全 文 ：生态科学2003年05月第22卷第2期 ECOLOGICSC ENCEMay·2003·2212)：j20—123
孓遗植物桫椤RAPD分析中主要反应参数的影响
李雪雁1，王 艇2，苏应娟2(1电子科技大学中山学院生物技术系．中山528402；2中山大学生命科学皖，广
州510275)
【摘要】 为得到桫拶RAPD扩增的最佳条件，对影响桫椤RAPD扩增的模板纯化方法、模板含量、酶浓度、Mg卜浓
度、dNTP浓度和引物浓度及扩增程序等多种因素进行了探讨。结果表明，用玻璃奶和蛋白酶K纯化后获得的DNA作
为模板进行RAPD反应．其扩增带比用未纯化的和仅用无水乙醇再沉淀的DNA为模板更亮，更清晰，重复性更好：模
板浓度、酶浓度、Mg“及dNTP浓度、引物浓度及退火温度这些因素都会对RAPD产生影响。经过本实验的探索，‘芷
现桫椤RAPD扩增的最佳体系是(25x10
2mL反应体积)：模板浓度为70ng，Mgn浓度为2．5mmol·L1，dNTP勺
0．2mmol·L1，引物3×IO～mL；最佳扩增程序为：94℃200s，一个循环；94℃60s，36℃60s，72℃120s，40t循坷、：
72℃60(}s，一个循环；4_c保存。
关键词：桫椤；RAPD；反应参数
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1008—8873(2003)02—120-04
Theffectsofseveralampli矗cationeonditiomOilRAPDamplificationforAla philaspinu如snfUXue-yan1．WANG
Tin92，SUYing-juan2(1DepartmentofBiotechnologyofZhongshanCollege，UniversityofElectronicSc encemid
TechnologyofChina．Zhongshan52840212．SchoolofLifeScieoces，ZhongshanUniversity,Guangzhou510275，China)
AbstractTogetheoptialamplificationonditionsforAlsophilaspinulosa，theeffectsofthepurifiedIn—hodsofDNA
templatesndtheconcentratiortsofDNAtemplates．TaqDNApolymerase,magesium，primerandNTParetestedThe
resultssuggest：thepurifiedtemplatesbyglassmilkorproteinaseKarebrighter,clearerandmo peatablethalltheunpudficd
templatesorprecipitatedemplatesby thanol；theconcentrgfionofDNAtemplates，TaqDNApolymerase，magesium，
primerandNTPwillinfluence山eproducdonsofRAPD．TheoptimalamplificationonditionsforAlsphilaspinulosais
acquiredthroughthexperiments：theconcentrationofDNAtemplatesis70ng，theconcentrationofmag esiumis25
r／wTlo]．L1．dNTPis02mm01．L-1。primeris3×】0’4JnLTheopticalamplifica60)1programislSOobtained：94·200s，I
cycle：94’C60s．36℃60s；72℃120s，40cycle；72℃600s，1cycle；storedin4X、
Keywords：AlsophHaspinulosa；RAPD；Amplificationcond t ons
桫锣 (Alsophilaspinulosa(Wsll．exHook )
Troyon)亦称树蕨、水桫椤，系古老的冰川前孓遗植
物，被称为“活化石”。它属渐危种，已列入国家一级
保护植物”l。其属桫椤科植物，是少数几种树形蕨类
植物之一。现在对其研究多为形态学解剖学方面，迄
今鲜见有分子生物学方面的研究报道。本实验试验了
影响RAPD分析中DNA扩增的几个主要因素：模板
DNA的质和量，酶浓度．镁离子浓度．脱氧核苷三磷
酸(dNIP)浓度，引物浓度及扩增程序。目的是为试
验出对桫椤的种群多样性研究进行RAPD分析较理想
的条件．
1材料与方法
1．1材料
桫椤采自深圳南山。酶、Buffer、镁离子、dNTP、
引物均购自上海生工；EcoRI+HindllIMarker购自
华美生物工程公司；PCR仪为德国BiomeⅡaUNO11
型：可见紫外分光光度计为Pharmacia公司生产的
URrospec2000。
1．2方法
I．2．I RAPD反应条件RAPD程序固定为：94‘C200
s。一个循环；94℃60s；36。C60s；72。c120s，40个循环；
72‘C600s，一个循环；4℃保存。RAPD反应总体积为
2．5x10-2mL。
1 2．2 DNA的提取及纯化采用CTAB法“1提取总
DNA。用三种方法纯化DNA。(1)用2倍无水己醇
和10％的乙酸钠再沉淀。(2)用玻璃奶试剂盒纯化。
(3)加0．1mg·mL-1蛋白酶K及O．5％SDS消化过夜
后，再用酚抽提，2倍无水乙醇和10％的乙酸钠沉淀。
I．2．3模板浓度梯度对RAPD扩增的影响每个反应
中模板的量分别为：小于lo、15、25、35、50、70、
100、195ng。
1．24酶浓度梯度对RAPD扩增的影响每个眨应中
酶浓度分别为：o．5、0．8、1．0、1．2、1．5、1．8、2．0、
基盘项目：国家自然科学基金资助项日(30170101．30170789)r求
古自然科学基金赍助项目(们11251
作者简介!李葺雁～I昕6一)．血，助教。现从事植物生化与；}子生物学研究。g-mail：龇ahco．com．cn
2003-01．24收稿．2003-05·03接受
万方数据
李雪雁，等：孓遗植物桫椤RAPD分析中主要反应参数的影响
2．2、2．5U。
1．2．5镁离IF浓度梯度对RAPD扩增的影响每个反
应中镁离予浓度分别为：1．0、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0
Hml01·11，
1．2．6 dNTP浓度梯度和Mg“浓度对RAPD扩增的影
响第一组M￡“浓度固定在2．0mmol·L一，每个反
应中dNTP分别为：3、4、5、6、7×Io。4mL(四种
脱氧核苷酸的浓度均为10mmol·L。1)。第二组Mg”
浓度同定在2．5mmol·L1。，每个反应中dNTP分别为：
3、4、5、6、7×10一mL，四种脱氧核苷酸的浓度均
为10mmol-L_1。
1．2．7引物浓度梯度对RAPD扩增的影响每个反应
中引物的量分别为：2、3、4、5、6、7x104mL。以
t扩增反应除变量外，其余的试剂的反应条件为：模
板含量70ng．1xTaq酶buffer，0．2mmol-U1dNTP，
2．5mmoI·L‘1Mg“，3x104rnL引物。扩增完成以后，
取2x103mL产物在1．4％琼脂糖凝胶(加EB至5×l矿
mg·mL“E，IxTAE缓冲液中电泳，稳压60V电
泳约2h，Marker作分子量标准。紫外光下梭测。
2实验结果
2．1模板纯化方法
见图1，用玻璃奶和蛋白酶K纯化后的DNA作
为模板的RAPD反应，其带比未纯化的和仅用无水乙
醇再沉淀的DNA模板更亮，更清晰，重复性更好。
蛋白酶K纯化后的DNA模板背景比玻璃奶纯化的更
淡，带更清晰。
图l模板DNA不同纯化方法的扩增效果
ng1 TheffectsofthepurIfleationmethods0fDNA
templates
： 来纯化舶DNA横板；2用无水乙醇再沉淀的DNA楼板3用玻璃奶纯化
的DNA摸板4』H蛋白酶x纯化的模板
I u坤unfledDNAtemplates；2．procipimtedDNAtemplates时elhanoL；3
precipitatedDNAtemplatesby西衄smilk；4．purifiedDNAlemplate8by
proteinaseK
2．2模板含量
见图2．以桫椤DNA为模板，模板含量从小于15
ng到195ng都有扩增，且其扩增的带型变化不大。但
是，小j：15ng时，扩增产物较少，带弱。当含艟增
加到70ng时，带清晰，背景也淡，重复性好、当含
量达到195ng时，扩增产物反而减少，带减弱和带数
减少。
闰2 模板DNA浓度对扩增带型的影响
Fig2 TheeffectsoftheCOllcentrationofDNAtemplates
1-8is：<10、15，25、35、50、70、100、195ag
2．3酶浓度
见图3，当酶浓度为0．5～10U时，扩增的带型
相似，带清晰特异性强，背景小。当所用酶量达到1．2
u及以上时，带型发生较大改变。有时带数增多且不
清晰．电泳的背景加深；有时带数又明显减少，扩增
不稳定。
图3酶浓度对扩增带型的影响
H93Theffectsoftheconc ntrationofTaqDNApolymeras
1-9is：05U、08U、1_0U，12U1 5U、l8U、20U、2U．25U
2．4 Mg“浓度
屺图4，从1．0Yflln01·L。1到3．0mmol·L。都能
得到清晰的带，带型无变化，但在2．5mmol·L“扩增
产物量大。3．5mmol·L1和4．0mmol·U1发生带型
的变化，并且随着Mg“浓度的增加．带的数鼍增加。
2．5dNTP浓度梯度和Mg“浓度
见图5，Mg“浓度为25 mmol·L11的组比2．0
mmol·L。。一组带清晰特异，背景较小。在Mg’浓度
为2．5mmol·U1的-组中，dNTP的量从3×104mL
到6×10“4mL对带型无何影响．但5×104n1Lf浓度
万方数据
生态科学
为0．2mnlol·L“‘)及6×10。4n1L(浓度为0．36
mmol-I。1，时扩增产物量增加．有些带更亮。
圈5 dNTP浓度梯度和M92+浓度对扩增带型的影响
Pig5 theffectsof heconcentrationofdNTPa dnmgesium
l一4为第·组：Mgh浓度固定在2．0mmolL-1,每个反应中dNTP
分别勾：3、4、5、6、7×10
4mL(四种脱氧核苷酸浓度均为
10mmol·L2j
5—8为第‘组．Mgh浓度固定在25mm01．L1每个反应中dNTP
分别为：3、4、5、6，7xl矿mL‘四种脱氧核苷酸浓度均为
10mmol·1。’)
1 to4isthefirstgroup：theconcentrationofmagnesiumis20
mmol·L’whiletheconcentrationofdNTParechanged：3、4、
5、6．7<104mL(cachdNTPislommol·L11
5to8isthesccondgroup．theconcentrationof inagnesiumi
25mmol·1whiletheconcenlrationofdNTParechmlged：3、
4、5、67』104mLfeachdNTPislommol·121)
2．6引物浓度
见阔6．引物从2×104mL到4×104mL扩增产
物带型相似，背景较小。随引物的量的增大，出现新
带片目背景增大，出现非特异性扩增。
27扩增程序
拶增程『芋对扩增结果产牛较大影响。如把退火温
度提高到401。C，循环数减为34，其它条件不变。结果
不能扩增出带或扩增的特异性不高，带少且不亮。
圈6不同引物浓度的扩增效果
Fig6 Theffectsoftheconcentrationfprimer
L 6is2、3、45、6、7x104rn[．
3讨论
RAPD标记自问世以来．因其自身的特点，近年
来已被广泛的应用于分子系统学研究．RAPD』目r植
物系统学研究，从方法上有独到的特点和优势．RAPD
标记可以检测物种的遗传多样性，探讨物种的亲缘关
系和进化趋势，成为植物资源保护和种质资源保仔的
依据，特别是埘濒危物种的研究更具有实际的意义。
RAPD标记技术虽具有简单，快速、灵敏度高和
多态性丰富等优点。但由于PCR对反应条件敏感，困
向榆测的重复性较差，会产生一些假象的多态惟。因
此，在应用RAPD技术之前要对对扩增体系进行优化，
以得到带型清晰，重复性好的结果。对桫椤这-珍稀
濒危蕨类植物对其RAPD反应体系进行探索，找f{j最
适反应条件尤显必要。
本实验发现，模板的质量和浓度有至关重璺的影
响。纯化以后的模板比未经纯化的模板带更亮，背景
更小，晕复性也较好。汪小全等”3认为这可能胜提取
DNA时，样品中的SDS、CTAB等去垢剂及蛋rJ沉淀
剂、乙醇或异丙醇等小分子成分未被除尽，直接影响
了Taq聚合酶的活性，而不是蛋白、RNA、和多糖(酸
性多糖除外)等大分于物质的影响。现有研究认为，
模板浓度可在一个较大的范围内变动[8,91。一般认为
在一定范围内小会影响扩增条带的增减，即不会导致
扩增位点的增减，但对扩增产量有影响”“。浓度趟高，
扩增产物越多。但浓度低于该范围，由于分子荆l撞的
几率降低，偶然性大，扩增产物无或不稳定：浓度高
r该范刖会增加非专一性扩增产物的3’端(暂做，JI物)
会与原模板及第一次循环的扩增产物退火造成不同程
度的延伸。困模板浓度高，非々一睦产物足以形成背
景，这是高浓度模板造成弥散喇产物的原冈极端情
况下，dNTP消耗完．兀延伸反应，扩增产物链化，
电、泳后染色强度低，出现扩增效果羞的现象”j 奉实
验结果与此类似。
万方数据
2期 孛雪椎，等：孓遗植物桫椤RAPD分析中丰要反应参数的影响
RAPD扩增产物的质和量与Taq聚合酶的活力密
切相关，酶活力的有无、高低直接关系着扩增结果。
在RAPDf{f酶的用量一般为05～20U，Taq酶的活
力过高有小片段产生，过低则导致扩增条带太弱，模
板的纯化，Mg“浓度．反应温度都是通过影响酶活力
而-jI起扩增结果的差异。值得注意的足，在实验中发
现。不同公司的酶活性很币一样，且扩增冉柬的带的
差异较人：即使同、一公司订购的酶，有时不同批的酶
的活性也有较人改变，对实验结果会造成一定影响。
Mg“是Taq聚合酶的激活剂，其浓度的变化对结
果有重要影响，是很重要的一个影响因素，Mg“浓度
除影响酶活性外，也影响引物退火、模板与PCR产物
的解链温度、产物的特异性、引物■聚体的形成等。
Mg“浓度过低时，酶活力显著降低；过高时会导致非
特异性扩增产物的积累，背景模糊”I。浓度过高对酶
也有抑稍作用。另外．PCR混合物中的DNA模板、
引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg“结合，降低Mg“
实际浓度。而Taq聚合酶需要游离的Mg“口】。因此，
PCR中Mg“的加入量要比dNTP浓度高，有研究表明：
MgCl2最佳反应浓度(1．5～4．5mmol·L。)与各引物
有关，与GC／AT的比例无关(a2=0)，与DNA条带数
量也无显著差异(自2=o．13)””。因此，在实验中优化
Mg“浓度是保证RAPD稳定性和多态性的基础。
dNTP是反应中磷酸的主要来源。由于dNTP能
与Mg“结合而影响反应液中游离Mg“浓度，因此所
需最大激活Taq酶活性的精确Mg“浓度就取决于
dNTP浓度。如果dNTP浓度过低，合成产物的量就
少：如果dNTP浓度过高会竞争Mg“，Mg“不能有效
地激活Taq酶，使Taq酶无法正常完全发挥聚合作用。
RAPD指纹图谱与引物质量有关。ThOITfliⅡln等”⋯
在卜字花科植物的研究中发现：RAPD产物的强弱与
该产物在基因组中的拷贝数无真接关系，而与引物和
模板的同源性程度有关。RAPD反应能得到重复性可
靠的结果．这种重复可靠的引物与模板的良好匹配正
是我们利用RAPD筛选遗传标记的基础之一。若随机
引物与靶基因的同源性太低，那么扩增过程中的微小
变化(不同试剂来源及批次等)都会影响引物的复性
效率，导致条带不清．错配率高，重复性也不好。另
外，引物的浓度也比较重要，浓度过稀可能会龙扩增
带：引物过高则会出现非特异扩增产生模糊小片段和
引物二聚体。有人在研究真菌时发现，CrC含量高的
引物可以得到更多更稳定的分子标记。GC含量为
80％～100％的引物扩增出的片段数量是普通引物
(60％-一70％)的两倍之多9J。
复性温度决定PCR反应的特异性。引物复。H所需
的温度与时间取决于引物的碱基组成，长度和浓瞠。
在RAPD分析中扩增反应的引物·般是lo个碱基，
GC含量为60％～70％，与此相应的复性温度股为
35。C～37。C，这要比常规的复性温度低，我们试验把
复性温度提高到40C，发现扩增的效果不好。l；j蜀为
RAPD所用的引物很短，如果复性温度过高，引物勺模
板DKA亲和力太小筷至小能结合．扩增结果4：付，一
些弱带变为不清。
4结论
经过本实验的探索，发现桫椤RAPD扩增的塌佳体
系是(2．5X10。mL反应体积)：模板浓度为70ng，
M92+浓度为2．5mmol·L1．dNTP为0．2mmot·L1，
引物3>(10～mL。
最佳扩增程序为：94“C200s，一仑循环：94(60s，
36℃60s，72℃120s，40个循环：
72。C600s，一个循环：4。C保存。
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万方数据
孓遗植物桫椤RAPD分析中主要反应参数的影响
作者： 李雪雁， 王艇， 苏应娟
作者单位： 李雪雁(电子科技大学中山学院生物技术系,中山,528402)， 王艇,苏应娟(中山大学生命科
学院,广州,510275)
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGIC SCIENCE
年，卷(期)： 2003,22(2)
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