进一步验证。
3．2温度和pH对氢酶催化放氢的影响
温度和pH是影响氢酶活性的重要因素。本研究
发现，较高的温度有利于聚球藻PCC7942的氢酶催
化放氢，其最适温度为50℃(图2)。聚球藻PCC7942
氢酶催化放氢的最适pH为pH8．O(图3)，与Spirulina
platensis和Chlorococcumittorale氢酶的最适pH值
(pH7．5)接近。
备
日
g
要舍
；昙
邑
一
辅
疆
20 30 40 50 60 70
温度Tetr妒(℃)
图2温度对氢酶催化放氢的影响
rigaEffectoftemperature011Hz-evolutioncatalyzedby
hydrogenase
备
电
g
鼋重
邑
啊
桶
罄
7 7．5 8 8，5 9
pH
图3pH对氢酶催化放氢的影响
Flg．3EffectofpHORH2-evolutioncatalyzedbyhydrogenase
3．3氢酶的电子载体
当合适的电子载体存在时，氢酶在体外也能催化
放氢。本文研究了几种天然和人工的电子载体对聚球
藻PCC7942氢酶催化放氢的影响，反应体系中均加
入Na2S204以除去微量溶氧并使电子载体处于还原
态。结果表明，还原态的甲基紫精(MV)是聚球藻
PCC7942氢酶的最佳电子供体(表2)。以苄基紫精
(BV)或NADP做电子载体，氢酶的放氢活性大大
降低，而NADH下未能检测到放氢活性。氢酶以
NADP或NADH为电子载体的低放氢活性，可能是
因为体外放氢的反应条件不适合这两种电子载体。
表2不同电子载体下聚球藻PCC7942氢酶的放氢活性
Table2 H2-evolutionactivityofthehydrogenasefrom
SynechococcusspPCC7942withdifferentelectroncarriers
电子载体
Electroncarrier
相对活性Relativeactivity
(％)
3．4氢酶的稳定性
大多数氢酶的纯化过程都在厌氧环境下进行，有
的还需要严格的厌氧条件，所用试剂及设备均需充入
无氧气体，而且纯化过程中通常保持低温(4℃)。本
论文聚球藻PCC7942氢酶的分离纯化都在空气环境
下进行，相关的试剂与设备均未进行无氧处理，且基
本上在室温下操作。经过多步分离纯化之后，仍然能
检测到较高的氢酶活性。此外，纯化的氢酶在．20℃
下保存5d活性几乎未损失。以上结果说明聚球藻
PCC7942的氢酶比较稳定，对氧不是特别敏感，可
在一般空气环境下分离。
4讨论(Discussion)
蓝藻中的固氮酶和双向氢酶都能催化产氢，在非
固氮情况下的产氢主要是由双向氢酶催化的。固氮酶
催化产氢需要ATP的参与，而氢酶不需要，且双向
氢酶一般为可溶性的。本研究预先在铵盐培养基、厌
氧(氩气)黑暗条件下诱导聚球藻PCC7942产氢，
其后以超声法破碎细胞，经超速离心去除细胞碎片，
获得的酶液在合适的电子载体存在时即可催化产氢，
说明分离纯化的为可溶性的双向氢酶。
本研究建立了在室温、空气环境下分离纯化聚球
藻PCC7942氢酶的方法，操作过程简单。当然，纯
饽M¨他¨∞∞舛吃0
0
O
0
O
O
O
0
0
埔M¨他¨∞∞舛吃0
0
0
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0
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0
O
万方数据
4期 徐惠娟，等：聚球藻PCC7942氢酶的分离纯化及特性研究 23l
化过程中为了保持更高酶活，仍应尽可能减少酶液曝
氧的时间，此外在超声破碎时，加入一定的蛋白保护
剂(2mmol·LdDTT)，对氢酶也能起到一定的保护
作用。
蓝藻的固氮酶产氢需要大量的ATP，产氢效率不
高，双向氢酶则对氧敏感，限制了蓝藻产氢的应用。
本研究发现聚球藻PCC7942的双向氢酶对氧不甚敏
感，在室温下也比较稳定，因而对其分子组成和结构
等深入研究后，可望有进一步研究应用前景。
参考文献(References)
AdamsMWWMortensonLE，ChenJ S．1981．
rlydrogenases[J]．Biochimicaet p ysAct ,
594：105．176．
VignaisPM，BilloudB，MeyerJ．2001．Classification
andphylogenyofhydrogenase[／]．FEATSMicrobiology
Reviews，25：455·501．
陈浩源，陈兆平，程双奇，等．1997．螺旋藻氢酶的纯
化与生化特性明．水生生物学报， 21(2)：123—130．
UenoYKuranoN，MiyachiS．1999．Purificationand
characterizationofhydrogenasefromthmarinegreen
alga,Chlorococcumlittorale[J]．FEBSLetters,
443：144_148．
KampC，SilakovA，WinklcrM，eta／．2008．Isolation
and firstEPRcharaeteri盟tionof the
[FeFe]-hydrogenasesfromgreenalgae[J]．Biochimicaet
BiophysicaActa．1777：410416．
16lRippkaRDeruellesJ’WaterburyJB，甜a／．1979．
Ganerieassignments，sllainhistoriesndpropertiesof
pureculturesofcyanobacteria[J]．JournalofGeneral
Microbiology，111：1-61．
f71BradfordMM．1976．Arapidandsensitivemethodf r
thequantizationofmicrogramqu ntitiesofprotein
utilizingtheprincipleofprotein-dyebinding[J]．
AnalyticalBiochemistry，72：248—254．
18】8 BhosaleSH，PantAKhanMI．Purificationand
characterizationof putativealkaline[Ni-Fe】
hydrogenasefromunicellularnlarinegreenalga,
TetraselmiskochinensisNCIM1605[J]．Microbiological
Research，Articleinpress．
19l Schmi乜0，BoisonGSalzmannEeta／．2002．HoxE-a
subunitspecificforthepentamericbidirectional
hydrogenasecomplex(HoxEFUYI-Dofcyanobacteria[J]．
BiochimicaetBiophysicaActa,1554：66-74．
1101Schmitz0，Boison13IHilscherKta／．1995．Molecular
biologicalanalysisofa bidirectionalhydrogena∞from
cyanobaeteria[j]．EuropeanJournalofBiochemistry,
233(1)：266·276．
【11lBoisonGBotheH，Schmitz0．2000．Transcriptional
analysisofhydrogenasegenesin thecyanobacteria
Anacystisnidulansa dAnabaenavariabilismonitoredby
RT-PCR[J]．Currentmicrobiology,40：315—321．
Ⅲ
嘲
i5c
Ⅲ
四
万方数据
聚球藻PCC 7942氢酶的分离纯化及特性研究
作者： 徐惠娟， 邬小兵， 李筱泉， 龙敏南， 梁世中， XU Hui-juan， WU Xiao-bing， LI
Xiao-quan， LONG Min-nan， LIANG Shi-zhong
作者单位： 徐惠娟,邬小兵,李筱泉,龙敏南,XU Hui-juan,WU Xiao-bing,LI Xiao-quan,LONG Min-
nan(厦门大学生命科学学院,厦门,361005)， 梁世中,LIANG Shi-zhong(华南理工大学生物
科学与工程学院,广州,510006)
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2008,27(4)

参考文献(11条)
1.Schmitz O;Boison G;Salzmann H HoxE-a subunit specific for the pentameric bidirectional hydrogenase
complex (HoxEFUYH) of cyanobacteria[外文期刊] 2002(1/2)
2.Bhosale S H;Pant A;Khan M I Purification and characterization of putative alkaline[Ni-
Fe]hydrogenase from unicellular marine green alga,Tetraselmis kochinensis NCIM 1605
3.Bradford M M A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding[外文期刊] 1976
4.Rippka R;Deruelles J;Waterbury J B Generic assignments,strain histories and properties of pure
cultures of cyanobacteria 1979
5.Kamp C;Silakov A;Winkler M Isolation and first EPR characterization of the[FeFe]-hydrogenases from
green algae[外文期刊] 2008(5)
6.Ueno Y;Kurano N;Miyachi S Purification and characterization of hydrogenase from the marine green
alga,Chlorococcum littorale[外文期刊] 1999(2)
7.陈浩源;陈兆平;程双奇 螺旋藻氢酶的纯化与生化特性 1997(02)
8.Vignais P M;Billond B;Meyer J Classification and phylogeny of hydrogenase 2001
9.Boison G;Bothe H;Schrnitz O Transcriptional analysis of hydrogenase genes in the cyanobacteria
Anacystis nidulans and Anabaena variabilis monitored by RT-PCR[外文期刊] 2000(5)
10.Schmitz O;Boison G;Hilscher R Molecular biological analysis of a bidirectional hydrogenase from
cyanobacteria[外文期刊] 1995(01)
11.Adams M W W;Mortenson L E;Chen J S Hydrogenases 1981

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