全 文 ：第 33卷 第 4期 生 态 科 学 33(4): 735−740
2014 年 7 月 Ecological Science Jul. 2014

收稿日期: 2013-09-09; 修订日期: 2014-01-16
作者简介: 陈桐生(1978—), 男, 硕士, 工程师, 主要从事环境影响评价技术及生态研究, chentongsheng@scies.org
*通信作者: 刘伟民, 男, 硕士, 从事环境规划及环境影响评价研究, liuweimin@scies.org.com

陈桐生, 刘伟民, 黄报远, 等. 除臭生物滤池稳定运行期的微生物生态 DNA 指纹研究[J]. 生态科学, 2014, 33(4): 735−740.
CHEN Tongsheng, LIU Weimin, HUANG Baoyuan, et al. Assessment of changes in microbial ecology during steady operation of
deodor- biofilter by DNA fingerprint[J]. Ecological Science, 2014, 33(4): 735−740.

除臭生物滤池稳定运行期的微生物生态DNA指纹研究
陈桐生, 刘伟民*, 黄报远, 杨婧, 陈涵毅
环境保护部华南环境科学研究所, 广州 510655

【摘要】 采用 DNA 指纹方法研究除臭生物滤池稳定运行期的微生物种群的动态变化, 通过扩增不同阶段的细菌 16S
rRNA 基因的 V3 可变区, 结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析除臭生物滤池的生物种群的结构变化, 并回收主要
的 DNA 片段, 采用 PCR 测序, 并与 NCBI 进行比对。结果表明, 不同阶段的除臭生物滤池, 微生物的多样性及其丰度
存在较大差别, DNA 指纹图谱存在明显差异, 同时在滤池的不同层次上也表现出明显的空间多样性, 序列比对显示硫
氧化细菌在除臭系统稳定运行期占有优势地位。这些研究为更好的处理恶臭气体提供可靠的科学依据, 同时也为生物
除臭的应用提供一定的理论基础。

关键词：生物滤池; 微生物生态; DNA 指纹; 变性梯度凝胶电泳
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2014.04.016 中图分类号： Q938.1 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2014)04-735-06
Assessment of changes in microbial ecology during steady operation of deodor-
biofilter by DNA fingerprint
CHEN Tongsheng, LIU Weimin*, HUANG Baoyuan, YANG Jing, CHEN Hanyi
South China Institute Of Environmental Sciences. MEP 510655, China
Abstract: DNA fingerprint methods were applied to analyze the genetic diversity of microbe community during steady
operation of deodor-biofilter. Polymerase Chain Reaction amplified V3 variable fragments of genes coding for 16S rRNA in
different stages. The structural changes of microbial population composition in deodorant biofilter were analyzed using
PCR-DGGE combined technique. Then DNA fragment was recovered using PCR sequencing, and compared with the NCBI.
The results indicated that there were prominent differences in microbial diversity and abundance in different stages. It
demonstrated the obvious distinction of spacial diversity in different biofilter bed as well. PCR sequencing results showed
that the sulfur-oxidizing bacteria were the predominant population in deodor-system. The research offers the valid scientific
basis for better treatment of odorant gas and the theoretical foundation for application of bio-deodorization.
Key words: biofilter; microbial ecology; DNA fingerprint; DGGE
1 引言
自二十世纪 20 年代, 生物过滤法已经应用于处
理异味及各种挥发性有机化合物和无机化合物的废
气污染物, 也应用于不同的污水处理厂、固体废物
处理厂、食品加工厂等行业的除臭处理[1]。目前, 对
生物滤池可能涉及的反应器设计、填充材料、动力
学和其他物化因子(如温度、湿度、pH 值等), 已进
行了相关的调查研究[2–7], 以优化生物滤池的运行技
术参数。然而, 有研究指出, 微生物生态种群结构的
736 生 态 科 学 33 卷
监控分析是优化生物滤池性能的有效途径之一, 而
详细的生物信息对于除臭系统进一步提高去除效率
和长期稳定运行十分必要。
生物技术的兴起与发展为微生物生态学的研究
提供了一种强有力手段和工具, 也给生物除臭系统
微生物种群结构的研究带来契机, 分子生物学技术
作为一种快速高效的方法, 已广泛应用于废水生物
滤池反应器、甲苯降解生物滤池、苯酚降解间歇式
反应器、氨生物滤池, 苯乙烯降解生物滴滤塔和
MEK 降解生物滤池的微生物种群结构研究[8]。
在我国, 对微生物生态学研究大多是采用传统
的培养分离及检测方法, PCR-DGGE 技术大多应用
于医学领域对突变基因的研究。2002 年开始, 陆续
有学者应用 DGGE 等分子生物学手段对微生物生态
进行研究[9–12], 但在除臭生物滤池微生物生态方面
报道甚少。
本研究利用城市生活污水处理厂顺式生物滤池
除臭的中试装置, 利用 DNA 指纹分析技术, 通过
PCR-DGGE 方法, 结合 16S rDNA 序列分析及生物
信息学手段, 在国内首次对除臭生物滤池的微生物
生态进行研究, 分析除臭系统稳定运行期间微生物
群落结构在时间及空间上的差异分布, 为优化恶臭
处理条件提供有益的科学依据, 同时也为生物除臭
的应用研究提供一定的理论基础。
2 材料和方法
2.1 生物滤池结构
采用顺流式运行方式, 恶臭气体与喷淋水从生
物滤池上部进入, 通过生物填料吸收处理后从生物
滤池下部排放。生物滤池结构见图 1。
2.2 样品采集
空白填料样品采集一次, 滤池稳定运行过程中
分别对上、中、下层采样, 共 5 次, 合计 16 个样品,
同时检测进气及出气的 H2S 气体浓度, 滤池渗滤水
的 pH 值, 并记录当天温度, 采集样品除需要进行
活菌计数外, 其余及时保存于–20℃冰箱。如表 1
所示。
2.3 DNA 抽提
称取滤料 10 g, 加入 20 mL PBS(Ph 7.4), 充分
振荡 10 min, 6 000 g 室温离心 10 min, 弃上清, 重复
两次。加入 13.5 mLDNA 抽提 buffer[100 mM Tris-
HCl (pH 8.0), 100 mM Na2-EDTA(pH 8.0), 100 mM
磷酸盐缓冲液(pH 8.0), 1.5 mM NaCl, 1%CTAB],
50 μL 蛋白酶 K(10 mg·ml−1)。将三角瓶放置于 37 ℃,
200 rpm 摇床 30 min。加入 1.5 mL 20 % SDS, 65 ℃
水浴 2 h,每隔 15—20 min 颠倒摇匀。6 000 g 室温离
心 10 min 后取上清液。加入等体积氯仿/异戊醇
(24:1), 6 000 g室温离心10 min, 取上清, 重复抽提 2
次; 再加入 0.6 倍体积的异丙醇, 室温放置 1 h 或更
长。16 000 g 室温离心 20 min, 沉淀溶于 300 μL 超
纯水, 使用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测[13]。
2.4 PCR 优化及扩增
2.4.1 梯度 PCR
为确定最适退火温度, 将抽提所得总DNA中的
一种适当稀释后作为模板, 使用 16S rDNA 中 V3 区
特异性引物[14], 梯度PCR 仪(PTC200)扩增目的片段。每
100 μL 反应体系中正反向引物浓度为 0.1 μmol/L, 每

图 1 生物滤池结构图
Fig. 1 The structure of biofilter
表 1 不同采样时间生物滤池运行参数
Tab.1 Conditions during the operation of biofilter
时间 pH 温度(℃) H2S 进气浓度(mg · mL – 1 ) H2S 出气浓度 (mg · mL – 1 ) H2S 去除率(%)
08.17 2~3 32 6.11 0.07 99
09.24 2~3 37 2.68 0 100
10.22 6.5~7.5 30 2.19 0.01 99
11.25 6.5~7.5 25 3.62 0 100
12.17 6.5~7.5 20 4.45 0.02 99.5
4 期 陈桐生, 等. 除臭生物滤池稳定运行期的微生物生态 DNA 指纹研究 737
种 dNTP 的浓度为 0.2 mmol·L−1, Taq 酶含量为 5 U。
PCR 反应条件为 94 ℃预变性 5 min, 循环条件为
94℃变性 30s, 55 ℃—65 ℃梯度区间设计八个退火
温度退火, 72 ℃延伸 30 s, 反应 30 循环, 最终 72 ℃
延伸 7 min。扩增产物采用 1.5%琼脂糖分析检验。
2.4.2 PCR 扩增 V3 可变区
根据梯度 PCR 结果, 选择 62 ℃作为退火温度,
其它条件参照梯度 PCR, 并设置阴性对照。
2.5 DGGE 分析
PCR产物浓缩后 , 采用D-Code突变检测系统
(Bio-Rad, Hercules, Calif.)进行DGGE分析。所用的聚
丙烯酰胺凝胶浓度为 10%, 变性梯度为 30%—
60%(尿素为7 mol·L−1 甲酰胺为40%时为100%变
性浓度), 180 V恒温电泳4.5 h, GoldView染料染色
30 min, UVI成像系统分析结果。
2.6 DNA 回收测序
参照分子克隆实验指南(第三版)回收目的条带
中的 DNA(15)。将回收所得 DNA 进行 PCR 扩增, 条
件参照 1.2.4, 扩增产物送由上海博亚生物公司测序。
2.7 DGGE 图谱多样性分析
使用VUIBAND 97软件, 对DGGE图谱的条带
进行自动检测和定量分析, 计算其相似系数, 公式
为Cs=2j/(a+b)。公式中a、b表示两个比较对象中的
DNA条带数目, j表示a和b中相同的条带数量, Cs值
为0时表示完全不同, Cs值为1时表示不存在差异。
3 结果
3.1 PCR 条件优化
退火温度是影响 PCR 产物的重要因素, 适当的
温度可以提高产物的质量, 减少非特异性扩增反
应。梯度 PCR 产物的结果如图 2 所示, 结果清晰表
明, 不同退火温度在 250 bp 附近都出现了目的条带,
但 62.4 ℃对应的产物没有非特异带出现, 且条带信
号明显强于其他退火温度。
3.2 微生物群落的 DNA 指纹分析
提取采集样品的总 DNA, PCR 扩增 V3 区后进
行 DGGE 分析, 结果如图 3 所示。L1 为生物滤池运
行前的样品, L2—L16 分别为生物滤池在连续稳定
运行 5 个月期间所采集的样品。DGGE 图谱基本上
可分成两部分, L2—L7 为酸性条件下图谱指纹,
L8-L16 为中性条件下图谱指纹, 条带亮度直观反映
微生物的丰度。从 DNA 指纹图谱可以看出, 不同条
件下填料中微生物有自己的特征条带结构, L1 条带

图 2 梯度 PCR V3 区扩增片段
Fig. 2 V3 fragment amplified by gradient PCR

图 3 除臭生物滤池稳定运行期的微生物群落结构变化
Fig. 3 The changes in microbial communities during steady operation of deodor-biofilter
L1: 空白样品; L2-L4: 08.17 样品, 其中 L2 为上层、L3 为中层、L4 为下层; L5-L7: 09.23 样品, 其中 L5 为上层、L6 为中层、L7 为下层; L8-L10:
10.22 样品, 其中 L8 为上层、L9 为中层、L10 为下层; L11-L13: 11.25 样品, 其中 L11 为上层、L12 为中层、L13 为下层; L14-L16: 12.17 样品,
其中 L14 为上层、L15 为中层、L16 为下层.
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为空白样品, 也即未运行的填料, 微生物丰度相对
均匀, 未形成明显优势菌群。L2—L7 为生物滤池运
行的前期酸性条件下, 微生物多样性较少而丰度较
高, 其中 L2、L5 条带代表上层样品, 有明显的特征
条带, 与下层样品图谱形状有明显差异。L8—L16
为后期的中性条件下微生物分布, 其多样性较高,
丰度较为平均。
3.3 图谱相似性及聚类分析
使用VUIBAND 97分析软件直接对DGGE图谱
进行相似性分析, 表 2 中数据直接由计算机生成,
表示电泳图中各泳道的相似度, 反映了不同时期不
同空间的微生物种群组成的差异, 当 Cs 值为 0 时表
示完全不同, Cs 值为 1 时表示不存在差异。从表 2
可以看出, 不同条带间相似度最大的为 L6、L7 条带,
Cs 值为 1, 表示其完全一致, 其次 L2 和 L5、L8 和
L9 L5 和 L6 等的相似度较高, Cs 值均超过 0.75。为
更加直观反应各泳道样品之间的差异性, 使用专业
软件对DNA泳道条带进行聚类分析, 生成聚类分析
图, 如图 4 所示。
3.4 测序分析
选取具有代表性和特异性的 DNA 条带 1、2、3、
8、9、a、f、h、j、L、I 切胶回收 DNA 片段后再进
行 PCR 扩增, 将产物直接测序, 并在表 3 列出了所
得序列与 NCBI 比对结果显示最高亲缘关系的细菌
名称。从表 3 可以看出, 条带 3、j、L 与数据库中已
有序列比对结果相似性为 100%, 从其命名可以看
表 2 稳定运行期微生物种群的 Cs值
Tab. 2 Cs values of microbial population during steady operation
L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16
L1 1.00
L2 0.50 1.00
L3 0.55 0.73 1.00
L4 0.62 0.55 0.80 1.00
L5 0.36 0.77 0.67 0.50 1.00
L6 0.40 0.60 0.67 0.55 0.89 1.00
L7 0.20 0.60 0.67 0.55 0.89 1.00 1.00
L8 0.55 0.55 0.60 0.67 0.60 0.67 0.67 1.00
L9 0.55 0.36 0.40 0.50 0.40 0.44 0.44 0.80 1.00
L10 0.55 0.55 0.60 0.67 0.60 0.67 0.67 0.80 0.60 1.00
L11 0.40 0.40 0.44 0.55 0.67 0.75 0.75 0.44 0.67 0.44 1.00
L12 0.40 0.53 0.57 0.50 0.57 0.62 0.62 0.43 0.43 0.43 0.62 1.00
L13 0.36 0.55 0.60 0.67 0.60 0.89 0.89 0.80 0.60 0.80 0.67 0.57 1.00
L14 0.20 0.40 0.44 0.73 0.44 0.75 0.75 0.67 0.44 0.67 0.50 0.62 0.67 1.00
L15 0.44 0.44 0.50 0.60 0.50 0.86 0.86 0.75 0.50 0.75 0.57 0.50 0.75 0.57 1.00
L16 0.36 0.55 0.60 0.33 0.80 0.67 0.67 0.60 0.60 0.60 0.67 0.43 0.80 0.44 0.50 1.00

图 4 DGGE 泳道的聚类分析
Fig. 4 The cluster analysis of land in DGGE
4 期 陈桐生, 等. 除臭生物滤池稳定运行期的微生物生态 DNA 指纹研究 739
表 3 DGGE 中回收的目标 DNA 片段序列比对结果
Tab. 3 Sequence similarity between the DGGE bands and those of the closest relatives in the database
Band Closest relative Accession no. Similarity(%)
1 Acidithiobacillus thiooxidans AF359940 99
2 Acidithiobacillus thiooxidans AF359940 99
3 Uncultured Acidithiobacillus sp. K13 AF460982 100
8 Uncultured bacterium AY678243 98
9 Uncultured gamma proteobacterium AY044007 97
a Thiomonas sp. NO115 AY455807 97
f Hyphomicrobium sp. P2 AF148858 99
h Methylobacterium extorquens AY460189 97
j Uncultured soil bacterium AY242697 100
L Uncultured Acidithiobacillus sp. K13 AF460982 100
I Uncultured gamma proteobacterium AY044007 97

出, 均为未培养微生物, 显示出 PCR-DGGE 技术在
分子生态学分析上具有一定的优越性, 特别是对于
未培养或不可培养微生物的分析检测, 有较明显的
优势。
4 讨论
4.1 pH 对微生物生态结构的影响
随着生物滤池的运行, 微生物生态结构发生了
相应的变化。滤池运行前的样品 L1 与运行后的样品
的DGGE图谱(图 3)差别十分明显, L1与其他泳道的
相似性也很低, 最高只达到 0.62, 而最低则为 0.2, 并
且没有明显的优势菌群。
生物滤池在不同的 pH 条件下运作时, 微生物
的多样性及其丰度存在较大差别。总的来说, 强酸
性相对中性而言对微生物具有较高的选择压力, 微
生物群落结构相对比较简单, 多样性较低, 但个别
菌群却出现较高的丰度, 这从条带 3、4、a、p 中可
以明显看出, 说明随着运行的深入, 这几类细菌形
成酸性条件下的绝对优势种。而中性环境下的多样
性则较为丰富, 分布也相对均匀。与 NCBI 的序列比
对结果显示, 条带 1、3 与 Acidithiobacillus thiooxidans
和 Uncultured Acidithiobacillus K13 的相似性分别为
99%和 100%, 有极高的相似性, 条带 8 与 Uncultured
bacterium 的同源性为 98%。从生物信息学分析的结
果来看, 强酸性时除臭生物滤池的微生物种类以硫
氧化细菌为主, 并且 Acidithiobacillus 占有优势地
位。在这种具有强选择压力的环境下, 也必然会形
成能以 H2S 作为能源生长并且可以耐酸的细菌占种
群优势, 与信息学分析结果很好的吻合。González-
Toril[16]等人采用 DGGE 对极度酸性且含有高浓度
的硫化物的河流微生物生态进行研究, 也得出相
似结论。
4.2 温度对微生物生态结构的影响
此次中试结果显示, 虽然外界温度(20—37℃)
对多样性的影响不大, 但由于运行过程中微生物的
生长速度与温度有关, 因此丰度会发生相应的变
化。如图 3 中 L2—L10 图谱所示, 其所代表的样品
采样时温度较高, 微生物繁殖速度较快, 图谱条带
较亮, 也即丰度较高, 如 A1、A2、A6、3、4 等条带
所示。L11—L16 所代表的样品采样时温度相对较低,
微生物种群的丰度较为平均, 除条带 L、I、T 较亮
外, 其他条带亮度都比较均匀, 可能是由此时的气
温较低, 微生物生长速率减低, 并且处于稳定的中
性运行条件下, 选择压力不大而造成的。
4.3 空间分布对微生物生态结构影响
进气方式对微生物群落分布有较大影响, 本次
研究对象采用顺流式运行方式, 臭气浓度不同影响
着微生物的空间分布, 特别在酸性环境的选择压力
下, 空间分布的差异更为明显。从 DGGE 图谱中我
们可以看到, 代表酸性环境的 L2—L7 泳道, 上层填
料的微生物种群结构与中下层有明显差异, 上层填
料中优势种群明显, 丰度较高。如代表上层样品 L2、
L5 泳道, 有明显的特征条带, 特别是 A1、A2、A3、
A4、1、2、3、4 等条带, 均与中层和下层样品图谱
形状有明显差异, 产生这种空间差异可能是由于上
层微生物首先接触以 H2S 为主的恶臭气体, 细菌氧
740 生 态 科 学 33 卷
化 H2S 生成 H2SO4 的浓度较高, 对一般的细菌具有
较大的毒害作用, 从而降低了微生物种群的复杂
性。随着 H2S 浓度的降低, 对微生物的毒害作用也
相对减少, 多样性略有增加。同时循环水的间歇喷
淋作用也使部分生物膜在下层累积, 由此增加了微
生物的多样性。
这种空间分布的特异性, 对于后续的优势菌种
和高效处理菌种的筛选具有很好的指导意义, 下一
步将在上层样品中, 尝试借助 PCR-DGGE 的直观性,
引导高效及优势菌的分离研究。
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