全 文 ：第 34卷 第 5期 生 态 科 学 34(5): 1622
2015 年 9 月 Ecological Science Sep. 2015
收稿日期: 2014-10-04; 修订日期: 2014-12-06
基金项目: 国家自然科学基金(31370470)
作者简介: 王文平(1989—), 女, 山东菏泽人, 硕士, 主要从事枝角类分子进化系统学, E-mail: yangguang1w2@163.com
*通信作者: 邓道贵, 男, 博士, 教授, 主要从事浮游生物生态学研究, E-mail: dengdg@263.net
王文平, 邓道贵, 张坤, 等. 基于16S rDNA和COI基因序列初步探究角壳网纹溞的分类地位[J]. 生态科学, 2015, 34(5): 1622.
WANG Wenping, DENG Daogui, ZHANG Kun, et al. Taxonomic status of Ceriodaphnia cornigera based on 16S rDNA and COI gene
[J]. Ecological Science, 2015, 34(5): 1622.
基于 16S rDNA 和 COI 基因序列初步探究角壳网纹溞
的分类地位
王文平, 邓道贵*, 张坤, 徐敏, 张晓莉, 刘飞
淮北师范大学生命科学学院, 资源植物生物学安徽省重点实验室, 淮北 235000
【摘要】 在安徽升金湖中首次发现了角壳网纹溞。利用特异性分子标记, 对角壳网纹溞的 16S rDNA 和 COI 基因进行
了 PCR 扩增和测序, 并进行了相关的分子遗传学分析。结果表明: 角壳网纹溞的 16S rDNA 和 COI 基因中 A+T 含量
均超过 60%, 明显高于 C+G 的含量。角壳网纹溞不仅在形态上与其他同属种类相差校大, 在分子进化中也与其他同属
种类的遗传距离相差较大。通过 K—2P 双参数模型计算, 角壳网纹溞 COI 基因的种间平均遗传距离高达 20%, 种间遗
传距离的范围为 16.7%—23.9%。因此, 结合其形态学和分子遗传学的特征暗示角壳网纹溞的进化地位应为网纹溞属中
一个相对独立的分支。
关键词：角壳网纹溞; 形态学; 分子标记; 系统进化
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2015.05.003 中图分类号：Q751 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2015)05-016-07
Taxonomic status of Ceriodaphnia cornigera based on 16S rDNA and COI
gene
WANG Wenping, DENG Daogui*, ZHANG Kun, XU Min, ZHANG Xiaoli, LIU Fei
School of Life Science, Huaibei Normal University, Anhui Key Laboratory of Resource and Plant Biology, Huaibei 235000,
China
Abstract: Ceriodaphnia cornigera was firstly discovered in Shengjin Lake in Anhui Province. The 16S rDNA and COI gene of C.
cornigera were amplified by PCR (Polymerase chain reaction) and sequenced. The results showed that the contents of A+T in both
16S rDNA and COI gene were above 60%, which was significantly higher than that of G+C. Compared with other Ceriodaphnia
species, C. cornigera showed notable differences in both the morphology and genetic distance. According to K-2P two-parameter
model, the average interspecific genetic distance of COI gene in C. cornigera was 20%, ranging from 16% to 23.9%. The
characteristic of morphology and molecular genetics suggested that C. cornigera may be a relatively independent branch in the
phylogeny of Ceriodaphnia genus.
Key words: Ceriodaphnia cornigera Chiang; morphology; molecular marker; phylogeny
1 前言
角壳网纹溞(Ceriodaphnia cornigera Chiang)隶
属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、
枝角目(Cladocera)、盘肠溞总科(Chydoroidea)、溞科
(Daphniidae)、网纹溞属(Ceriodaphnia)[1]。根据文献
5 期 王文平, 等. 基于 16S rDNA 和 COI 基因序列初步探究角壳网纹溞的分类地位 17
记载, 角壳网纹溞是我国特有种, 仅见于湖北省浠
水县望天湖, 一般出现在春季(4—6月)。外形与其
他网纹溞属种类相比差异较大 , 一般体长0.46—
0.52 mm, 靠近背缘中间有一个角状突起, 两侧有
2—3对角状突起。壳弧伸展成翼状的角突, 后角突
显著外凸[1]。关于角壳网纹溞的研究, 目前仅限于形
态学方面的描述。
关于浮游甲壳动物的分子系统进化的探究方法
日趋多样化[2–5], 16S rDNA是线粒体中的一个片段,
属于中性突变, 变异相对较慢。COI基因是线粒体
中细胞色素 c 氧化酶Ⅰ基因, 属于编码蛋白质基
因, 变异相对较快。16S rDNA和COI基因已被广泛应
用于甲壳纲动物的系统进化和分子鉴定[6–8]。目前,
对浮游甲壳动物的分子系统进化研究主要集中在溞
属[9–12]、裸腹溞属[13–15]等种类上[8], 而网纹溞属种类
的研究较少[3,16]。对角壳网纹溞的分子生物鉴定尚未
见报道。本文通过16S rDNA和COI基因分子标记探讨
角壳网纹溞的分类鉴定和系统进化的地位。本研究结
果填补了角壳网纹溞在分子生物学上的空白。
2 材料与方法
2.1 样品采集、鉴定和培养
使用彼得逊采泥器在安徽升金湖采集底泥中的
角壳网纹溞休眠卵。将休眠卵在实验室智能光照培
养箱中进行孵化, 对孵化出的角壳网纹溞个体进行
分类鉴定[1]。确定其为角壳网纹溞, 同时测得溞体体
长为 0.45—0.75 mm, 休眠卵的宽为 0.30—0.45 mm,
长为 0.45—0.63 mm。角壳网纹溞在智能光照培养箱
中用斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)培养, 培养温
度为(25±1) ℃、光照时间 L︰D=12 h︰12 h。
2.2 分子生物学的鉴定
实验时用吸管吸取单只成体溞种进行饥饿处理
图 1 角壳网纹溞的形态
Fig. 1 The morphology of Ceriodaphnia cornigera
一昼夜后用双蒸水冲洗, 放入 EP 管收集备用。
2.2.1 总 DNA 的提取
采用微量样品基因组 DNA 试剂盒(TIANamp
Micro DNA Kit)提取角壳网纹溞的总 DNA。角壳网
纹溞属于小型甲壳动物, 外被甲壳, 含几丁质不利
于蛋白酶 K 对其组织的消化。在提取 DNA 前首先
用烧钝灭菌的 10 μL 枪头对溞体进行均浆破碎, 这
样更有利于蛋白酶 K 对组织进行消化, 进而有利于
DNA 的提取。
2.2.2 PCR 扩增及序列测定
研究中分别对 4 个来自不同休眠卵的角壳网纹
溞个体进行总 DNA 的提取、PCR 扩增和测序, 并对
其进行遗传学分析。
用于扩增的 16S rDNA 基因引物[17]:
L2510 5 to 3(CGCCTGTTTAACAAAAACAT)
H3059 5 to 3(CCGGTCTGAACTCAGATCATGT)
用于扩增的 COI 基因引物[13]:
LCO1490 5’to 3’(GGTCAACAAATCATAAAG
ATATTGG)
HCO2198 5’to 3’(TAAACTTCAGGGTGACCA
AAAAATCA)
PCR 反应体系 25 μL, 每个反应体系内含 10×
LA-Taq Buffer 2.5 μLⅡ 、dNTP(2.5 mM)4.0 μL、Mg
离子(25 mM) 0.5 μL、模板 DNA(100 ngμL–1 左右)
1.0 μL、LA-Taq 酶(5 UμL–1)0.25 μL、上下游引物各
(10 μM) 1.0 μL, 双蒸水补足到 25 μL。
16S rDNA 扩增条件为 95 ℃预变性 3 min, 95 ℃
变性 45 s, 50 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 45 s, 共 35 个循
环, 72 10℃ min 充分延伸。
COI 基因扩增条件为 95 ℃预变性 1 min, 95 ℃
变性 40 s, 45 ℃退火 40 s, 72 ℃延伸 1 min, 共 35 个
循环, 72 5℃ min 充分延伸。
扩增产物经电泳检测后, 选择目的带清晰且明
亮的 PCR 反应产物送交生物工程公司(上海)纯化,
并测序。样品采用双向测序, 正反向对比后确定分
析用序列, 用DNAStar中的SeqMan比对, 并对比峰
图修除两端不可靠的碱基, 经人工校正后获得安徽
升金湖角壳网纹溞 16S rDNA 的 505 个有效碱基,
COI 基因的 680 个有效碱基。其它用于分析的序列从
GenBank 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)
上下载, 具体 16S rDNA 的序列编号见表 1, COI 基
因序列编号见表 2。
18 生 态 科 学 34 卷
表 1 网纹溞属 16S rDNA 序列的来源及编号
Tab. 1 Origin and number of 16S rDNA sequence of Ceriodaphnia species
GenBank 注册编号
物种 实验编号
16S rDNA
序列来源
Ceriodaphnia pulchella DQ858 DQ470585 GenBank
Ceriodaphnia cornuta-rigaudi complex sp. 6 PS-2012 KC320 KC154320 GenBank
Ceriodaphnia cornuta-rigaudi complex sp. 5 PS-2012 KC317 KC154317 GenBank
Ceriodaphnia cornuta-rigaudi complex sp. 4 PS-2012 KC315 KC154315 GenBank
Ceriodaphnia cornuta-rigaudi complex sp. 3 PS-2012 KC311 KC154311 GenBank
Ceriodaphnia cornuta-rigaudi complex sp. 2 PS-2012 KC308 KC154308 GenBank
Ceriodaphnia cornuta KC374 KC609374 GenBank
Ceriodaphnia sp. 7 PS-2012 KC344 KC154344 GenBank
Ceriodaphnia sp. 6 PS-2012 KC339 KC154339 GenBank
Ceriodaphnia sp. 2 PS-2012 KC328 KC154328 GenBank
Ceriodaphnia cornigera Chiang CC1 KP148260 This study
Ceriodaphnia cornigera Chiang CC2 This study
Ceriodaphnia cornigera Chiang CC3 This study
Ceriodaphnia cornigera Chiang CC4 This study
Bosmina sp. EU650743 EU650743 GenBank
表 2 网纹溞属 COI 基因序列的来源及编号
Tab. 2 Origin and number of List of COI gene sequence of Ceriodaphnia species
GenBank 注册编号
物种 实验编号
COI gene
序列来源
Ceriodaphnia cf. rigaudi KC861 KC616861 GenBank
Ceriodaphnia cf. rigaudi KC860 KC616860 GenBank
Ceriodaphnia cf. rigaudi KC855 KC616855 GenBank
Ceriodaphnia cf. rigaudi KC859 KC616859 GenBank
Ceriodaphnia cf. laticaudata BOLD: AAB5055 JN853.1 JN233853 GenBank
Ceriodaphnia cf. laticaudata BOLD: AAB5055 JN855.1 JN233855 GenBank
Ceriodaphnia sp. BOLD: AAB6934 EU104.1 EU702104 GenBank
Ceriodaphnia sp. BOLD: AAB6934 EU102.1 EU702102 GenBank
Ceriodaphnia sp. BOLD: AAB6934 EU099 EU702099 GenBank
Ceriodaphnia cf. reticulata BOLD: AAE9578 EU044 EU702044 GenBank
Ceriodaphnia sp. BOLD: AAB6934 EU086 EU702086 GenBank
Ceriodaphnia cf. reticulata BOLD: AAE9578 EU043 EU702043 GenBank
Ceriodaphnia cf. acanthina BOLD: AAI7121 EU030 EU702030 GenBank
Ceriodaphnia cf. acanthina BOLD: AAI7121 EU029 EU702029 GenBank
Ceriodaphnia cornigera Chiang CC1 KP148261 本文
Ceriodaphnia cornigera Chiang CC2 本文
Ceriodaphnia cornigera Chiang CC3 本文
Ceriodaphnia cornigera Chiang CC4 本文
Polyphemus pediculus JN233964 JN233964 GenBank
5 期 王文平, 等. 基于 16S rDNA 和 COI 基因序列初步探究角壳网纹溞的分类地位 19
2.3 系统进化关系分析
用DNAStar对双向测序所得碱基序列根据SeqMan
中的峰图比对进行校对, 去除不可靠碱基, 同时检
测出序列差异的百分比。使用 Clustalx 进行序列的
多重比对, DNAspV5 进行序列变异位点分析。利用
Mega4.1 计算序列中碱基间的转换数与颠换数以及
种间的遗传距离, 并构建相应的 NJ 系统进化树。本
研究采用 K—2P 双参数模型计算遗传距离, 同时选
择适宜外群构建进化树。此外使用 Mrbayes 构建系
统进化树, 替换模型(GTR 模型)参数设置为 nst=6,
位点变异速率设置为 invamma, 其他为参数为默认
值, 采用 mcmc 算法, 进行 100000 代的运算, 每 100
次取一次样, 最后舍去 25%的老化样本, 使用其余
的样本构建贝叶斯系统进化树。
3 结果
3.1 角壳网纹溞 16S rDNA 的序列分析
本研究通过测序得到的角壳网纹溞 16S rDNA
序列与来自 GenBank 的其他网纹溞属种类的序列进
行比对分析。在本研究所测定的 4 个个体中, 共发
现有三个不同的 16S rDNA 单倍型: CC1、CC2、
CC3(CC4 与 CC1 相似度为 100%)。在 DNAStar 中
将序列进行两两对比, 得出角壳网纹溞与其他网纹
溞属种类序列的平均种间相似度为 88.4%。通过
DNAspV5进行序列变异位点分析, 网纹溞属序列的
可识别位点为 469 个, 保守位点 352 个, 变异位点
117 个, 单一位点 31 个, 简约信息位点 86 个。此外
Mega 软件计算出平均转换数(si)与颠换数(sv)的比
值为 0.68, 颠换数明显高于转换数。研究序列中A+T
含量均明显高于 G+C 含量, 其 A+T 平均含量为
(68.3%), G+C 平均含量为(31.7%)。同时通过 K—2P
双模型法计算出两两的遗传距离(表 3)。以象鼻溞
(Bosmina sp.)为外群, 通过 Mega 软件构建 NJ 树。从
构建的 NJ 树(图 2)和 MrBayes 树来看, 两者的主要
分支基本一致。
3.2 角壳网纹溞 COI 基因的序列分析
本研究通过测序的角壳网纹溞 COI 基因序列与
来自 GenBank 的其他不同种的网纹溞属序列进行比
对分析。在本研究所测定的 4 个个体中得到两个不
同的 COI 基因单倍型: CC1、CC2(CC3 与 CC1 的序
列相似度为 100%, CC4 与 CC2 的序列相似度为
100%)。在 DNAStar 中进行序列的两两对比, 得出角
壳网纹溞与其他网纹溞属种类序列的平均种间相似
度为 82%。通过 DNAspV5 进行序列变异位点分析,
网纹溞属 COI 基因序列可识别位点为 612 个, 保守
位点 417 个, 变异位点 195 个, 单一位点 20 个, 简
约信息位点 175 个。COI 基因中的变异位点远多于
16S rDNA 中的变异位点。此外, Mega 软件计算的
平均转换数(si)与颠换数(sv)的比值为 1.17, 转换
数稍高于颠换数。序列中 A+T 含量均明显高于 G+
C 含量, 其 A+T 平均含量为(62.7%), G+C 平均含量
为(37.3%), 与 16S rDNA 的碱基含量特点相似, 符合
表 3 网纹溞属 16S rDNA 序列的遗传距离(对角线下)和序列相似度(对角线上)
Tab. 3 Genetic distances (below diagonal) and sequences similarity (above diagonal) of 16S rDNA of Ceriodaphnia species
KC308 CC1 CC2 CC3 KC311 KC315 KC317 KC320 KC328 KC339 KC344 KC374 DQ585
KC308 87% 87% 87% 94% 94% 90% 90% 88% 90% 88% 94% 87%
CC1 0.161 99% 99% 87% 88% 88% 87% 89% 90% 88% 88% 89%
CC2 0.161 0.001 99% 87% 88% 88% 87% 89% 90% 88% 88% 89%
CC3 0.161 0.001 0.001 87% 88% 88% 87% 89% 90% 88% 88% 89%
KC311 0.063 0.156 0.156 0.156 99% 91% 91% 88% 89% 88% 99% 88%
KC315 0.066 0.150 0.150 0.150 0.004 91% 91% 88% 90% 88% 99% 88%
KC317 0.112 0.124 0.124 0.124 0.109 0.109 97% 88% 88% 86% 91% 88%
KC320 0.107 0.127 0.127 0.127 0.109 0.109 0.020 89% 89% 87% 92% 89%
KC328 0.135 0.132 0.132 0.132 0.150 0.150 0.132 0.127 93% 90% 88% 90%
KC339 0.119 0.129 0.129 0.129 0.140 0.145 0.132 0.124 0.068 91% 90% 90%
KC344 0.145 0.137 0.137 0.137 0.150 0.156 0.145 0.145 0.119 0.105 88% 88%
KC374 0.063 0.153 0.153 0.153 0.002 0.002 0.107 0.107 0.148 0.142 0.153 88%
DQ585 0.175 0.073 0.73 0.073 0.164 0.164 0.140 0.132 0.134 0.129 0.148 0.161
20 生 态 科 学 34 卷
图 2 网纹溞属 16S rDNA 序列构建的系统进化树(NJ 树)
Fig. 2 NJ tree base on 16S rDNA sequences of Ceriodaphnia species
无脊椎动物 A、T 含量高的特点。同时通过 K—2P
双模型法计算出两两的遗传距离(表 4)。以虱形大眼
溞(Polyphemus pediculus)为外群, 通过 Mega 软件构
建NJ树。从构建的NJ树(图3)和MrBayes树来看, 两
者的主要分支基本一致。
4 讨论
网纹溞属在我国是分布较为广泛的一个类群,
但对其研究相对较少, 大多限于其生长生殖等方
面的研究[18–21]。角壳网纹溞是我国的特有种, 从形
表 4 网纹溞属 COI 基因序列的遗传距离(对角线下)和序列相似度(对角线上)
Tab. 4 Genetic distances (below diagonal) and sequences similarity (above diagonal) of COI genes of Ceriodaphnia species
EU 030 CC1 CC2
EU
043
EU
044
EU
086
EU
099
EU
104
EU
029
KC
855
KC
859
KC
860
KC
861
NJ
853
NJ
855
EU030 80% 80% 85% 85% 80% 81% 81% 99% 82% 83% 83% 83% 96% 96%
CC1 0.237 99% 81% 81% 84% 83% 84% 80% 84% 83% 83% 83% 80% 80%
CC2 0.239 0.002 81% 81% 84% 83% 84% 80% 84% 83% 83% 83% 80% 80%
EU043 0.160 0.216 0.214 99% 81% 80% 81% 85% 83% 84% 84% 84% 86% 85%
EU044 0.164 0.212 0.210 0.003 81% 79% 81% 85% 83% 83% 83% 83% 85% 85%
EU086 0.231 0.168 0.170 0.219 0.219 97% 99% 80% 84% 84% 84% 84% 80% 79%
EU099 0.226 0.189 0.191 0.231 0.235 0.025 98% 80% 83% 83% 84% 84% 80% 80%
EU104 0.224 0.170 0.172 0.213 0.217 0.008 0.020 81% 84% 84% 84% 84% 80% 80%
EU029 0.001 0.237 0.239 0.160 0.164 0.231 0.226 0.224 81% 83% 83% 83% 96% 96%
KC855 0.213 0.172 0.175 0.193 0.188 0.173 0.185 0.175 0.213 98% 98% 98% 82% 82%
KC859 0.197 0.183 0.185 0.184 0.186 0.175 0.183 0.172 0.197 0.013 99% 99% 83% 83%
KC860 0.193 0.187 0.190 0.184 0.186 0.179 0.179 0.168 0.193 0.017 0.003 100% 84% 83%
KC861 0.193 0.187 0.190 0.184 0.186 0.179 0.179 0.168 0.193 0.017 0.003 0.000 84% 83%
NJ853 0.037 0.232 0.235 0.160 0.164 0.233 0.224 0.226 0.037 0.203 0.188 0.184 0.184 98%
NJ855 0.039 0.228 0.230 0.162 0.164 0.238 0.224 0.231 0.039 0.213 0.197 0.192 0.192 0.012
5 期 王文平, 等. 基于 16S rDNA 和 COI 基因序列初步探究角壳网纹溞的分类地位 21
图 3 网纹溞属 COI 基因序列构建的系统进化树(NJ 树)
Fig. 3 NJ tree based on COI gene sequences of Ceriodaphnia species
态学上来看, 它与其他网纹溞属种类相差甚远[1]。
《中国动物志淡水枝角类》仅记载在湖北省浠水县
望天湖中发现存在角壳网纹溞。本研究首次在安徽
升金湖中也发现了角壳网纹溞, 两个湖泊同属于
长江水系。
本研究中的 4 个角壳网纹溞个体分别来自不同
的休眠卵, 得到的四个 16S rDNA 序列和四个 COI
基因序列的相似度均分别在 99%以上。基因序列分
析结果表明, 角壳网纹溞的 16S rDNA 和 COI 基因
中 A+T 含量均超过 60%, 明显高于 C+G 的含量, 这
与无脊椎动物 A、T 含量较高的特点相一致[22–23]。
16S rDNA在生物体进化过程中相对较为保守, 属于
中性进化[24–25], 而 COI 基因的变异相对较快, COI
基因的进化速度约是 16S rDNA 的 1.5 倍[26]。本研究
网纹溞属的 16S rDNA 序列中, 可识别位点 469 个,
变异位点 117 个, 变异率为 24.9%; 在网纹溞属的
COI 基因序列中, 可识别位点为 612 个, 变异位点
195 个, 变异率为 31.8%, COI 基因的变异率是 16S
rDNA 变异率的 1.28 倍, 与之相符。
本研究中 , 角壳网纹溞与其他网纹溞属种类
COI 基因的遗传距离相差较大, 种间平均遗传距离
高达 20%, 且种间遗传距离范围为 16.7%—23.9%,
与其他浮游甲壳动物相比, 并未超出属内种间遗传
距离的范围[26–27]。因此, 从形态学和分子遗传学的
角度来说角壳网纹溞应为网纹溞属中的一个比较独
立的分支。由于目前关于网纹溞属的相关研究较少,
远不及在溞属等其他溞科种类中的研究[12,16], 造成
网纹溞属的相关信息相对比较少, 不便于进行系统
的遗传进化分析, 本文仅就角壳网纹溞的分子鉴定
作了初步的探究, 为今后网纹溞属分子遗传学的进
一步研究提供基础依据。
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